跨膜絲氨酸蛋白酶2與肺腺癌和肺鱗癌預(yù)后的關(guān)系

鄧劍雄，鐘方炎，顧偉國，邱 峰

(南昌大學(xué)a.研究生院醫(yī)學(xué)部； b.第一附屬醫(yī)院腫瘤科，南昌 330006)

肺癌是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤[1]，其中80%以上為非小細(xì)胞肺癌，主要分為肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌[2]。盡管近年來非小細(xì)胞肺癌的診斷和治療策略在明顯的發(fā)展和進(jìn)步，如靶向藥和免疫檢查點(diǎn)抑制劑的使用，但非小細(xì)胞肺癌的生存預(yù)后仍不盡人意[3-4]。因此，探索更加有效的生物標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)尤為重要。

跨膜絲氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)是一種蛋白質(zhì)編碼基因，其編碼的蛋白屬于絲氨酸蛋白酶家族蛋白。在前列腺癌細(xì)胞中，TMPRSS2基因被雄激素所上調(diào)，其激活多種底物，如促肝細(xì)胞生長因子、蛋白酶活化受體2和間質(zhì)蛋白酶等，從而導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)破壞和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[5-7]。然而TMPRSS2在其他腫瘤中研究甚少，本文采用數(shù)據(jù)庫分析的方法探討TMPRSS2在肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其對(duì)患者預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 TMPRSS2的篩選

在Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/)分析TMPRSS2在多種腫瘤中mRNA的表達(dá)水平[8]。篩選條件為P-value：0.01；Gene rank：Top 10%；Fold change：2；Data type：mRNA。在GEPIA(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)數(shù)據(jù)庫[9]使用RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析TMPRSS2在肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中的mRNA表達(dá)情況。

1.2 TMPRSS2啟動(dòng)子甲基化水平的評(píng)估

UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)數(shù)據(jù)庫[10]是用于分析癌癥組學(xué)數(shù)據(jù)的綜合交互式網(wǎng)絡(luò)資源。UALCAN基于PERL-CGI構(gòu)建，可用于評(píng)估不同基因的甲基化水平。使用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析TMPRSS2在肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中的啟動(dòng)子甲基化水平，探討其差異表達(dá)的原因。

1.3 TMPRSS2表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系評(píng)估

Kaplan-Meier plotter(https://kmplot.com/)數(shù)據(jù)庫[11]包含21種腫瘤的生存數(shù)據(jù)。使用Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)對(duì)肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中TMPRSS2的表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。明確TMPRSS2在肺癌中的促進(jìn)或抑制作用。

1.4 TMPRSS2表達(dá)與免疫浸潤的相關(guān)性分析

通過TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)數(shù)據(jù)庫[12]評(píng)估在肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中TMPRSS2表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性，通過多因素Cox比例分析模型進(jìn)一步分析免疫細(xì)胞浸潤水平對(duì)預(yù)后的影響。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMPRSS2在人類腫瘤中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平

Oncomine數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，TMPRSS2在膀胱癌、浸潤性乳腺癌間質(zhì)中的mRNA表達(dá)水平顯著增高，在乳腺癌、結(jié)直腸癌、食管癌、胃癌、頭頸部癌、腎癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤和肉瘤中mRNA表達(dá)顯著下降(圖1A)。另外，基于TCGA數(shù)據(jù)庫中惡性腫瘤的RNA測序數(shù)據(jù)，進(jìn)一步研究了TMPRSS2在肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，相比正常組織TMPRSS2在肺腺癌和肺鱗癌的mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)(圖1B)。通過分析以上數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，相比正常組織TMPRSS2總體上在腫瘤中的呈現(xiàn)低表達(dá)，在肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中也是表達(dá)下降。

A:TMPRSS2在多種腫瘤中的表達(dá)(紅色為高表達(dá)，藍(lán)色為低表達(dá))；B:TMPRSS2在肺癌中的表達(dá)。*P<0.01。LUAD：肺腺癌;LUSC：肺鱗狀細(xì)胞癌。

2.2 TMPRSS2在肺癌中的啟動(dòng)子甲基化水平降低

UA2CAN數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，在TMPRSS2表達(dá)水平下降的肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中，相比正常組織的TMPRSS2啟動(dòng)子甲基化水平均顯著增高(P<0.05)，見圖2。

A：肺腺癌；B：肺鱗狀細(xì)胞癌。*P<0.001。

2.3 TMPRSS2高表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

肺腺癌中TMPRSS2高表達(dá)與較好的生存顯著相關(guān)(HR=0.49,95%CI0.39～0.63;P=3.9×10-9)，而在肺鱗狀細(xì)胞癌中TMPRSS2表達(dá)水平與預(yù)后無顯著相關(guān)性(HR=1.15,95%CI0.89～1.48;P=0.28)，見圖3。

t/月 t/月

2.4 TMPRSS2表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性分析

TMPRSS2的表達(dá)與免疫浸潤水平的相關(guān)性分析顯示，在肺腺癌中TMPRSS2的表達(dá)與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞呈陽性相關(guān)(圖4A)；在肺鱗狀細(xì)胞癌中TMPRSS2與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞均呈陽性相關(guān)，并與腫瘤純度呈負(fù)相關(guān)(圖4B)。

A:肺腺癌;B:肺鱗狀細(xì)胞癌。

2.5 免疫細(xì)胞浸潤水平對(duì)預(yù)后的影響

TMPRSS2的表達(dá)水平與腫瘤中部分的免疫細(xì)胞浸潤存在相關(guān)性，因此進(jìn)一步分析免疫細(xì)胞浸潤水平對(duì)預(yù)后的影響。多因素Cox比例分析模型分析結(jié)果顯示，在肺腺癌中，B細(xì)胞高浸潤水平和TMPRSS2高表達(dá)與較好的預(yù)后有關(guān)，而CD4+T細(xì)胞的高浸潤水平與較差的預(yù)后有關(guān)(圖5A)。而肺鱗狀細(xì)胞癌中相關(guān)免疫細(xì)胞浸潤水平對(duì)預(yù)后無顯著影響(圖5B)。

A:肺腺癌;B:肺鱗狀細(xì)胞癌。

3 討論

TMPRSS2是一種雄激素反應(yīng)性絲氨酸蛋白酶，可裂解SARS-CoV-2的刺突蛋白，促進(jìn)病毒進(jìn)入和激活[13]。它在肺外的許多組織中表達(dá)，并因其在前列腺上皮細(xì)胞中的主要表達(dá)和在前列腺癌發(fā)生中的重要作用而廣為人知[6-7]。癌癥已被確定為COVID19的危險(xiǎn)因素，并且肺癌為最常見類型[14]。然而尚未有TMPRSS2在肺癌中的系統(tǒng)分析，因此本文對(duì)TMPRSS2在肺癌中的表達(dá)和預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了分析。

本研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中，TMPRSS2的轉(zhuǎn)錄水平相比正常肺組織均顯著下降(P<0.05)，為探索TMPRSS2表達(dá)下降的原因，對(duì)其在肺癌中的甲基化水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，TMPRSS2的啟動(dòng)子甲基化水平均呈現(xiàn)顯著的增高(P<0.05)。啟動(dòng)子區(qū)域的高水平甲基化可使基因的轉(zhuǎn)錄過程沉默[15]，因此在肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中TMPRSS2啟動(dòng)子的甲基化高水平可能導(dǎo)致了其轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平下降。

另外，高表達(dá)的TMPRSS2與肺腺癌患者的較好預(yù)后相關(guān)(HR=0.49,95%CI0.39～0.63;P=3.9×10-9)，TMPRSS2可能在肺腺癌中扮演抑癌基因的角色。進(jìn)一步對(duì)腫瘤免疫細(xì)胞浸潤情況分析發(fā)現(xiàn)，肺腺癌中TMPRSS2的表達(dá)水平與B細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的浸潤水平正相關(guān)(P<0.05)，并且免疫微環(huán)境中的B細(xì)胞的浸潤水平增高與肺腺癌的較好預(yù)后相關(guān)，而CD4+T細(xì)胞恰好相反。研究表明，腫瘤浸潤B細(xì)胞可通過分泌腫瘤特異性抗原，促進(jìn)T細(xì)胞的反應(yīng)從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[16]。而CD4+T細(xì)胞的兩個(gè)亞群，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和輔助性T細(xì)胞17(Th17)可通過免疫抑制和促炎的機(jī)制促進(jìn)肺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[17]。腫瘤微環(huán)境和腫瘤組織間復(fù)雜的相互作用，調(diào)節(jié)著腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的過程[18]。根據(jù)本研究結(jié)果，TMPRSS2的表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)B細(xì)胞的腫瘤浸潤水平，從而延長肺腺癌患者的生存時(shí)間。

總之，TMPRSS2在肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)均顯著下降，TMPRSS2的表達(dá)水平可能通過免疫細(xì)胞的浸潤水平影響肺腺癌患者的預(yù)后。本研究僅為生物信息學(xué)分析，有必要進(jìn)行進(jìn)一步的功能和臨床驗(yàn)證。