子癇前期相關(guān)miR-23b-5p靶基因的預(yù)測及生物信息學(xué)分析

涂成城，陶 峰，儲(chǔ) 斌，陳紅波

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院婦產(chǎn)科，合肥 230001)

子癇前期是一種妊娠特異性疾病，嚴(yán)重影響母嬰健康，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒死亡的第二大原因[1]。子癇前期是一種多因素、多機(jī)制及多通路致病的疾病，現(xiàn)公認(rèn)為其病理起源于胎盤，但其具體機(jī)制仍未闡明[2-3]。自2007年P(guān)INELES等首次公開證明子癇前期及正常孕婦胎盤組織中存在差異表達(dá)的miRNA以來，更多學(xué)者開始關(guān)注并研究差異表達(dá)的miRNA在子癇前期發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控作用[4-5]。

miRNA是一類天然存在的小型非編碼RNA,其可在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參與如組織發(fā)育、分化、增殖、維持穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞凋亡等生命活動(dòng)的各個(gè)方面[6]。目前的研究[7]顯示，miRNA與子癇前期的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，調(diào)節(jié)常見的諸如滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)等信號(hào)通路。

有學(xué)者[8]對子癇前期及正常對照組胎盤臍血miRNA表達(dá)譜進(jìn)行高通量測序分析，發(fā)現(xiàn)子癇前期組miR-23b-5p相較于正常對照組表達(dá)顯著下降，并推測miR-23b-5p可能參與了子癇前期的發(fā)病過程。本研究在既往研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用在線預(yù)測網(wǎng)站對子癇前期患者血清差異表達(dá)miR-23b-5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測，并對預(yù)測的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對重點(diǎn)靶基因進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研，為后續(xù)對miR-23b-5p靶基因的驗(yàn)證及子癇前期病因?qū)W的研究提供理論基礎(chǔ)及思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)篩選及靶基因的預(yù)測分析

GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是一個(gè)存儲(chǔ)各種高通量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的公共存儲(chǔ)庫。從中選擇子癇前期胎盤臍血差異表達(dá)的芯片數(shù)據(jù)集GSE119799。利用在線軟件GEO2R分析差異表達(dá)miRNA，以FC<0.67或>1.5、P<0.05為閾值篩選差異miRNA。分別利用3個(gè)靶基因預(yù)測網(wǎng)站miRDB(http://www.mirdb.org/)、TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)、RNA22-HAS(https://cm.jefferson.edu/rna22/)預(yù)測選中的靶基因，并用韋恩圖繪制3個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因的交集。

1.2 預(yù)測靶基因的GO功能注釋及KEGG富集分析

使用富集分析網(wǎng)站DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)對預(yù)測靶基因的交集進(jìn)行Gene Ontology功能富集分析(GO分析)。GO分析包括3個(gè)本體，分別為生物學(xué)過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)及細(xì)胞組成(cellular component,CC)，均利用超幾何分布檢驗(yàn)，得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的前10個(gè)GO注釋分析(P<0.05)。隨后用DAVID網(wǎng)站對交集靶基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的前10個(gè)信號(hào)通路(P<0.05)。

1.3 預(yù)測靶基因的蛋白互作分析

STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/cgi/input.pl)是可進(jìn)行功能性蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)在線分析網(wǎng)站。利用STRING數(shù)據(jù)庫對預(yù)測的交集靶基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析。通過Cytoscape 3.6.1軟件Cyto Hubba插件中常用的EPC算法，獲取鏈接度最高的前20位基因，并對其關(guān)鍵基因進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研。

2 結(jié)果

2.1 芯片數(shù)據(jù)及差異表達(dá)miRNA的篩選

GSE119799芯片數(shù)據(jù)是由雅典大學(xué)醫(yī)學(xué)院采用GPL18573芯片平臺(tái)完成，數(shù)據(jù)為子癇前期及正常對照組的胎盤臍血各5例，隨后利用qRT-PCR對2組胎盤臍血各17例中差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果顯示miR-23b-5p及miR-99b-5p表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。見表1。

表1 篩選的差異表達(dá)miRNA

2.2 miRNA靶基因的預(yù)測

分別選擇miRDB、TargetScan及RNA22-HAS在線數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站對miR-23b-5p及miR-99b-5p進(jìn)行靶基因的預(yù)測，并對上述結(jié)果繪制韋恩圖(圖1)取交集。結(jié)果顯示miR-23b-5p在3個(gè)預(yù)測軟件分析的交集靶基因共計(jì)222個(gè)，miR-99b-5p交集靶基因僅為1個(gè)。故選擇miR-23b-5p的交集靶基因進(jìn)行后續(xù)分析。

圖1 miR-23b-5p(左)及miR-99b-5p(右)預(yù)測靶基因韋恩圖

2.3 miR-23b-5p預(yù)測交集靶基因的GO功能注釋分析

對miR-23b-5p所預(yù)測的222個(gè)交集靶基因進(jìn)行GO功能分析，發(fā)現(xiàn)miR-23b-5p的靶基因主要富集于膜外、空泡及內(nèi)涵體等10個(gè)細(xì)胞成分(P<0.05，圖2)；參與干細(xì)胞分化的調(diào)控、胞質(zhì)翻譯負(fù)性調(diào)節(jié)及對凋亡信號(hào)的正調(diào)節(jié)等10個(gè)生物學(xué)過程(P<0.05，圖3)；顯著富集于翻譯調(diào)節(jié)活性、金屬離子結(jié)合及金屬內(nèi)肽酶活性等10個(gè)分子功能(P<0.05，圖4)。

圖2 miR-23b-5p靶基因細(xì)胞成分的GO功能分析

圖3 miR-23b-5p靶基因生物學(xué)過程的GO功能分析

圖4 miR-23b-5p靶基因分子功能的GO功能分析

2.4 miR-23b-5p預(yù)測交集靶基因的KEGG信號(hào)通路富集分析

利用富集分析網(wǎng)站DAVID對交集靶基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，其中82個(gè)靶基因具有相關(guān)的信號(hào)通路。miR-23b-5p的靶基因在代謝途徑、蛋白多糖在癌癥中的作用及MAPK信號(hào)通路等10個(gè)信號(hào)通路中顯著富集(圖5)。

圖5 miR-23b-5p靶基因KEGG信號(hào)通路富集分析

2.5 miR-23b-5p預(yù)測靶基因的蛋白質(zhì)互作分析前20位關(guān)鍵基因

利用STRING網(wǎng)站，對預(yù)測的交集靶基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析。使用Cytoscape 3.6.1軟件的Cyto Hubba插件的EPC算法，獲取鏈接度最高的前20位基因，顯示TLR4為鏈接度最高的關(guān)鍵基因(Hub)，見圖6。

圖6 miR-23b-5p預(yù)測靶基因蛋白互作分析前20位Hub基因

3 討論

隨著二胎政策的開放及高齡產(chǎn)婦的增加，子癇前期的發(fā)病率也隨之居高不下。關(guān)于其臨床干預(yù)方案尚未取得令人滿意的效果，亦無獨(dú)立可靠的早期預(yù)測子癇前期的方法。已有大量的研究[9-11]表明，子癇前期患者胎盤及血清中可檢測到多種與正常產(chǎn)婦差異表達(dá)的miRNA。其中一些miRNA已被證明能夠通過參與靶基因的調(diào)控來影響子癇前期的發(fā)生及發(fā)展。因而研究這些差異表達(dá)的miRNA及其靶基因能夠更好地揭示子癇前期的發(fā)病機(jī)制[12]。生物信息學(xué)在miRNA靶基因的預(yù)測和分析等研究中發(fā)揮了重要作用[13]。

本研究利用miRDB、TargetScan及RNA22-HAS軟件分別進(jìn)行了靶基因的預(yù)測，共取得222個(gè)miR-23b-5p的交集靶基因。并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了GO功能注釋及KEGG富集分析。結(jié)果顯示其靶基因存在于細(xì)胞的各個(gè)組分中，參與了干細(xì)胞分化的調(diào)控、胞質(zhì)翻譯負(fù)性調(diào)節(jié)及對凋亡信號(hào)的正調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程；并顯著富集于MAPK信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路及鈣信號(hào)通路等。其GO功能注釋及KEGG富集分析結(jié)果可為miR-23b-5p的研究提供參考。

目前，miR-23b-5p的研究多集中于腫瘤學(xué)領(lǐng)域，眾多研究[14-16]發(fā)現(xiàn)其在腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲過程中起著重要的調(diào)控作用(表2)。根據(jù)GAMMILL等[17]提出的子癇前期發(fā)病機(jī)制的二元論假說，子癇前期的機(jī)制研究也大多集中于血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力的改變中。而本研究中所預(yù)測的多個(gè)靶基因及其信號(hào)通路已被證明與細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲力的改變有著密切聯(lián)系。

表2 miR-23b-5p調(diào)控靶基因及參與信號(hào)通路的研究現(xiàn)狀

Toll樣受體4(TLR4)不僅是miR-23b-5p鏈接度最高的Hub基因，也是目前國內(nèi)外子癇前期相關(guān)研究的熱點(diǎn)。母胎界面的免疫平衡對于維持成功的妊娠至關(guān)重要，妊娠期間免疫系統(tǒng)的異常反應(yīng)也會(huì)增加子癇前期的風(fēng)險(xiǎn)[18]。TLR4在母胎界面免疫系統(tǒng)的激活中起著重要作用[19]。有研究[20]顯示，TLR4在子癇前期孕婦胎盤及滋養(yǎng)層細(xì)胞中的表達(dá)異常增加，暗示著子癇前期的發(fā)生與TLR4介導(dǎo)的炎癥免疫反應(yīng)有密切聯(lián)系。同時(shí)，F(xiàn)AN等[21]研究證實(shí)TLR4/p38 MAPK信號(hào)通路的激活可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡并破壞其侵襲力。陳曉妮等[22]研究提示硫酸鎂可能通過下調(diào)TLR4及其mRNA的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)重度子癇前期的治療作用。

Hippp信號(hào)通路被證明是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物中、參與胚胎發(fā)育及腫瘤形成的重要通路，其可通過控制細(xì)胞的增殖與凋亡來維持組織動(dòng)態(tài)平衡。通過miRNA抑制Hippo信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的發(fā)生及過度生長[16]。Hippo信號(hào)通路的核心是一系列的激酶級聯(lián)反應(yīng)，STK3、STK4是其上游調(diào)控因子，最終可使YAP1磷酸化失活無法進(jìn)入細(xì)胞核從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。有研究[6]提示，miR-23b-5p的下調(diào)可作用于STK4-YAP信號(hào)通路抑制胰腺癌的生長。子癇前期胎盤組織中YAP mRNA及其轉(zhuǎn)錄蛋白的水平顯著降低，且YAP的下調(diào)可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力[23]。SKT3是本研究預(yù)測的交集靶基因之一。在子癇前期滋養(yǎng)細(xì)胞中，下調(diào)的miR-23b-5p可能通過SKT3-YAP信號(hào)通路來抑制其侵襲，造成胎盤淺著床。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是參與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的一類進(jìn)化性保守的通路，NKD1是其負(fù)向調(diào)控因子之一。NKD1已被證明在浸潤性乳腺癌組織中低表達(dá)，β-catenin在癌組織中高表達(dá)。同時(shí)也有研究提示，子癇前期患者胎盤Wnt/β-catenin信號(hào)通路被抑制，造成胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲力降低，導(dǎo)致了子癇前期的發(fā)生[24]。NKD1作為miR-23b-5p預(yù)測的靶基因，極有可能通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲過程。

子癇前期中胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加，凋亡級聯(lián)核心蛋白caspase-3表達(dá)明顯上調(diào)[25]。ZHAO等[26]研究發(fā)現(xiàn)caspase-3調(diào)控的凋亡信號(hào)通路是血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡的主要作用機(jī)制。TRAIL是caspase-3的上游調(diào)控因子，能夠活化下游的caspase-3，從而啟動(dòng)凋亡過程。miR-23b-5p下調(diào)可能導(dǎo)致其靶基因TRAIL在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，同時(shí)通過caspase-3途徑啟動(dòng)了內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

4 結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)的方法對miR-23b-5p預(yù)測靶基因交集進(jìn)行GO功能、KEGG信號(hào)通路富集分析及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果顯示miR-23b-5p鏈接度最高的Hub基因TRL4與子癇前期的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，說明miR-23b-5p參與子癇前期發(fā)病機(jī)制調(diào)控的可能性極大。miR-23b-5p的其他關(guān)鍵靶基因與腫瘤細(xì)胞的侵襲關(guān)系密切，提示其在與腫瘤細(xì)胞具有相似生物學(xué)功能的滋養(yǎng)細(xì)胞中也極有可能發(fā)揮著重要的作用。本研究的結(jié)果與現(xiàn)有對miR-23b-5p的調(diào)控作用的研究報(bào)道基本一致，說明生物信息學(xué)分析在探索生物機(jī)理方面具有可靠性。這些有關(guān)miR-23b-5p分析結(jié)果能夠?yàn)楹罄m(xù)靶基因的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供理論依據(jù)及研究思路。