非編碼RNA的m6A修飾及其在腫瘤中的研究進(jìn)展

胡濱濱 張明

表觀遺傳學(xué)是通過調(diào)節(jié)RNA的穩(wěn)定性和折疊模式來描述RNA修飾對基因表達(dá)的影響，以及由此對RNA-蛋白質(zhì)相互作用的影響。盡管尚未確定表觀遺傳學(xué)的全部范圍，但通常將其定義為化學(xué)修飾，主要包括DNA和RNA修飾、組蛋白修飾和染色質(zhì)重排等［1］。目前在體內(nèi)已經(jīng)鑒定出100多種RNA修飾，常見的包括m5C（5-methylcytidine）［2］，m1A（N1-methyladenosine）［3-4］和 N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）［5］。其中，m6A是真核生物mRNA、長鏈非編碼RNA（lncRNA）和 microRNA（miRNA）最常見的修飾之一［6］。RNA m6A修飾是可逆的，由甲基轉(zhuǎn)移酶（編碼器）催化形成，同時通過負(fù)責(zé)脫甲基酶（擦碼器）發(fā)生去甲基化，最終被讀取蛋白（讀碼器）識別。m6A修飾主要發(fā)生在 2個略有不同的共有基序：RRACH［7-8］和DRACH［9］（D=G、A或U；R=G或A；H=C、A或U）。目前越來越多研究表明，m6A修飾在RNA穩(wěn)定性［10］、mRNA翻譯［11-12］、二級結(jié)構(gòu)形成（mRNA和lncRNA）［13］、選擇性剪接和聚腺苷酸化［14］以及亞細(xì)胞RNA定位［15］等方面發(fā)揮重要作用。ncRNAs在人類中占98.5%，提示其在生物進(jìn)化過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能［16］。多種類型的非編碼RNA（ncRNA）、小干擾RNA（siRNAs）和PIWI相互作用的RNAs（piRNAs）在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用也被報道［17-18］。重要的是，ncRNA在體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，因此成為腫瘤診斷、預(yù)后預(yù)測和臨床治療的潛在生物標(biāo)志物。但是目前有關(guān)RNA m6A甲基化的研究主要集中于mRNA，ncRNA研究還較少。本文就ncRNA的m6A修飾及其在腫瘤中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 RNA m6A甲基化修飾

1974年，首次在純化的poly（A）RNA部分中發(fā)現(xiàn)m6A修飾［8］。然而，由于缺乏m6A的定位方法，該研究受到阻礙。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是在大規(guī)模高通量測序出現(xiàn)之后，如抗體拉動的m6A橫截面高通量測序，也稱為m6A-seq或MeRIP-seq（m6A特異性甲基化RNA免疫沉淀與下一代測序結(jié)合），m6A定位應(yīng)用取得了可喜突破［5，19］。m6A修飾調(diào)節(jié)因子包括m6A修飾甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基轉(zhuǎn)移酶和閱讀蛋白。越來越多的證據(jù)表明，m6A甲基化修飾與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移以及血管生成密切相關(guān)。

m6A甲基化過程（圖1）涉及3個關(guān)鍵組成部分：“編碼器”、“擦碼器”和“讀碼器”［20］，它們可以分別添加、移除或識別m6A甲基化位點，從而改變重要的生物學(xué)功能。m6A催化復(fù)合物“編碼器”包含METTL3、METTL14、KIAA1429、WTAP的異二聚體復(fù)合物和METTL16的同二聚體復(fù)合物。m6A“擦碼器”主要包括兩種去甲基化酶：ALKBH5和FTO。另一種去甲基化酶ALKBH3與ALKBH5相似，已被證明具有1-甲基腺嘌呤（m1A）和3-甲基胞嘧啶的去甲基化酶活性［21］。此外，有研究指出m6A甲基化也是ALKBH3的底物。值得注意的是，ALKBH3對RNA具有特殊的底物偏好，其僅靶向tRNA中的m6A修飾，而不是mRNA或rRNA中的m6A［22］。m6A“讀碼器”由人類YTH結(jié)構(gòu)域家族YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3以及人類YTH結(jié)構(gòu)域包含YTHDC1、YTHDC2和異質(zhì)核核糖核蛋白（HNRNP）蛋白質(zhì)組成［23］?！熬幋a器”和“擦碼器”共同決定m6A修飾在RNA上的分布，而“讀碼器”則介導(dǎo)m6A依賴的RNA代謝和功能調(diào)節(jié)。它們在整個基因組的表達(dá)中起重要的調(diào)節(jié)作用，對正常的生理功能或病理疾病均具有重要影響。

圖1 m6A甲基化過程Fig.1 m6A methylation process

2 ncRNA的m6A修飾在腫瘤中的作用

ncRNA根據(jù)其長度可分為兩類：第一類是少于200個核苷酸的ncRNA，如miRNA、小核RNA（snRNA），其中長度約20個核苷酸的miRNA是已知最小的ncRNA；第二類是具有超過200個核苷酸的ncRNA，甚至達(dá)數(shù)千個核苷酸的ncRNA，例如lncRNA、環(huán)狀RNA（circRNA）。目前研究認(rèn)為，在癌細(xì)胞中，m6A修飾可以調(diào)節(jié)lncRNA的穩(wěn)定性或其表達(dá)水平。m6A修飾也可以影響miRNA的成熟，反過來miRNA也可以靶向作用于m6A甲基化調(diào)節(jié)因子。至于circRNA，m6A通過circRNA調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，而m6A修飾也可以穩(wěn)定circRNA。

2.1 m6A修飾與miRNA的相互作用

miRNA是長度為20～40個核苷酸的ncRNA，可以結(jié)合靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）以調(diào)節(jié)基因表達(dá)［24］。miRNA成熟涉及3個步驟：第一是轉(zhuǎn)錄，其中miRNA在細(xì)胞核中加工形成pri-miRNA。第二是在DGCR8和Drosha幫助下，將pri-miRNA轉(zhuǎn)化為pre-miRNA。第三是將pre-miRNA輸出到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)一步處理。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA被Dicer切割成成熟的miRNA［25］。2002年，有研究第一次報道了惡性腫瘤中的miRNA，即在慢性淋巴細(xì)胞白血病中發(fā)現(xiàn)miR-15和miR-16組成的一簇miRNAs失調(diào)［26］。據(jù)報道，m6A修飾在mRNAs中富集于5'UTRs、終止密碼子附近和3'UTRs的近端區(qū)域［19］。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)miRNAs靶向位點也位于3'UTRs的5'端和3'端，結(jié)合位點的相似性表明mRNA甲基化與miRNAs存在相互作用［27］。BERULAVA等［28］報道大部分miRNA含有m6A，敲低m6A去甲基化酶FTO可能影響miRNA的穩(wěn)態(tài)水平。目前認(rèn)為m6A修飾主要通過兩種途徑影響miRNA的合成和功能：⑴m6A修飾通過促進(jìn)miRNA過程和成熟影響腫瘤發(fā)展；⑵miRNA可以靶向作用于m6A甲基化調(diào)節(jié)劑分子。

2.1.1 m6A修飾促進(jìn)miRNA過程和成熟 如上所述，在 DGCR8和 Drosha的幫助下，pri-miRNA 轉(zhuǎn)化為pre-miRNA。具有 m6A 標(biāo)記的 pri-miRNA 能被hnRNPA2B1識別，且能與DGCR8相互作用并促進(jìn)miRNA加工［29］。ALARCóN等［30］研究發(fā)現(xiàn)，METTL3可以使pri-miRNA發(fā)生甲基化，從而標(biāo)記pri-miRNA而被DGCR8識別和處理。在肝細(xì)胞癌研究中發(fā)現(xiàn)，METTL14與DGCR8相互作用，并以m6A依賴性方式正調(diào)節(jié)初級miRNA 126過程［31］。在結(jié)腸癌中，PENG等［32］研究證實METTL3可以甲基化pri-miR-1246，從而進(jìn)一步促進(jìn)pri-miR-1246的成熟；通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，抑癌基因SPRED2為miR-1246下游靶標(biāo)，其中下調(diào)SPRED2能進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)MAPK途徑的抑制。在胰腺癌中，METTL3高表達(dá)可以增加pri-miR-25的m6A修飾，并誘導(dǎo)成熟miR-25過表達(dá)，而成熟的miR-25能抑制其靶基因PHLPP2表達(dá)，從而激活A(yù)KT信號通路并促進(jìn)癌癥發(fā)生和發(fā)展［33］。綜上可知，m6A甲基化修飾可以作用于miRNA的成熟進(jìn)程，進(jìn)而調(diào)節(jié)miR-NA的水平，影響腫瘤發(fā)展。

2.1.2 miRNA靶向作用于m6A甲基化調(diào)節(jié)劑分子 miRNA也可以調(diào)節(jié)m6A甲基化調(diào)節(jié)劑分子以促進(jìn)癌癥進(jìn)展。m6A修飾通常富集在3'UTR［34］。因此，m6A可能與3'UTR上的miRNA結(jié)合位點重疊。CUI等［35］發(fā)現(xiàn)METTL3為miR-186的直接靶標(biāo)，miR-186/MET-TL3軸通過Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)肝母細(xì)胞瘤進(jìn)展。在肝細(xì)胞癌中，YANG等［36］發(fā)現(xiàn)microRNA-145通過靶向m6A結(jié)合YTHDF2蛋白的3'UTR mRNA區(qū)域而調(diào)節(jié)m6A水平。也有研究報道m(xù)iR-33a通過靶向調(diào)控METTL3 mRNA影響非小細(xì)胞肺癌增殖，而miR-33a被證明能直接與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中METTL3 mRNA的3'UTR結(jié)合［37］。此外，在乳腺癌中，miRNA let-7g可能作為腫瘤抑制因子，通過靶向作用METTL3 mRNA的3'UTR抑制腫瘤發(fā)生［38］。

2.2 m6A對lncRNA的影響

lncRNA廣泛參與多種細(xì)胞過程，包括通過表觀遺傳調(diào)控的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控［39-40］。此外，越來越多的證據(jù)表明lncRNAs在多種疾病尤其在癌癥發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用［41］。m6A對mRNA和lncRNA具有廣泛的修飾，在功能上調(diào)節(jié)真核轉(zhuǎn)錄組，影響RNA剪接、輸出、定位、翻譯和穩(wěn)定性［9］。XIST是首批功能注釋的lncRNA之一，通過募集多種因子在X染色體滅活中發(fā)揮關(guān)鍵作用［42］，目前已被發(fā)現(xiàn)可能是肺癌［43］、卵巢癌［44］、肝癌［45］和結(jié)直腸癌［46］等實體瘤的致癌基因。

2.2.1 m6A調(diào)節(jié)lncRNA表達(dá) 在結(jié)腸癌中，YANG等［47］發(fā)現(xiàn)敲低METTL14基本上可以消除XIST的m6A水平并增強XIST表達(dá)，此外m6A甲基化修飾的XIST能被YTHDF2識別，從而介導(dǎo)XIST降解。在肝癌中，METTL3介導(dǎo)的m6A修飾通過增強其穩(wěn)定性，促進(jìn)癌癥進(jìn)展，從而導(dǎo)致linc00958上調(diào)［48］。METTL3也可以通過提高其RNA轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性，使linc00958上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展［49］。另有研究報道，METTL3可以通過增加結(jié)腸癌細(xì)胞核的積累上調(diào)lncRNA RP11表達(dá)［50］。還有研究報道，作為“擦碼器”的ALKBH5可以通過去甲基化調(diào)節(jié)lncRNA KCNK15-AS1的表達(dá)，從而抑制胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲［51］。在骨肉瘤中，ALKBH5通過上調(diào)lncRNA PVT1促進(jìn)細(xì)胞增殖［52］。ALKBH5也能通過去甲基化上調(diào)lncRNA NEAT1表達(dá)，而且lncRNA NEAT1過表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良相關(guān)［53］。此外，“讀碼器”YTHDF2 介導(dǎo)的lncRNA FENDRR降解可以提高SOX4在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖［54］。由此可見，m6A甲基化調(diào)節(jié)劑分子可調(diào)節(jié)lncRNA表達(dá)水平，而這些lncRNA表達(dá)水平的改變可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

2.2.2 m6A調(diào)控lncRNAs穩(wěn)定性 有研究報道METTL3可以提高m6A甲基化修飾水平，也可以增強lncRNA ABHD11-AS1轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性以增加其表達(dá)，而METTL3過度表達(dá)則與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)［55］。FAM225A作為致癌lncRNA，可以促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。在機制上，F(xiàn)AM225A作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）起作用，可以擴增miR-590-3p和miR-1275，導(dǎo)致ITGB3上調(diào)，以及激活FAK/PI3K/Akt信號傳導(dǎo)從而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖和侵襲［56］。WANG等［57］證明m6A修飾可以通過減少RNA降解來改善RHPN1-AS1甲基化轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性，而這導(dǎo)致上皮性卵巢癌中的RHPN1-AS1表達(dá)上調(diào)，且RHPN1-AS1高表達(dá)與上皮性卵巢癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)；體外和體內(nèi)功能實驗也顯示RHPN1-AS1促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。該研究作用機制可能是RHPN1-AS1作為miR-596的ceRNA，從而增加LETM1的表達(dá)并激活FAK/PI3K/Akt信號通路。在宮頸癌中，ALKBH5可以降低GAS5 m6A修飾水平而增加其穩(wěn)定性［58］，同時還發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)m6A介導(dǎo)的GAS5 RNA降解依賴于m6A讀取蛋白YTHDF2途徑。以上研究結(jié)果說明，在腫瘤中，m6A甲基化修飾水平的改變可以調(diào)節(jié)lncRNAs穩(wěn)定性，這些lncRNAs穩(wěn)定性的改變同樣影響了腫瘤的進(jìn)程。

2.3 circRNA m6A在癌癥中的作用

circRNA是繼miRNA和lncRNA之后ncRNA領(lǐng)域又一個新的研究熱點。與具有5'帽和3'尾結(jié)構(gòu)的線性RNA不同，circRNA具有獨特的環(huán)狀共價閉合結(jié)構(gòu)［59］，因此可以保護它們免受核酸外切酶損害。既往研究顯示，circRNA能參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、蛋白質(zhì)翻譯、基因表達(dá)調(diào)控，也可以作為 miRNA“海綿”［60］。m6A修飾也發(fā)生在circRNAs中，但是circRNA中的m6A富集模式不同于mRNA［61］。m6A修飾發(fā)生在circRNA中，主要通過募集起始因子eIF4G2和m6A“閱讀器”YTHDF3促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯［62］。

2.3.1 m6A修飾的circRNAs穩(wěn)定mRNA m6A修飾在FTO和METTL3/14復(fù)合物調(diào)控的circRNAs中尤其 豐富［63］。WU 等［64］報道 circ-KIAA1429通過m6A-YTHDF3-Zeb1加速肝細(xì)胞癌進(jìn)展。CHEN等［65］發(fā)現(xiàn)了circNSUN2的 m6A修飾證據(jù)，circNSUN2的m6A修飾可以促進(jìn)circNSUN2向細(xì)胞質(zhì)輸出。在細(xì)胞質(zhì)中，circNSUN2通過形成circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2-RNA-蛋白三元復(fù)合物，增強HMGA2 mRNA穩(wěn)定性，促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展；circNSUN2和HMGA2表達(dá)上調(diào)在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移組織中也比在原發(fā)性結(jié)腸癌組織中更為普遍。這些發(fā)現(xiàn)闡明了circNSUN2的m6A修飾可調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)輸出并穩(wěn)定HMGA2以促進(jìn)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移，說明m6A修飾也可以存在于circRNA中，而且circRNA可以通過m6A修飾調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展。

2.3.2 m6A甲基化修飾穩(wěn)定circRNA CHEN等［66］研究發(fā)現(xiàn)，circ0000069在宮頸癌細(xì)胞和組織中上調(diào)，m6A修飾可以維持circ0000069的穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移。但是目前對m6A修飾的circRNAs認(rèn)識還有限，m6A修飾的circRNAs在腫瘤中的調(diào)控機制及其生物學(xué)功能尚未明確，仍需進(jìn)一步探索其作為腫瘤診斷生物標(biāo)志物和治療靶點的可能性。

3 小結(jié)

m6A在腫瘤中的修飾研究揭示了腫瘤中一個新的表觀遺傳調(diào)控層，為腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制研究提供了新的見解。目前認(rèn)為m6A調(diào)控因子可以通過多種機制調(diào)控ncRNA，包括促進(jìn)pri-miRNA的加工成熟、穩(wěn)定circRNA、甚至通過調(diào)節(jié)lncRNAs與蛋白質(zhì)之間的相互作用。反過來，miRNA和lncRNA也可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中m6A的水平。例如miRNAs可以靶向m6A調(diào)節(jié)因子的相應(yīng)mRNA以沉默它們的表達(dá)，從而改變癌細(xì)胞中m6A的水平。lncRNAs還可能參與維持m6A相關(guān)蛋白的穩(wěn)定性。circRNA不僅可以被m6A修飾，還可以通過與m6A修飾的蛋白質(zhì)結(jié)合而調(diào)控m6A修飾過程。因此，值得深入探索m6A修飾如何影響ncRNAs的產(chǎn)生、細(xì)胞定位、功能，以及這些過程與癌癥的關(guān)系。

m6A修飾的ncRNA也已被發(fā)現(xiàn)能調(diào)控基因表達(dá)，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能，包括增殖、轉(zhuǎn)移、干細(xì)胞分化和穩(wěn)態(tài)，因此m6A修飾與ncRNA的結(jié)合為探索腫瘤基因表達(dá)的調(diào)控機制提供了新的方向，有可能作為癌癥指標(biāo)和治療干預(yù)的靶點。然而盡管m6A調(diào)控ncRNA的研究方法不斷完善，未來也還有較多問題需要解決。例如，與mRNA不同，ncRNAs不能通過poly（A）富集，意味著難以獲得純的lncRNAs或circRNAs。還有，m6A修飾是動態(tài)過程，可由多個因素調(diào)節(jié)，因此m6A位點高通量序列的結(jié)果不穩(wěn)定且難以重復(fù)。此外，m6A甲基化與ncRNA之間的特異性結(jié)合位點也有待進(jìn)一步研究。同一基因轉(zhuǎn)錄的ncRNA和m6A調(diào)控因子能否通過正反饋或負(fù)反饋環(huán)相互作用而調(diào)控下游靶基因也是值得研究的熱點；而進(jìn)一步探索ncRNA與m6A修飾的交叉調(diào)控，也有助于發(fā)現(xiàn)癌癥診斷和治療的關(guān)鍵靶點，從而助力個性化醫(yī)療目標(biāo)的實現(xiàn)。