LncRNA PRNCR1靶向miR-653-5p調控鼻咽癌細胞惡性生物學行為

趙黎陽 崔玲 張穎 王玲 李會政

鼻咽癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿，且病情進展迅速，極大威脅人類生命健康［1-2］。目前，鼻咽癌的發(fā)病機制尚未明了。研究表明，鼻咽癌發(fā)生發(fā)展可能與原癌基因激活及抑癌基因失活有關［3］。因此，尋找影響鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的基因分子，可能為鼻咽癌的治療提供分子靶點。前列腺癌非編碼RNA 1（prostate cancer non-coding RNA 1，PRNCRl）是一種前列腺癌相關基因，屬于長鏈非編碼RNA（lncRNA）家族成員。研究表明，PRNCRl可能通過調控雄性激素受體參與前列腺癌的發(fā)生，同時在舌鱗癌［4］、非小細胞肺癌［5］和乳腺癌［6］等腫瘤中呈高表達，并通過促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，阻礙細胞凋亡，進而促進腫瘤發(fā)展進程。有研究報道，PRNCR1在鼻咽癌組織中呈高表達［7］，但其對鼻咽癌細胞惡性表型的影響尚未見報道。lncRNA可通過競爭性結合微小RNA（miRNA）進而調控miRNA靶基因表達，參與調控腫瘤細胞惡性表型［8-10］。研究顯示，miR-653-5p在胃癌［11］和宮頸癌［12］等腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用，上調其表達可阻礙腫瘤發(fā)展進程。本課題組通過Starbase靶基因軟件預測顯示，PRNCR1可能靶向結合miR-653-5p。在此基礎上，本研究進一步檢測鼻咽癌細胞系中PRNCR1和miR-653-5p的表達，探討PRNCR1/miR-653-5p軸對鼻咽癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要試劑

鼻咽癌細胞系（5-8F、6-10B、C666-1）購自中國科學院上海細胞庫；鼻咽上皮細胞NP69購自上海弘順生物科技有限公司；RNA抽屜試劑盒、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清（FBS）購自浙江天杭生物科技有限公司；LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；PCR引物、PRNCR1小干擾RNA（si-PRNCR1）、亂序無意義陰性序列（si-NC）、miR-653-5p模擬物（miR-653-5p mimics）、模擬對照序列（miR-NC）、PRNCR1野生型質粒（WT-PRNCR1）及突變型質粒（MUT-PRNCR1）、miR-653-5p抑制劑（anti-miR-653-5p）及其陰性序列（anti-miR-NC）均由上海吉瑪制藥技術公司設計并合成。

1.2 細胞培養(yǎng)

鼻咽癌細胞系（5-8F、6-10B、C666-1）和鼻咽上皮細胞NP69復蘇后，分別加入含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，轉移至25 cm2培養(yǎng)瓶，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長密度約為80%時，換液，取對數生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 細胞轉染及分組

將對數生長期的6-10B細胞按1.0×105/孔接種至6孔板中，按照LipofectamineTM2000脂質體法分別轉染si-NC（si-NC組）、si-PRNCR1（si-PRNCR1組）、miR-NC（miR-NC組）、miR-653-5p mimics（miR-653-5p組），以及共轉染si-PRNCR1與anti-miR-NC（si-PRNCR1+anti-miR-NC 組）、si-PRNCR1 與 anti-miR-653-5p（si-PRN-CR1+anti-miR-653-5p組）。轉染12 h后，更換含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。RT-qPCR法驗證轉染效果，并收集細胞備用。

1.4 RT-qPCR檢測PRNCR1和miR-653-5p的表達水平

采用RNA抽屜試劑提取各細胞中的總RNA，逆轉錄生成cDNA后，進行PCR擴增。PCR反應體系共20 μL，包括10 μL SYBRPremixEx Taq（Tli RNaseH Plus）（2×）、0.4 μL上游引物（10 μmol/L）、0.4 μL下游引物（10 μmol/L）、2.0 μL cDNA 模板和 7.2 μL DEPC。擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)。引物序列：PRNCR1上游引物為5'-GAAGAGCGTGTCTTGG-3'，下游引物為 5'-CCTG-GCTTTCCTGGTTC-3'；miR-653-5p上游引物為5'-TT-GAAACATTCTCTACTGAAC-3'，下游引物為5'-GAA-CATGTCTGCGTATCTC-3'；GAPDH 上游引物為 5'-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3'，下游引物為 5'-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3'；U6上游引物為5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。以GAPDH和U6分別作為PRNCR1和miR-653-5p的內參，采用2?△△Ct法計算目的基因的相對表達量。實驗重復3次。

1.5 CCK-8法檢測細胞的增殖能力

將各組細胞接種至96孔板中（2.5×104/孔），分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h后，用酶標儀檢測波長在450 nm處的光密度（OD）值。OD值越大，說明細胞增殖能力越強。實驗重復3次。

1.6 流式細胞術檢測細胞的凋亡情況

將各組細胞接種至6孔板中（1.0×105/孔），培養(yǎng)48 h后，收集細胞。用500 μL結合緩沖液重懸細胞，添加10 μL Annexin V-FITC，避光孵育10 min；再加入5 μL PI，避光孵育5 min后，上流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。實驗重復3次。

1.7 劃痕實驗檢測細胞的遷移能力

將各組細胞接種至6孔板中（1.0×105/孔），培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)基。用200 μL移液器槍頭在培養(yǎng)板底部平行于中軸線劃兩條平行線，并用PBS洗去劃痕間細胞，測量劃痕間距（d），記為d0h。更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，再次測量細胞間距d，記為d24h，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=［（d0h?d24h）/d0h］×100%。實驗重復3次。

1.8 Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力

將Transwell小室置于24孔板中，鋪Matrigel基質膠，自然晾干。將各組細胞接種至Transwell上室（5.0×104/孔），另取500 μL培養(yǎng)基加至下室。培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)基，用多聚甲醛固定、結晶紫染色，在倒置顯微鏡下觀察基質膠下層細胞，隨機取5個視野計數侵襲細胞數。實驗重復3次。

1.9 雙熒光素酶報告基因實驗驗證PRNCR1和miR-653-5p的靶向關系

將對數期6-10B細胞接種至6孔板中（1.0×105/孔），按照LipofectamineTM2000脂質體法分別共轉染miR-653-5pmimics與WT-PRNCR1、miR-NC與WT-PRNCR1、miR-653-5p mimics與MUT-PRNCR1、miR-NC與MUT-PRNCR1，轉染12 h后，更換為含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞并裂解，3 500 r/min離心5 min后，取上清，用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，結果以螢火蟲熒光強度與海腎熒光強度的比值表示。實驗重復3次。

1.10 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步的兩兩比較用Tukey檢驗。以雙側P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PRNCR1和miR-653-5p在鼻咽癌細胞系中的表達

RT-qPCR檢測結果顯示，鼻咽癌細胞系（5-8F、6-10B、C666-1）中PRNCR1的表達水平均高于鼻咽上皮細胞NP69（t=15.273、30.857、32.750，均P<0.001），而 miR-653-5p的表達水平則低于NP69細胞（t=5.000、48.000、33.000，均P<0.001），且均在 6-10B細胞中表達差異最明顯，故選擇6-10B細胞進行后續(xù)實驗。見圖1。

圖1 鼻咽癌細胞系中PRNCR1和miR-653-5p的表達Fig.1 The expression of PRNCR1 and miR-653-5p in nasopharyngeal carcinoma cell lines

2.2 敲減PRNCR1對鼻咽癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

RT-qPCR檢測結果顯示，轉染si-PRNCR1后鼻咽癌6-10B細胞中PRNCR1的表達水平低于轉染si-NC的6-10B細胞（0.26±0.06vs1.00±0.00，t=37.000，P<0.001），表明敲減PRNCR1的6-10B細胞構建成功，見圖2A。

CCK-8法和流式細胞術檢測結果顯示，si-PRNCR1組中6-10B細胞的OD值較si-NC組降低（t48h=9.025，P<0.001；t72h=12.083，P<0.001），而凋亡率高于si-NC組［（23.81±3.62）%vs（5.45±0.89）%，t=14.775，P<0.001］，見圖2B～C。劃痕實驗和Transwell法檢測結果顯示，si-PRNCR1組6-10B細胞劃痕愈合率和侵襲細胞數均低于si-NC組［（32.02±1.71）%vs（74.10±0.72）%，t=68.039，P<0.001；（53.89±6.05）個vs（124.44±10.55）個，t=17.403，P<0.001］，見圖2D～E。表明敲減PRNCR1可阻礙鼻咽癌6-10B細胞增殖、遷移、侵襲，并促進其凋亡。

圖2 敲減PRNCR1對6-10B細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響Fig.2 The effect of knocking down PRNCR1 on the proliferation,apoptosis,migration and invasion of 6-10B cells

2.3 過表達miR-653-5p對鼻咽癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

RT-qPCR檢測結果顯示，轉染miR-653-5p mimics的鼻咽癌6-10B細胞中miR-653-5p表達水平高于轉染 miR-NC 的 6-10B 細 胞（2.83±0.06vs1.00±0.00，t=91.500，P<0.001），表明過表達miR-653-5p的6-10B細胞構建成功，見圖3A。

CCK-8法和流式細胞術檢測結果顯示，miR-653-5p組中6-10B細胞的OD值低于miR-NC組（t48h=17.047，P<0.001；t72h=14.341，P<0.001），而凋亡率高于 miR-NC 組［（32.32±6.21）%vs（4.78±1.00）%，t=13.135，P<0.001），見圖3B～C。劃痕和Transwell實驗檢測結果顯示，miR-653-5p組6-10B細胞劃痕愈合率、侵襲細胞數低于miR-NC組［（28.22±1.62）%vs（73.50±0.84）%，t=74.440，P<0.001；（45.67±4.90）個vs（122.22±13.26）個，t=16.245，P<0.001］，見圖3D～E。表明過表達miR-653-5p可抑制鼻咽癌6-10B細胞增殖、遷移、侵襲，促進細胞凋亡。

圖3 過表達miR-653-5p對6-10B細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響Fig.3 The effect of overexpression of miR-653-5p on the proliferation,apoptosis,migration and invasion of 6-10B cells

2.4 PRNCR1靶向負調控miR-653-5p表達

Starbase靶基因軟件預測顯示，PRNCR1與miR-653-5p的核苷酸序列存在結合位點，見圖4A。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，共轉染miR-653-5p mimics與WT-PRNCR1的6-10B細胞熒光素酶活性低于共轉染 miR-NC與 WT-PRNCR1的 6-10B細胞（0.24±0.02vs1.00±0.03，t=63.236，P<0.001），而共轉染miR-653-5p mimics與MUT-PRNCR1的6-10B細胞熒光素酶活性與共轉染miR-NC與MUT-PRNCR1的6-10B細胞比較差異無統(tǒng)計學意義（0.99±0.04vs1.00±0.04，t=0.530，P=0.603），見圖4B。RT-qPCR檢測結果顯示，si-PRNCR1組6-10B細胞中PRNCR1表達低于si-NC組（0.27±0.07vs1.00±0.00，t=31.286，P<0.001），而miR-653-5p 表達高于 si-NC 組（2.61±0.09vs1.00±0.00，t=53.667，P<0.001），見圖4C。表明PRNCR1可靶向負調控miR-653-5p。

圖4 PRNCR1靶向負調控miR-653-5p的表達Fig.4 PRNCR1 targeted and negatively regulated the expression of miR-653-5p

2.5 敲減miR-653-5p可逆轉敲減PRNCR1對鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用及凋亡促進作用

RT-qPCR檢測結果顯示，si-PRNCR1+anti-miR-653-5p組6-10B細胞中miR-653-5p的表達水平低于si-PRNCR1+anti-miR-NC 組（1.35±0.08vs2.68±0.11，t=29.335，P<0.001），見圖5A。

CCK-8法和流式細胞術檢測結果顯示，si-PRNCR1+anti-miR-653-5p組6-10B細胞OD值高于si-PRNCR1+anti-miR-NC 組（t48h=18.284，P<0.001；t72h=14.341，P<0.001），而凋亡率低于 si-PRNCR1+anti-miR-NC 組［（10.63±1.43）%vs（22.76±7.24）%，t=4.931，P<0.001］，見圖5B～C。劃痕和Transwell實驗檢測結果顯示，si-PRNCR1+anti-miR-653-5p組 6-10B細胞劃痕愈合率、侵襲細胞數均高于 si-PRNCR1+anti-miR-NC 組［（62.30±1.02）%vs（31.50±1.47）%，t=51.643，P<0.001；（94.56±11.28）個vs（54.22±5.85）個，t=9.524，P<0.001］，見圖5D～E。表明敲減miR-653-5p可逆轉敲減PRNCR1對鼻咽癌6-10B細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用及凋亡促進作用。

圖5 敲減miR-653-5p可逆轉敲減PRNCR1對6-10B細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響Fig.5 Knocking down miR-653-5p reversed the effect of knocking down of PRNCR1 on the proliferation,apoptosis,migration and invasion of 6-10B cells

3 討論

lncRNA在真核生物中廣泛存在，目前研究認為其異常表達與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關［13-15］。已有研究表明，多種lncRNA在鼻咽癌中異常表達并參與其發(fā)展進程，可能是鼻咽癌治療的潛在分子靶點。例如，lncRNA FAM225A通過與miR-590-3p和miR-1275結合，上調ITGB3表達，進而促進鼻咽癌發(fā)生和轉移［16］；lncRNA GAS5在鼻咽癌中表達上調，下調其表達可通過靶向miR-4465/COX2軸抑制細胞增殖并促進細胞凋亡［17］；而敲低lncRNA FOXD3-AS1可通過改變miR-135a-5p的表達調節(jié)鼻咽癌細胞的生長和凋亡［18］。PRNCRl作為lncRNA家族的一員，已有研究表明其在舌鱗癌［4］、非小細胞肺癌［5］和乳腺癌［6］等腫瘤中具有促癌作用。在鼻咽癌中，有研究發(fā)現PRNCR1呈高表達，且與腫瘤臨床分期、T分級和淋巴結轉移等臨床病理特征密切相關，可作為鼻咽癌預后不良的生物標志物［7］。本研究亦發(fā)現，PRNCR1在鼻咽癌細胞系中高表達，而敲減PRNCR1表達可抑制鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡，提示PRNCR1在鼻咽癌中可能作為促癌基因發(fā)揮作用，可能是鼻咽癌治療的分子靶點。

為進一步研究PRNCR1促進鼻咽癌細胞惡性表型的分子機制，本研究通過Starbase靶基因軟件及雙熒光素酶報告基因實驗證實PRNCR1可靶向結合并負調控miR-653-5p的表達，這與鼻咽癌細胞系中敲減PRNCR1而miR-653-5p表達升高的結果一致。研究顯示，circ-RAD23B可通過靶向抑制miR-653-5p進而上調TIAM1表達促進非小細胞肺癌細胞侵襲，其中miR-653-5p在非小細胞肺癌中起抑癌基因作用［19］；黑色素瘤中AFAP1-AS1呈高表達，其通過靶向負調控miR-653-5p并促進RAI14的表達增強體外黑色素瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力及體內腫瘤生長［20］。本研究結果顯示，過表達miR-653-5p可有效阻礙鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲，且促進細胞凋亡；體外細胞功能實驗表明，敲減miR-653-5p可逆轉敲減PRNCR1對鼻咽癌細胞惡性表型的抑制作用，進一步提示PRNCR1可能通過靶向負調控miR-653-5p促進鼻咽癌細胞的惡性生物學行為。

綜上，鼻咽癌細胞系中PRNCR1呈高表達而miR-653-5p呈低表達；敲減PRNCR1表達能阻礙鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲，且加速細胞凋亡，其作用機制可能與靶向負調控miR-653-5p有關，PRNCR1/miR-653-5p軸可能為鼻咽癌的治療提供新的分子靶點。但PRNCR1/miR-653-5p軸對鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的確切作用仍需進一步在體內驗證，miR-653-5p下游靶基因及信號通路亦有待深入研究。