谷子粒黑穗病菌PCR 檢測體系的建立

郝雅萍，焦思薇，郭二虎，儀慧蘭

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太原 030031；2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030006；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)谷子研究所，山西長治 046000）

谷子（Setaria italica）是一種重要的禾本科作物，在我國有8 000 多年的栽培歷史，屬山西省優(yōu)勢雜糧作物。隨著谷子種植面積的不斷擴(kuò)大，多種病害時(shí)有發(fā)生[1]，谷子黑穗病在我國的主要產(chǎn)區(qū)均有不同程度的發(fā)生，其中，谷子粒黑穗病是最常見的，其致病菌為粒黑穗病菌（Ustilago crameri）[2]。病菌孢子隨谷種播種進(jìn)入土壤，隨后孢子萌發(fā)侵染幼苗，在植株體內(nèi)蔓延，最終危害谷子穗部。被病菌侵染的籽粒因病原菌冬孢子大量形成變?yōu)楹诜?，黑粉外包?jiān)韌的灰白色膜，有一定機(jī)械強(qiáng)度。當(dāng)谷子收獲脫?；蚪?jīng)風(fēng)吹摩擦?xí)r，籽粒破裂散出黑粉污染種子，來年隨種子播種進(jìn)入谷田。目前對(duì)谷子黑穗病的控制主要靠農(nóng)藥[3]，而抗病品種的使用才是解決問題的根本。

針對(duì)不同地域病原菌生理小種的差異[4]，對(duì)抗病品種的常規(guī)篩選主要是應(yīng)用形態(tài)學(xué)鑒定，通過對(duì)相同種植條件下不同品種谷子植株的感病特性進(jìn)行分析比較，由發(fā)病率和發(fā)病程度判斷品種對(duì)病原菌小種的敏感或抗性[5-6]，該過程比較費(fèi)時(shí)，不利于控制病害的傳播。因此，尋找一種快速、靈敏、有效的方法來檢測不同品種的抗病性是十分重要的。

近年來，研究人員應(yīng)用PCR 技術(shù)檢測植株組織中的病原菌DNA 來判斷病原菌對(duì)植株的侵染特征，該過程操作簡便、特異性強(qiáng)、快速、經(jīng)濟(jì)[7]。目前已建立了針對(duì)玉米和高粱的絲黑穗病[8-9]、小麥白粉病和散黑穗病[10-11]、甘蔗黑穗病[12]等的PCR 檢測技術(shù)。用PCR 技術(shù)檢測特定植物病原菌主要靠引物的有效性，引物設(shè)計(jì)用到的基因序列有：真菌核糖體脫氧核糖核酸（rDNA）及間隔區(qū)，如基因間區(qū)（Intergenic spacer，IGS）、核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）等[13-14]；未知的特異DNA 片段；保守的蛋白基因序列。但到目前為止，應(yīng)用PCR 方法檢測谷子粒黑穗病菌的研究未見報(bào)道。

本研究根據(jù)黑穗病菌ITS 序列設(shè)計(jì)PCR 引物，建立了谷子粒黑穗病菌的快速檢測體系，并證明所用引物和PCR 檢測體系在鑒定病菌感染和植株抗病性方面具有較高的特異性，可快速、準(zhǔn)確地監(jiān)測谷子粒黑穗病，并為提前預(yù)防谷子粒黑穗病提供特異性高、實(shí)用性強(qiáng)的技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

谷子粒黑穗病菌（Ustilago crameri）冬孢子、谷瘟病菌（Pyricularia setariae）菌絲，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)谷子研究所郭二虎研究員提供；谷子白發(fā)病菌（Sclerospora graminicola）孢子、玉米黑粉菌孢子采自大田發(fā)病植株。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料準(zhǔn)備 取谷子粒黑穗病菌冬孢子粉過0.297 mm 篩，用于谷種拌菌。選用對(duì)黑穗病抗性不同的谷子品種晉谷21 和長農(nóng)35，設(shè)谷種拌菌組與不拌菌對(duì)照組，同期播種于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)谷子研究所試驗(yàn)田。每個(gè)處理播種3 個(gè)小區(qū)作為重復(fù)，每個(gè)小區(qū)面積30 m2，拌菌組與對(duì)照組間設(shè)置隔離帶。在谷子拔節(jié)期與抽穗期，每小區(qū)隨機(jī)選3 個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)隨機(jī)選取生長一致的5 株植株，采集拌菌組與對(duì)照組植株各5 株，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2.2 病原菌和谷子DNA 的提取 稱取一定量的病原菌孢子粉或谷子葉片/穗梗于研缽中，加少許石英砂，加入CTAB 提取液[15-16]，充分研磨，勻漿液轉(zhuǎn)入離心管中于65 ℃水浴50 min，10 000 r/min 離心10 min，取上清加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1（V/V）），10 000 r/min 離心10 min。取上清，加入RNase A，37 ℃水浴40 min。加入等體積的預(yù)冷異丙醇，12 000 r/min 離心15 min，沉淀用75%乙醇漂洗，溶于TE。用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA分子的完整性，測OD260和OD280值檢測提取物的濃度和純度。

1.2.3 谷子粒黑穗病菌DNA 的序列分析 以真菌ITS 的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）為擴(kuò)增引物，以谷子粒黑穗病菌DNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)合格后送華大基因有限公司測序，測序結(jié)果用Blast 進(jìn)行分析，并用Clustal X，MEGA 5.0 獲得系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 谷子粒黑穗病菌特異性引物設(shè)計(jì) 將菌株Ustilago avenae（登錄號(hào)AY740062.1）、Ustilago hordei（登錄號(hào)AY740068.1）、Ustilago maydis （登錄號(hào)AY345004.1）、Ustilago nuda（登錄號(hào)AY740069.1）的rDNA-ITS 序列與谷子黑穗病菌ITS 序列進(jìn)行比對(duì)，選擇與谷子黑穗病菌ITS 序列相似度高的菌株的ITS 序列，利用生物學(xué)軟件Clustal X 進(jìn)行比對(duì)分析，運(yùn)用軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)谷子粒黑穗病菌特異性引物，其中，上游引物F1序列為5′-AGAC GGGTTTACCACTCAAC-3′，下游引物R1序列為5′-AAGCCACGGTGAATGGCAAAG-3′，由生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.5 引物特異性及靈敏度檢測 分別以谷子黑穗病菌孢子、谷子白發(fā)病菌孢子、谷瘟病菌菌絲、玉米黑粉菌孢子及對(duì)照組谷子葉片的基因組DNA 作為PCR 擴(kuò)增模板，用自行設(shè)計(jì)的谷子粒黑穗病菌ITS 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20 μL，包括：10×Buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，引物各0.4 μL，DNA模板量0.4～1.0 μL，Taq 酶0.2 μL，余量用雙蒸水補(bǔ)足。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將谷子粒黑穗病菌基因組DNA 濃度分別調(diào)整為100、10、1 ng/μL、100、10、1、0.1 pg/μL，作為PCR擴(kuò)增模板，采用上述引物和條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 大田谷子植株粒黑穗病菌侵染性檢測 以谷種拌菌組和不拌菌對(duì)照組谷子的旗葉和穗梗的基因組DNA 作為PCR 擴(kuò)增模板，用谷子粒黑穗病菌ITS 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，若出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶則說明谷子特定組織被黑穗病菌侵染。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子粒黑穗病菌ITS 序列特征分析

將提取的谷子粒黑穗病菌冬孢子DNA 進(jìn)行ITS-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果在GeneBank 中進(jìn)行Blast 檢索分析，構(gòu)建Neighbour Joining 分子發(fā)育樹。結(jié)果顯示（圖1），粒黑穗病菌孢子ITS 序列長度在700 bp 左右，與GeneBank 數(shù)據(jù)庫中的谷子粒黑穗病原菌（AY344999.1 Ustilago crameri）的序列同源性為95%，系統(tǒng)發(fā)育樹中聚在一支。說明本研究從田間發(fā)病谷穗得到的病原菌為谷子粒黑穗病菌。

2.2 引物特異性與靈敏度檢測

用自行設(shè)計(jì)的谷子粒黑穗病菌引物對(duì)不同供試樣品基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析發(fā)現(xiàn)，僅谷子粒黑穗病菌基因組DNA 作模板時(shí)能擴(kuò)增出1 條特異性條帶，大小與目標(biāo)片段（320 bp）基本一致，其他供試菌株及對(duì)照組谷子葉片沒有擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的引物對(duì)谷子粒黑穗病菌具有特異性（圖2）。

采用相同的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序，測試粒黑穗病菌基因組DNA 模板量對(duì)擴(kuò)增的影響，結(jié)果表明（圖3），模板質(zhì)量濃度為100、10、1 ng/μL 以及100、10 pg/μL時(shí)均可獲得清晰的目標(biāo)條帶，模板量為1、0.1 pg/μL 時(shí)，PCR 擴(kuò)增未能得到目標(biāo)條帶。因此，本研究建立的PCR 檢測體系在粒黑穗病菌基因組DNA 質(zhì)量濃度為10 pg/μL 時(shí)能夠檢出。

2.3 PCR 檢測大田谷子植株中的病原菌結(jié)果

以谷子穗梗和旗葉頂端組織基因組DNA 作模板，用自行設(shè)計(jì)的谷子粒黑穗病菌引物進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以未拌菌對(duì)照組谷子穗梗和旗葉基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳未檢出擴(kuò)增產(chǎn)物；以拌菌發(fā)病植株穗梗和旗葉的基因組DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增檢出了谷子粒黑穗病菌的特異性序列（圖4）。

以拌菌未發(fā)病植株穗梗和旗葉基因組DNA 為模板，用特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果表明（圖5），晉谷21 的5 株植株中有1 株的穗梗及旗葉中擴(kuò)增出特異性條帶，有1 株旗葉中擴(kuò)增出條帶、穗梗中未擴(kuò)增出條帶，其余3 株的穗梗和旗葉中均沒有擴(kuò)增產(chǎn)物；長農(nóng)35 有4 株的穗梗和旗葉中檢測出特異性條帶，1 株穗梗和旗葉中均沒有檢出擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，長農(nóng)35 拌菌組植株中黑穗病菌檢出率高于晉谷21，該結(jié)果與2 個(gè)品種的黑穗病發(fā)病率[6]相一致。

3 結(jié)論與討論

谷子粒黑穗病是一種真菌性病害，黑穗病發(fā)生的嚴(yán)重程度取決于谷子品種的抗病性和環(huán)境條件。本研究根據(jù)谷子粒黑穗病菌ITS 序列，設(shè)計(jì)了1 對(duì)引物F1/R1，應(yīng)用該引物對(duì)谷子粒黑穗病菌、白發(fā)病菌、谷瘟病菌和玉米黑粉菌基因組DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，只有谷子粒黑穗病菌擴(kuò)增出1 條特異性條帶，說明這對(duì)引物對(duì)谷子粒黑穗病菌是特異的，且檢測到的黑穗病菌基因組DNA 的最低質(zhì)量濃度為10 pg/μL。對(duì)谷種拌菌組植株的檢測結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的特異性引物在鑒定植株抗病性方面具有較高的特異性。

朱桂清等[11]用真菌rDNA 非編碼區(qū)ITS1 的通用引物設(shè)計(jì)了特異性引物，對(duì)小麥散黑穗病菌進(jìn)行了PCR 檢測；程穎慧等[17]根據(jù)ITS 片段設(shè)計(jì)引物檢測小麥腥黑穗病菌，并用于與黑麥腥黑粉菌的區(qū)分。商蓓等[18]應(yīng)用真菌rDNA 的ITS 序列設(shè)計(jì)了對(duì)蘋果黑星病菌有高度特異性的引物，可檢測到蘋果黑星病菌基因組DNA 濃度是100 fg/μL；王楠等[19]研究設(shè)計(jì)的谷子銹病菌IGS 序列特異性引物，利用巢式PCR 建立了對(duì)谷子銹病的檢測體系，檢測到病原菌基因組DNA 最低質(zhì)量濃度為100 pg/μL。本研究建立的PCR 技術(shù)體系能夠檢測到的谷子粒黑穗病菌基因組DNA 最低質(zhì)量濃度為10 pg/μL，具有較高的檢測靈敏度。

用設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)谷種拌菌組發(fā)病植株進(jìn)行病原菌檢測，在穗梗和旗葉中都檢出特異性條帶，表明病原菌隨植株的生長發(fā)育，對(duì)植株頂端的旗葉及穗梗都進(jìn)行了侵染，病菌對(duì)植株的侵染是全身性的。用此引物對(duì)拌菌組中未發(fā)病植株進(jìn)行檢測，長農(nóng)35 穗梗與旗葉中檢出粒黑穗病菌的植株數(shù)多于晉谷21，這與田間植株發(fā)病率數(shù)據(jù)[5]基本一致。本研究建立的PCR 體系可對(duì)谷子粒黑穗病菌進(jìn)行定性檢測，對(duì)定量檢測還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究初步建立了谷子粒黑穗病菌的PCR 檢測鑒定方法，這種快速、高效的檢測手段為今后谷子粒黑穗病菌的檢測鑒定提供了基礎(chǔ)，并且可以用于檢疫研究、流行病害調(diào)查、谷子粒黑穗病過程控制和不同谷子品種抗病性鑒定。