PAMs 移除豬紅細胞表面GFP-Escherichia coli 的體外觀察

凌小雅，朱樂樂，孫加樂，王 緣，張睿玉，薛曉姝，尹 偉

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

1981 年，美國生殖免疫學(xué)家SIEGEL 等[1]在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上提出了“紅細胞免疫系統(tǒng)”的概念，證實了紅細胞不僅具有呼吸功能，還具有免疫功能。研究最為廣泛也是紅細胞最主要的免疫功能是免疫黏附，其最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)是紅細胞膜上的Ⅰ型補體受體（Complement receptor 1，CR1），在CR1 的介導(dǎo)下，紅細胞能夠黏附被補體C3b/C4b 致敏的微生物病原體或免疫復(fù)合物（Immune complex，IC），將這些物質(zhì)經(jīng)血液循環(huán)運送至肝臟和脾臟，然后由吞噬細胞清除[2-4]。

獸醫(yī)學(xué)研究表明，豬紅細胞同樣具有免疫黏附功能，硒中毒[5]、附紅細胞體感染[6]等均會導(dǎo)致豬紅細胞免疫黏附功能的損傷。李宏全等[7-8]對豬紅細胞免疫功能開展了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)豬紅細胞能夠黏附被補體致敏的大腸桿菌，證實了豬紅細胞表面存在類Ⅰ型補體受體（Complement receptor type 1-like，CR1-like），CR1-like 是介導(dǎo)豬紅細胞免疫黏附的重要分子基礎(chǔ)。為了闡明吞噬細胞與豬紅細胞相互作用清除免疫復(fù)合物的分子機理，李宏全等[9]圍繞豬紅細胞轉(zhuǎn)移呈遞免疫復(fù)合物及機理等科學(xué)問題開展了相關(guān)研究，結(jié)果表明，在體外靜態(tài)共孵育條件下，豬紅細胞與PAMs 相互作用，并可將黏附的致敏抗原轉(zhuǎn)移給PAMs。

本研究改進了原先的靜態(tài)孵育條件，運用平行板流動小室灌流系統(tǒng)模擬血液在動物體內(nèi)的生理條件，觀察免疫復(fù)合物從豬紅細胞向豬肺泡巨噬細胞（PAMs）轉(zhuǎn)移的動態(tài)過程，為進一步探究豬紅細胞通過免疫黏附作用協(xié)助清除感染的微生物顆粒的生物學(xué)過程及分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物、細胞及菌株 健康的40 日齡長白豬仔豬1 頭（20±2 kg），購自太谷縣冠農(nóng)農(nóng)牧科技有限公司，室溫條件下飼養(yǎng)，自由采食飲水；豬肺泡巨噬細胞（PAMs）、表達綠色熒光蛋白的大腸桿菌（GFP-Escherichia coli），均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)臨床獸醫(yī)實驗室提供。

1.1.2 主要試劑 Hank's 緩沖液和多聚-L- 賴氨酸購自索萊寶生物科技有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；豬外周血紅細胞分離試劑盒購自天津灝洋生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 正置熒光顯微鏡（型號為BX51）和倒置熒光顯微鏡（型號為IX81）均購自O(shè)LYMPUS 公司；低速冷凍離心機（型號為KDC-2046）購自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；流式細胞儀（型號為C6 plus）購自美國BD 公司；蠕動泵（型號為YZ1515x）購自河北保定領(lǐng)英公司；潔凈工作臺（型號為SW-CJ-2FD）購自上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；Parallel-Plate Flow ChamberCR@3（型號為31-001）購自美國GlycoTech 公司。

1.2 方法

1.2.1 致敏GFP-Escherichia coli 懸液制備 無菌條件下采集豬前腔靜脈血5 mL 于普通采血管中，室溫條件下放置30 min，凝血后4 ℃，3 000 r/min 下離心10 min，吸取上層血清，血清在3 000 r/min 下多次離心至無紅細胞沉淀，4 ℃保存?zhèn)溆?。按照文獻報道研究方法制備GFP-Escherichia coli 懸液[10]。向GFP-Escherichia coli 懸液中加入30%的豬血清，37 ℃避光振蕩孵育15 min。孵育完畢后，4 000 r/min離心5 min，重復(fù)洗滌2 次，重懸，即得致敏GFPEscherichia coli 懸液。

1.2.2 PAMs 的活性檢測 復(fù)蘇PAMs，檢測細胞存活率和細胞對致敏GFP-Escherichia coli 的捕獲活力。細胞存活率的檢測采用臺盼藍染色法。PAMs 對致敏GFP-Escherichia coli 捕獲活力的檢測步驟如下：首先將PAMs 接種于含0.01%多聚-L- 賴氨酸洗滌液洗滌后的潔凈載玻片上，待細胞貼壁后用1 mL 致敏GFP-Escherichia coli 菌懸液孵育1 h，孵育結(jié)束后洗滌，顯微鏡下鏡檢。最后，采用胰酶消化細胞，用流式細胞儀檢測PAMs 捕獲致敏GFP-Escherichia coli 的陽性細胞率。

1.2.3 豬紅細胞黏附致敏GFP-Escherichia coli 樣品制備 無菌采集豬前腔靜脈血2 mL 于枸櫞酸鈉抗凝管中。按照豬紅細胞分離液試劑盒說明書分離豬紅細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為1.0×107個/mL，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。在37 ℃、避光條件下與致敏GFP-Escherichia coli 共孵育15 min，1 500 r/min 離心洗滌，重懸，顯微鏡鏡檢，并用流式細胞儀檢測陽性細胞率，確定紅細胞成功黏附致敏GFP-Escherichia coli。

1.2.4 PAMs 移除豬紅細胞表面GFP-Escherichia coli 的觀察 將平行板流動小室蓋在復(fù)蘇的PAMs載玻片上，在倒置熒光顯微鏡下，連接導(dǎo)管及蠕動泵，流動相瓶內(nèi)裝黏附有致敏GFP-Escherichia coli的豬紅細胞懸液，設(shè)定蠕動泵轉(zhuǎn)速為4 r/min，啟動蠕動泵。選定觀察視野，記錄視野內(nèi)PAMs 捕獲紅細胞表面致敏GFP-Escherichia coli 的過程。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAMs 的鑒定及活性

將分離所得的PAMs 復(fù)蘇培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察，細胞呈圓形，形態(tài)大小均一（圖1-A）。加入臺盼藍染色液，鏡檢計數(shù)后計算出PAMs 存活率為98.3%。將PAMs 與致敏GFP-Escherichia coli 置于37 ℃下孵育1 h，顯微鏡下觀察到PAMs 表面及內(nèi)部結(jié)合有GFP-Escherichia coli 綠色熒光菌體（圖1-B，白色箭頭所示），說明PAMs 具有捕獲致敏GFP-Escherichia coli 的活性，用流式細胞儀檢測出PAMs 吞噬及黏附活力為92.4%（圖2）。

2.2 豬紅細胞黏附致敏GFP-Escherichia coli 樣品鑒定

致敏GFP-Escherichia coli 與豬紅細胞共孵育后，在正置熒光顯微鏡下觀察。豬紅細胞形態(tài)正常，表面結(jié)合有綠色熒光桿狀菌體（圖3，白色箭頭所示），表明豬紅細胞成功黏附GFP-Escherichia coli，用流式細胞儀檢測出豬紅細胞黏附致敏GFP-Escherichia coli 的陽性細胞率為20.6%（圖4）。表明豬紅細胞免疫黏附致敏GFP-Escherichia coli 的樣品制備成功，可用于后續(xù)試驗。

2.3 豬紅細胞向PAMs 轉(zhuǎn)移GFP-Escherichia coli 的觀察

連接平行板流動小室、蠕動泵、導(dǎo)管等裝置構(gòu)建體外細胞互作體系。啟動蠕動泵，將黏附有GFPEscherichia coli 的豬紅細胞注入平行板流動小室與PAMs 相接觸，循環(huán)流動，在倒置顯微鏡下選定視野進行觀察（圖5）。結(jié)果顯示，在黏附GFP-Escherichia coli 的豬紅細胞與PAMs 相接觸的短時間內(nèi)PAMs表面即可出現(xiàn)GFP-Escherichia coli 熒光點，隨著時間推移，PAMs 表面的熒光點增多；當觀察至2 min 19 s 時，視野中出現(xiàn)黏附有致敏GFP-Escherichia coli 的豬紅細胞（白色圓形，圖5-a～c），隨液流方向行進至10 點鐘方向的PAM處（白色箭頭），2 min 20 s 時紅細胞不再流動，與PAM相接觸，綠色熒光點位于紅細胞與PAM交界處（圖5-d）；1 min 06 s 后（3 min 26 s），紅細胞與PAM的連接逐漸斷開，只留下PAM 與GFP-Escherichia colii（圖5-e～h），隨后PAM形態(tài)發(fā)生變化，細胞粒徑增大，該PAM表面目標GFP-Escherichia coli 綠色熒光點減弱，40 min 21 s熒光消失（圖5-i）。從以上結(jié)果可以看出，豬紅細胞免疫黏附致敏GFP-Escherichia coli 后，能夠與PAMs 發(fā)生相互作用。在此過程中，豬紅細胞表面的GFP-Escherichia coli 能夠被PAMs 捕獲，且紅細胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化。

3 結(jié)論與討論

研究表明，紅細胞具有免疫黏附功能，其表面的CR1 能夠粘附補體致敏的病原體并將其運送至吞噬細胞吞噬清除。LI 等[11]證明了CR1 介導(dǎo)的免疫黏附對血液中肺炎鏈球菌的清除有實際的影響。BREKKE 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，紅細胞能快速與人全血孵育后的野生型腦膜炎奈瑟菌和大腸桿菌結(jié)合，誘導(dǎo)白細胞吞噬。SALAM等[13]將人血清、丙型肝炎病毒、紅細胞混合后靜態(tài)孵育，RNA 定量檢測發(fā)現(xiàn)人紅細胞能夠與丙型肝炎病毒結(jié)合，而CR1 抗體的介入會阻斷這種結(jié)合。此外，紅細胞的免疫黏附還能介導(dǎo)巨噬細胞對內(nèi)源性免疫復(fù)合物的清除。β 淀粉樣蛋白（Amyloid β peptide，Aβ）在腦部沉積是阿爾茲海默癥診斷指標中最重要的一項[14]，Aβ 蛋白可透過血腦屏障從腦部轉(zhuǎn)移至外周循環(huán)，未能從血液中清除的Aβ 蛋白可能持續(xù)地在腦部沉積[15]，BRUBAKER等[16]對血液中清除Aβ 蛋白的機制進行了研究，證明人紅細胞能夠免疫黏附Aβ 蛋白，通過對體內(nèi)試驗中雄性食蟹獼猴肝臟的電子顯微鏡觀察得出，紅細胞可將黏附的Aβ 蛋白運送至枯否氏細胞并被清除；Aβ 抗體的存在可顯著提高血液循環(huán)中紅細胞對Aβ 蛋白的清除率[17-18]。然而，此類研究多借助于流式細胞術(shù)和ELISA 進行，而紅細胞免疫黏附IC并被吞噬細胞清除過程缺乏直接可視化的證據(jù)。

HEPBURN 等[19]建立了一種可以研究單個吞噬細胞受體在紅細胞向人單核巨噬細胞轉(zhuǎn)移IC 過程中作用的體外模型。在這個模型中，這些單層的細胞暴露在結(jié)合有IC 的人紅細胞中，通過一種平行板流動系統(tǒng)進行灌流。在此研究基礎(chǔ)上，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)臨床獸醫(yī)實驗室改進了原先的靜態(tài)觀察研究方法，成功構(gòu)建了豬紅細胞與PAMs 的細胞動態(tài)互作模型[20]。該模型模擬了血液在體內(nèi)的剪切力參數(shù)，讓體外觀察模型更加貼近體內(nèi)環(huán)境，提高了試驗的科學(xué)性和準確性。免疫黏附GFP-Escherichia coli 的豬紅細胞經(jīng)血液循環(huán)流經(jīng)PAMs，可在熒光顯微鏡下實時觀察，視野中粘附有GFP-Escherichia coli 的豬紅細胞流動至PAMs 處停留，綠色熒光點位于紅細胞與PAMs 交接處。隨后，豬紅細胞脫離連接，GFP-Escherichia coli 完全轉(zhuǎn)移至PAMs 并被PAMs吞噬清除，這是典型的轉(zhuǎn)移過程。除此之外，該視野中還有其他位置能夠觀察到豬紅細胞黏附著GFP-Escherichia coli 與PAMs 接觸互作，可見PAMs能夠清除黏附在豬紅細胞表面的GFP-Escherichia coli。這為豬紅細胞免疫粘附介導(dǎo)IC 清除的研究提供了直接可視化證據(jù)。

為了深入認識吞噬細胞與紅細胞相互作用清除IC的分子機理，學(xué)術(shù)界開展了大量的研究。EMLEN等[21]用熱聚合的人IgG（HAGG）作為IC 模型研究IC 在人紅細胞和單核細胞之間的轉(zhuǎn)移反應(yīng)。通過阻斷CR1、FcRⅡ、CR3 等單核細胞受體發(fā)現(xiàn)，CR1 在IC 轉(zhuǎn)移過程中起到了主要作用。HEPBURN 等[19]用特異性中和抗體進行的阻斷研究表明，IC 轉(zhuǎn)移是補體受體和Fcγ 受體共同作用的結(jié)果。有研究表明，PAMs 表面存在與豬紅細胞同源的CR1-like 分子，且PAMs 表面CR1-like 相對數(shù)量是豬紅細胞的4～5 倍，阻斷CR1 和FcR 可影響PAMs 對豬紅細胞表面IC 的清除[15]。在平行板流動小室細胞動態(tài)互作模型中，流動的免疫黏附有IC 的豬紅細胞可能通過FcR 介導(dǎo)與PAMs 的結(jié)合停留，繼而通過FcR和CR1-like 的競爭性結(jié)合作用，IC 由紅細胞轉(zhuǎn)移至PAMs 并被PAMs 內(nèi)化清除。

本試驗成功拍攝到PAMs 移除豬紅細胞表面GFP-Escherichia coli 的過程，為豬紅細胞免疫黏附介導(dǎo)IC 清除的研究提供了直接可視化的證據(jù)，為進一步探究豬紅細胞通過免疫黏附功能協(xié)助清除感染的微生物粒子的生物學(xué)過程及其分子機制提供了理論依據(jù)。