青藏高原地區(qū)野生老芒麥苗期抗旱種質(zhì)材料的篩選

楊偉，劉文輝，馬祥，賈志鋒，馬暉玲，張永超，劉敏潔

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅省草業(yè)工程實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點實驗室，青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016)

老芒麥(Elymussibiricus)是一種產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富、適口性好的多年生禾本科植物，有較強的抗逆性，分布范圍廣，因此是應(yīng)用廣泛的牧草，尤其在青藏高原地區(qū)[1-3]。此外，老芒麥也是天然草地修復(fù)和人工草地建植的優(yōu)良材料[4]。青藏高原地區(qū)老芒麥的播種時間一般在6月，當(dāng)年只能完成分蘗，第2年的返青期、分蘗期對于老芒麥的生長發(fā)育十分重要[5]，然而由于春旱頻發(fā)(圖1)，嚴(yán)重影響了老芒麥的生長發(fā)育。

圖1 青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院多年生牧草種質(zhì)資源圃降水量Fig.1 Rainfall in the perennial forage germplasm resource nursery of Qinghai academy of animal husbandry and veterinary sciences

干旱脅迫限制了植物的生長發(fā)育，甚至破壞了植物的代謝系統(tǒng)[6]，同時植物抗旱性是由多個基因控制的數(shù)量性狀[7]。研究表明，老芒麥平均生長率下降速度與干旱脅迫成正比，并且干旱脅迫后期，由于葉片大量失水導(dǎo)致葉片皺縮，植株變矮[8-9]。此外，干旱加速了葉片內(nèi)葉綠素的分解速度，從而抑制植物的光合作用[10]。老芒麥在干旱條件下通過調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)(脯氨酸，可溶性糖和可溶性蛋白)含量達到吸收水分的目的[8-9]。在響應(yīng)干旱脅迫的過程中，老芒麥體內(nèi)的抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量迅速增加，以便及時清除干旱脅迫產(chǎn)生ROS，從而保證細(xì)胞膜的完整性[7]?？梢姡厦Ⅺ湹目购敌孕枰獜亩嘀笜?biāo)多方面進行評價。

本研究對青藏高原不同地方收集的23份野生老芒麥以及2份審定登記品種進行研究，使用隸屬函數(shù)法評價以上材料幼苗期的抗旱性，并引用干旱變異指數(shù)衡量不同材料之間的差異，以期篩選苗期抗旱材料，并對老芒麥抗旱性進行評價，建立老芒麥抗旱性鑒定體系，為老芒麥抗旱性鑒定、篩選以及飼草生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料由青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院草原所提供，詳見表1。

表1 供試材料信息Table 1 Information of test materials

1.2 試驗設(shè)計及處理

1.2.1 第1次砂培試驗 選擇均勻一致、飽滿的老芒麥材料的種子種植于裝有適量沙子的育苗缽(直徑8.5 cm，高度11 cm)，將育苗缽放入裝有1 L蒸餾水的培養(yǎng)盒中(每盒6個育苗缽)，每份材料種植4盒，在光照強度為6 000 lx，光周期為16 h/8 h(光照/黑暗)，溫度為22℃/18℃的培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)。出苗7 d后進行間苗，每個育苗缽留20株幼苗，然后每盒加1 L 1/2 Hoagland營養(yǎng)液進行培養(yǎng)，每天補水使溶液總量保持在1 L，每4 d換1次營養(yǎng)液。老芒麥幼苗長到2葉1心時，將每份材料分為兩組，一組材料繼續(xù)用1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)；另一組用含有20%(W/V)PEG 6000(水勢：-0.60 Mpa)的1/2 Hoagland 營養(yǎng)液進行脅迫處理。脅迫第20 d進行各指標(biāo)的測定。

1.2.2 第2次盆栽試驗 為驗證第1次砂培試驗結(jié)果，從第1次結(jié)果的3個分組中各隨機篩選2份材料進行盆栽驗證。采用2因素隨機區(qū)組設(shè)計，A因素為6份材料，B因素為干旱脅迫，對照為正常澆水，重復(fù)3次，共計36盆。在花盆中裝入混合均勻的大田土和營養(yǎng)土(3:1)，大田土速效N含量 24.2 mg/kg，速效P(P2O5)13.43 mg/kg，速效鉀(K2O)110.32 mg/kg，pH為8.4；營養(yǎng)土N+P2O5+K2O≥5%，有機質(zhì)大于等于45%。在溫室大棚中進行培養(yǎng)，出苗10 d后進行間苗，每盆留10株幼苗，對照組正常澆水，相對含水量控制在60%～70%；處理組停止?jié)菜?。處?4 d后進行各指標(biāo)的測定。

1.3 測定指標(biāo)

株高測定植株自然高度。葉片相對含水量采用飽和稱重法[11]，干物質(zhì)積累量：殺青后80℃烘干稱重[12]，葉面積用葉面積成像儀測定，根長用根系掃描儀測定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法、游離脯氨酸(Pro)含量采用酸性茚三酮比色法、可溶性糖(SS)含量采用蒽酮比色法、葉綠素含量用SPAD502葉綠素含量測定儀、過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚比色法、超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法[13]測定。根冠比=(根系干重/地上部分干重)×100%。葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)用LI-6800便攜式光合儀測定，具體如下：Fv/Fm測定，植物暗適應(yīng)一晚上后，選擇長勢一致的植株進行測定，每個處理3次重復(fù)，飽和脈沖光設(shè)為8 000 μmol/(m2· s)，等熒光參數(shù)穩(wěn)定后讀取數(shù)值；Fv′/Fm′測定，之后將同一葉片在目標(biāo)光強下適應(yīng)30 min后，采用多項飽和閃光測量光適應(yīng)葉片的熒光參數(shù)。然后計算最大光化學(xué)效率，非光化學(xué)猝滅系數(shù)，光化學(xué)淬滅系數(shù)和表觀電子傳遞效率。

1.4 抗旱性評價指標(biāo)

抗旱系數(shù)：X=Yd/Yc；Yd為某一指標(biāo)在干旱脅迫下的測定值，Yc為對照測定值[14]。

抗旱隸屬值：A=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

A=1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

式中：A是各材料某一指標(biāo)抗旱隸屬值，X是各材料某一指標(biāo)抗旱系數(shù)，Xmin和Xmax是所有材料中某一指標(biāo)抗旱系數(shù)的最小值和最大值，除丙二醛用(2)式，其余指標(biāo)均用(1)式。分別求各材料所有指標(biāo)隸屬值的平均值，用其評價各材料的抗旱性[15]。

變異系數(shù)的大小反映了不同性狀不同材料之間的差異，干旱脅迫下，植物的各指標(biāo)肯定會發(fā)生相應(yīng)變化，變異系數(shù)變化越大的指標(biāo)對干旱脅迫的敏感性就越強。為權(quán)衡各指標(biāo)的變異系數(shù)變化幅度，引入干旱變異指數(shù)[12]，用處理組的對照組的變異系數(shù)差值除以均值進行同度量處理，計算公式如下：

干旱變異指數(shù)：VId=|CVd-CVc|/[(CVd+CVc)/2]

式中：CVd是干旱脅迫下所有材料某一指標(biāo)的變異系數(shù)，CVc對照組所有材料某一指標(biāo)的變異系數(shù)。

1.5 統(tǒng)計分析

用Excel 2016進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗旱品種篩選

2.1.1 第1次砂培試驗 對25份材料進行PEG模擬干旱試驗，并對可溶性糖、脯氨酸和丙二醛等指標(biāo)的抗旱隸屬值進行分析(表2)。

所測指標(biāo)：可溶性糖、脯氨酸、丙二醛、干物質(zhì)積累、株高、超氧化物歧化酶和過氧化物酶對應(yīng)抗旱隸屬值最大的材料是09-089、14-250、09-249、14-250、09-118、09-035和川草1號。供試材料的抗旱隸屬值均值為0.460，將隸屬值大于0.560的10-124、14-250、16-335、09-118、G23和09-035歸為抗旱材料；將抗旱隸屬值在0.360～0.560的14-234、09-110、川草1號、09-089、09-249、09-129、09-150、09-053、G9、13-306、13-360和10-5歸為中等抗旱材料；將抗旱隸屬值小于0.360的1-1-4-2、09-210、09-149、1-1-5-13、青牧1號、13-364和14-004歸為不抗旱材料(表2)。

表2 第1次砂培試驗供試材料抗旱隸屬值

2.1.2 第2次盆栽試驗 對6份材料進行盆栽模擬干旱脅迫試驗，并對葉片相對含水量、葉面積和株高等13個指標(biāo)的抗旱隸屬值進行分析(表3)。

14-250葉片相對含水量、葉面積、株高、根長、丙二醛、干物質(zhì)積累、根冠比、葉綠素、凈光合速率、最大光化學(xué)效率、非光化學(xué)猝滅系數(shù)、光化學(xué)淬滅系數(shù)和表觀電子傳遞效率的抗旱隸屬值最大；10-124葉面積、株高、根長、丙二醛、干物質(zhì)積累、根冠比、葉綠素、凈光合速率、最大光化學(xué)效率、非光化學(xué)猝滅系數(shù)、光化學(xué)淬滅系數(shù)的抗旱隸屬值最大。供試材料的抗旱隸屬值均值為0.515，將抗旱隸屬值大于0.615的10-124和14-250歸為抗旱材料；將抗旱隸屬值在0.415～0.615的09-129和09-150歸為中等抗旱材料；將抗旱隸屬值小于0.415的09-149和14-004歸為不抗旱材料。兩次篩選結(jié)果一致(表3)。

表3 第2次盆栽試驗供試材料抗旱隸屬值

2.2 抗旱指標(biāo)篩選和評價

對兩次抗旱篩選的形態(tài)及生理指標(biāo)進行分析，發(fā)現(xiàn)不同材料各指標(biāo)的對照組和處理組的變異系數(shù)均有變化，為衡量這種變化，引入干旱變異指數(shù)(表4)。將干旱變異指數(shù)大于30%的指標(biāo)定義為干旱敏感指標(biāo)。第1次篩選的敏感指標(biāo)為脯氨酸和丙二醛，第2次篩選的指標(biāo)為葉面積、根長、丙二醛、根冠比、葉綠素、凈光合速率、最大光化學(xué)效率、光化學(xué)淬滅系數(shù)和表觀電子傳遞效率。

表4 兩次干旱模擬試驗中供試指標(biāo)干旱變異指數(shù)

3 討論

3.1 抗旱材料篩選

植物抗旱性受到多種外界因素影響以及多種生理機制調(diào)控[16]，因此評價抗旱性需要綜合多種指標(biāo)進行綜合性評價?？倒鹛m[17]通過研究干旱脅迫后9種冰草屬牧草細(xì)胞相對含水量和相對電導(dǎo)率的變化篩選耐旱牧草。李京蓉等[8]測定了6種高寒牧區(qū)牧草干旱脅迫后葉片相對含水量，丙二醛、可溶性糖和葉綠素含量，從而評價它們的抗旱性[18]。此外，脯氨酸含量，抗氧化酶活性和葉綠素?zé)晒鈪?shù)等指標(biāo)同樣被用來評價禾本科牧草的抗旱性[19-20]。但是，這些研究基本只進行了一次試驗，沒有對結(jié)果進行進一步的驗證。本試驗從第1次PEG 6000模擬干旱脅迫試驗篩選的抗旱材料、中等抗旱材料和不抗旱材料中分別選取了兩份材料，進行盆栽試驗驗證，兩次試驗所用指標(biāo)存在一定差異，但試驗結(jié)果一致，增加了試驗的可靠性，同時也進一步說明老芒麥抗旱性是一個復(fù)雜的性狀，不能用單一指標(biāo)簡單評價。

3.2 抗旱指標(biāo)篩選

從2次試驗的干旱變異指數(shù)可知，形態(tài)指標(biāo)上葉面積、根長和根冠比對于干旱脅迫較為敏感，這可能是由于根系是供給植物水分的器官，對干旱的響應(yīng)更為敏感，此時地上部分的水分運輸受到阻礙，加上蒸騰作用，葉片大量失水，植株體內(nèi)膨壓降低，葉片擴展受阻，甚至萎蔫干枯，導(dǎo)致葉面積、根長和根冠比的干旱變異系數(shù)較大[15]。對于牧草來說，干物質(zhì)積累是其產(chǎn)量的直接體現(xiàn)，綜合兩次試驗結(jié)果來看，干物質(zhì)積累的干旱變異指數(shù)相對其他指標(biāo)較小，這可能是由于干物質(zhì)積累是多性狀的綜合體現(xiàn)。研究表明，植物抗旱性和產(chǎn)量都是有數(shù)量性狀位點控制的，在進行抗旱育種時需對兩個系統(tǒng)進行綜合考慮，篩選抗旱評價指標(biāo)時更應(yīng)該注重指標(biāo)對干旱的敏感性，而不是側(cè)重于產(chǎn)量潛力[21-22]。因此，在進行老芒麥苗期抗旱材料大批量篩選時，選擇對干旱更為敏感的根系特征、葉面積和生理指標(biāo)更有利于試驗的開展。

長期干旱脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除失衡[23]，從而導(dǎo)致植物體內(nèi)積累大量的活性氧，過多的活性氧會破壞細(xì)胞膜的完整性，并使膜蛋白產(chǎn)生二次損傷[11]，丙二醛是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，它的含量可以反映逆境脅迫下植物體內(nèi)細(xì)胞受損程度?？寡趸冈诰S持植物體內(nèi)活性氧的平衡中起決定性作用[24]。本研究中，丙二醛的干旱變異指數(shù)大于超氧化物歧化酶和過氧化物酶，因此可以用丙二醛來評價老芒麥的抗旱性。

脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)控細(xì)胞的滲透勢，使細(xì)胞免受活性氧毒害作用保證細(xì)胞的正常功能[25]，但是干旱脅迫下，不同植物體內(nèi)脯氨酸的變化趨勢并不一致，因此其與植物的抗旱性有無必然聯(lián)系存在一定爭議[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下，不同材料葉片內(nèi)的脯氨酸含量均有所增加，這與前人在老芒麥上的研究一致[10,14]，綜合來看，需在較強較長時間的干旱脅迫前提下把脯氨酸作為抗旱性評價指標(biāo)。

干旱脅迫導(dǎo)致植物光合色素含量減少，類囊體膜結(jié)構(gòu)受損，從而降低植物光合能力。因此，選擇與植物光合作用相關(guān)指標(biāo)可以有效反應(yīng)植物的抗旱性。本試驗發(fā)現(xiàn)，葉綠素、凈光合速率、最大光化學(xué)效率、光化學(xué)淬滅系數(shù)和表觀電子傳遞效率的干旱變異指數(shù)較大，說明這些指標(biāo)對干旱較敏感，可以用作老芒麥抗旱性評價指標(biāo)，這與田山君的研究一致[12]。

4 結(jié)論

10-124、14-250、16-335、09-118、G23和09-035在干旱模擬試驗中表現(xiàn)良好，被歸為抗旱材料，是青藏高原牧草育種與栽培的首選材料。對多個抗旱指標(biāo)進行分析，其中葉面積、根冠比、根長、丙二醛、脯氨酸、葉綠素、凈光合速率、最大光化學(xué)效率、光化學(xué)淬滅系數(shù)和表觀電子傳遞效率對干旱脅迫較為敏感，可作為老芒麥苗期抗旱性評價指標(biāo)。