應(yīng)用隸屬函數(shù)法評(píng)價(jià)10個(gè)紫花苜蓿品種的耐熱性

楊雨薇，王琳,盧俊峰，任翔，徐鑫，劉大林

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院(國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室)，江蘇 揚(yáng)州 225009)

隨著全球氣候變暖的不斷加劇，植物正面臨著高溫脅迫的危害。高溫脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)造成的直接傷害表現(xiàn)為植物光合速率降低后葉片出現(xiàn)萎蔫、失綠的現(xiàn)象，與此同時(shí)，植物呼吸速率下降，體內(nèi)的部分有害物質(zhì)無(wú)法被清除或降解。部分植物的根部在高溫逆境下會(huì)出現(xiàn)褐變，根系生物量的積累受到抑制從而加速植物的死亡。植物細(xì)胞膜是抵抗高熱脅迫的重要組織，高溫脅迫下植物體內(nèi)的活性氧分子發(fā)生氧化反應(yīng)形成丙二醛，并在植物體內(nèi)積累對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜造成損傷。此外，植物在受到高溫脅迫后蛋白質(zhì)合成受阻，酶活性下降，造成植物體內(nèi)代謝失調(diào)。

紫花苜蓿(Medicagosativa)作為一種常見(jiàn)的多年生豆科牧草，在我國(guó)北方地區(qū)草地面積較大的區(qū)域種植。除此之外，在南方紫花苜蓿的種植已經(jīng)有了一定的規(guī)模并且發(fā)展前景良好，但其適宜生長(zhǎng)的日平均氣溫為15～21℃，對(duì)高溫極其敏感[1]。我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)常年高溫，夏季最高溫度可達(dá)40℃，對(duì)農(nóng)作物的生產(chǎn)造成諸多不利的影響。紫花苜蓿在南方地區(qū)種植還會(huì)面臨高溫多濕帶來(lái)的病蟲(chóng)害問(wèn)題。因此高溫脅迫是限制南方地區(qū)紫花苜蓿生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素。張鶴山等[2]測(cè)量了19個(gè)紫花苜蓿品種的耐熱性，發(fā)現(xiàn)WL系列品種的耐熱性較強(qiáng)，劉大林等[3]對(duì)高溫脅迫下紫花苜蓿的部分生理生化指標(biāo)做了分析，李德峰[4]分析了夏季苜蓿減產(chǎn)的原因，任翔等[5]通過(guò)施加硅酸鉀緩解了紫花苜蓿對(duì)高溫環(huán)境的不良應(yīng)答反應(yīng)。雖然國(guó)內(nèi)眾多學(xué)者對(duì)紫花苜蓿的耐高溫能力進(jìn)行了生長(zhǎng)和生理方面指標(biāo)測(cè)定，但是使用不同指標(biāo)對(duì)紫花苜蓿耐熱性進(jìn)行隸屬函數(shù)綜合分析較少。本研究以10個(gè)紫花苜蓿品種作為試驗(yàn)材料，通過(guò)人工氣候培養(yǎng)箱模擬高溫環(huán)境，探究高溫脅迫對(duì)紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)和生理的影響，并對(duì)10個(gè)紫花苜蓿品種的耐高溫能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為我國(guó)多高溫天氣的地區(qū)或夏季持續(xù)高溫地區(qū)紫花苜蓿的種植提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院草業(yè)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室中的10個(gè)紫花苜蓿品種作為試驗(yàn)材料，其特性及編號(hào)見(jiàn)表1。

表1 紫花苜蓿材料特征及編號(hào)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用盆栽法進(jìn)行栽培試驗(yàn)，花盆直徑為30 cm，高35 cm，每盆裝過(guò)篩(孔徑0.5 mm)風(fēng)干土900 g。選取籽粒飽滿、大小一致的10個(gè)紫花苜蓿品種種子，于5%次氯酸鈉溶液中浸種消毒15 min。每個(gè)品種10盆，每盆播種40粒，播深2 cm。播種21 d后，分別挑選每個(gè)品種長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致的6盆植株作為處理材料，其中3盆室溫下放置為對(duì)照組，其余3盆放入人工氣候培養(yǎng)箱中，在38℃光照處理14 h，35℃黑暗處理10 h的模式下進(jìn)行高溫脅迫處理。每個(gè)處理均3次重復(fù)。高溫脅迫處理14 d后對(duì)所有材料進(jìn)行采樣，分別測(cè)其各項(xiàng)生長(zhǎng)和生理指標(biāo)。

1.3 測(cè)量指標(biāo)與方法

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定 將經(jīng)過(guò)14 d處理后的紫花苜蓿植株放入蒸餾水中，將根部清洗干凈，用吸水紙吸干水分，每盆隨機(jī)取10株紫花苜蓿，用剪刀迅速將紫花苜蓿的根、莖、葉分開(kāi)，用直尺(精度0.1 cm)分別測(cè)其地上和地下部分絕對(duì)長(zhǎng)度，并取平均值；稱(chēng)量其各部位鮮重，在105℃殺青烘干之后，分別測(cè)量根、莖、葉的干重。

1.3.2 葉綠素含量的測(cè)定 參考施海濤[6]葉綠素測(cè)定方法測(cè)定葉綠素含量，稍有改動(dòng)。在高溫脅迫處理下生長(zhǎng)14 d后，稱(chēng)取紫花苜蓿的新鮮葉片0.1 g，記為m，將稱(chēng)取的新鮮葉片放入10 mL的離心管中，隨后在離心管中加入5 mL 95%的乙醇，用錫箔紙包嚴(yán)后黑暗條件下浸提48 h，然后以95%的乙醇作為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)測(cè)波長(zhǎng)665和649 nm下的吸光度。然后根據(jù)下列方程式計(jì)算葉綠素a含量、葉綠b含量和葉綠素總含量。

Chla(mg/g FW)=(13.95×D665 nm-6.88×D649 nm)×0.005/m

Chlb(mg/g FW)=(24.96×D649 nm-7.32×D665 nm)×0.005/m

Chl(mg/g FW)=Chla+Chlb=(18.08×D649 nm+6.63×D665 nm)×0.005/m

式中：Chla為葉綠素a的含量，Chlb為葉綠素b的含量，Chl為葉綠素的總含量。

1.3.3 丙二醛(MDA)含量 MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)量[6]。

1.3.4 可溶性糖含量的測(cè)定 可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定[6]。

1.4 抑制率分析

本研究在綜合評(píng)價(jià)時(shí)根據(jù)對(duì)照處理和高溫處理下10個(gè)紫花苜蓿品種各單項(xiàng)指標(biāo)均值，計(jì)算高溫脅迫下10個(gè)紫花苜蓿品種的各單項(xiàng)指標(biāo)的抑制率。 計(jì)算公式為：

a% = (1-W/CK)×100%

式中：a% 表示單項(xiàng)指標(biāo)的抑制率，CK表示對(duì)照處理下該單項(xiàng)指標(biāo)的均值，W表示高溫處理下該單項(xiàng)指標(biāo)的均值。

1.5 耐高溫性綜合評(píng)價(jià)

用隸屬函數(shù)評(píng)價(jià)方法[7-8]，對(duì)各紫花苜蓿品種的耐熱性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。計(jì)算公式如下：

F1(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

F2(Xi)= 1 -(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中：X表示第i個(gè)指標(biāo)值，Xmin表示第i個(gè)指標(biāo)的最小值，Xmax表示第i個(gè)指標(biāo)的最大值。若該指標(biāo)與紫花苜蓿的耐高溫能力呈相反關(guān)系，則采用用反隸屬函數(shù)公式F2計(jì)算其隸屬函數(shù)值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。在0.05置信水平上用Duncan法進(jìn)行多重比較，用Excel 2010作圖，SPSS 19.0 進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對(duì)不同紫花苜蓿品種幼苗生長(zhǎng)的影響

高溫脅迫處理14 d后，10個(gè)紫花苜蓿品種的株高、根長(zhǎng)、總生物量、根干重、莖干重和葉干重均低于對(duì)照處理(表2)，表明紫花苜蓿對(duì)于高溫較為敏感并且紫花苜蓿的生長(zhǎng)在高溫條件下受到了脅迫。高溫脅迫下，其葉片鮮重顯著低于對(duì)照(P<0.05)，表明高溫脅迫對(duì)紫花苜蓿葉片生長(zhǎng)有抑制作用。MS10品種的莖鮮重在處理組與對(duì)照組也有顯著性差異(P<0.05)，表明高溫脅迫對(duì)植物莖的生長(zhǎng)也有影響。

表2 高溫脅迫下紫花苜蓿的生長(zhǎng)特性

2.2 高溫脅迫對(duì)不同紫花苜蓿品種幼苗葉綠素含量的影響

高溫脅迫處理14 d后，10個(gè)紫花苜蓿品種葉片中的葉綠素a含量均低于對(duì)照組，除MS3、MS8和MS9 3個(gè)品種在高溫脅迫下與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，其余7個(gè)紫花苜蓿品種在高溫脅迫下的葉綠素含量與對(duì)照組的葉綠素含量均有顯著性差異(P<0.05)(圖1)。此外，高溫脅迫下紫花苜蓿的葉綠素b含量也均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，MS1-MS10分別下降58.90%、42.30%、25.50%、11.90%、35.80%、30.50%、82.60%、28.10%、6.10%和5.80%。與對(duì)照組相比，MS1-MS10高溫脅迫下葉綠素總含量分別下降24.40%、32.60%、10.00%、15.80%、17.80%、10.40%、24.90%、8.70%、3.50%和5.00%。除了MS9和MS10與對(duì)照組無(wú)顯著差異，其他品種的葉綠素總量均顯著低于對(duì)照(P<0.05)。

圖1 不同處理下紫花苜蓿葉片中的葉綠素含量Fig.1 Impact of different treatments on chlorophyll content of alfalfa leaves注：不同小寫(xiě)字母表示同一紫花苜蓿品種在不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同

2.3 高溫脅迫對(duì)不同紫花苜蓿品種幼苗MDA含量的影響

高溫脅迫處理14 d后，10個(gè)紫花苜蓿品種葉片中的MDA含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，MS1-MS10較對(duì)照組分別上升4.50%、39.20%、5.50%、16.40%、24.60%、18.80%、34.30%、33.10%、7.50%和62.90%，MS10和MS2品種上升幅度較大(圖2)。

圖2 不同處理下紫花苜蓿葉片中的MDA含量Fig.2 Effect of different treatments on MDA content of alfalfa leaves

2.4 高溫脅迫對(duì)不同紫花苜蓿品種幼苗可溶性糖含量的影響

高溫脅迫下，10個(gè)紫花苜蓿品種幼苗葉片中的可溶性糖含量均高于對(duì)照組。高溫脅迫下紫花苜蓿葉片中可溶性糖含量與對(duì)照組具有顯著性差異(P<0.05)(圖3)。高溫脅迫下，MS1-MS10可溶性糖含量較對(duì)照組分別上升72.50%、10.70%、4.90%、19.20%、12.40%、7.50%、27.75%、13.20%、28.00%和19.90%。

圖3 不同處理下紫花苜蓿葉片中的可溶性糖含量Fig.3 Effects of temperature treatments on the content of soluble sugar in alfalfa leaves

2.5 高溫脅迫對(duì)不同紫花苜蓿品種抑制率的影響

2.5.1 高溫脅迫下紫花苜蓿各單項(xiàng)指標(biāo)的抑制率 高溫脅迫下紫花苜蓿各單項(xiàng)指標(biāo)的抑制率如表3所示。

表3 高溫脅迫下10個(gè)紫花苜蓿品種各項(xiàng)指標(biāo)的抑制率

2.5.2 各項(xiàng)指標(biāo)抑制率間的Pearson相關(guān)性分析 株高與莖鮮重呈顯著正相關(guān)，與葉綠素b含量極顯著負(fù)相關(guān)(表4)。根長(zhǎng)與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)。根鮮重與葉鮮重呈顯著正相關(guān)。葉鮮重與可溶性糖含量

表4 高溫脅迫下紫花苜蓿各項(xiàng)指標(biāo)抑制率間的Pearson相關(guān)性分析

顯著負(fù)相關(guān)。葉綠素b含量與葉綠素總含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)。

2.5.3 紫花苜蓿耐熱性評(píng)價(jià) 在利用隸屬函數(shù)對(duì)10個(gè)紫花苜蓿品種的耐熱性進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，根據(jù)葉綠素的抑制率與紫花苜蓿的耐高溫能力呈反比例關(guān)系采用反隸屬函數(shù)公式計(jì)算葉綠素含量的隸屬函數(shù)值；可溶性糖含量和MDA含量與紫花苜蓿的高溫敏感性呈正比例關(guān)系，所以用隸屬函數(shù)公式計(jì)算其隸屬函數(shù)值。結(jié)果表明，MS3品種的隸屬函數(shù)值最高，均值為0.84，MS8和MS6次之，均值分別為0.64、0.57。MS10的隸屬函數(shù)值均值僅為0.36，為各品種中最低；MS1和MS2的隸屬函數(shù)值也僅為0.41和0.38，處于較低的水平(表5)。高溫脅迫下紫花苜蓿MS3、MS6和MS8屬于對(duì)高溫耐受力較強(qiáng)的材料，而紫花苜蓿MS1、MS2和MS10則是對(duì)高溫相對(duì)較敏感型材料。

表5 高溫脅迫下10個(gè)品種紫花苜蓿隸屬函數(shù)分析

3 討論

對(duì)不同紫花苜蓿品種進(jìn)行耐熱性評(píng)價(jià)有助于進(jìn)一步探究高溫對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)和生理的影響和培育耐高溫的紫花苜蓿品種。由于長(zhǎng)江中下游地區(qū)夏季高溫天氣溫度維持在38℃左右，所以本研究采用培養(yǎng)箱模擬38℃高溫環(huán)境，探究了高溫脅迫對(duì)10個(gè)紫花苜蓿品種生長(zhǎng)和生理特性的影響，通過(guò)隸屬函數(shù)分析進(jìn)行耐熱性綜合評(píng)價(jià)。

根系是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中獲取水分和養(yǎng)分關(guān)鍵的部位，根系的健康狀況對(duì)植物水分和養(yǎng)分的吸收具有重要影響[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下10個(gè)紫花苜蓿品種的根長(zhǎng)和根重均低于對(duì)照組(表2)。據(jù)報(bào)道，在高溫下植株的生長(zhǎng)狀態(tài)普遍表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢、枯萎甚至在較高的溫度下部分植株也會(huì)發(fā)生死亡的現(xiàn)象[3]。在夏季最高溫度超過(guò)35℃的地區(qū)，紫花苜蓿越夏時(shí)有死亡現(xiàn)象，研究表明溫度越高、脅迫時(shí)間越長(zhǎng)植物生長(zhǎng)狀態(tài)越差[10-11]，且高溫后恢復(fù)生長(zhǎng)的時(shí)間較為緩慢[12-13]，本研究結(jié)果與之一致。此外，本研究中紫花苜蓿植株不同部位的生物量對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)存在差異。本研究認(rèn)為根系的健康狀況將直接影響莖和葉部的水分、養(yǎng)分吸收，根系越健康則植株也越健康，抵抗逆境的能力也就越強(qiáng)。

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要色素。本研究結(jié)果顯示，高溫脅迫下紫花苜蓿的葉綠素含量均低于對(duì)照組(圖1)。楊秋珍等[14]發(fā)現(xiàn)高溫脅迫下的甜瓜葉片葉綠素含量呈下降的趨勢(shì)，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)下降的幅度增大，本實(shí)驗(yàn)與其結(jié)果相一致，宰學(xué)明等[15]研究表明在高溫42℃處理過(guò)程中，花生幼苗的葉綠素含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，表現(xiàn)為初期下降幅度平緩，后期變化明顯。任翔等[5]研究表明高溫可引起葉綠素分解，導(dǎo)致葉片衰老，高溫使得紫花苜蓿發(fā)生明顯的光抑制作用。其原因可能是高溫脅迫促使ROS形成[16]，破壞ROS和抗氧化體系代謝之間的動(dòng)態(tài)平衡，而葉綠體作為ROS的主要生成位點(diǎn)容易被氧化劑攻擊[17-18]。葉綠素合成受限和自由基對(duì)葉綠素的誘導(dǎo)使高溫脅迫下紫花苜蓿葉片中的葉綠素含量降低[18-19]。

生理響應(yīng)是植物對(duì)逆境脅迫響應(yīng)的重要內(nèi)在體現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫處理14 d后10個(gè)紫花苜蓿品種葉片中的MDA含量顯著高于對(duì)照(圖2)，該結(jié)果與劉大林等[3]對(duì)高溫脅迫下紫花苜蓿葉片中MDA含量變化的規(guī)律一樣。其原因可能是長(zhǎng)期高溫情況下脂類(lèi)形成了囊泡，從而破壞了膜結(jié)構(gòu)，使膜失去了選擇透性和主動(dòng)吸收能力。此外，高溫破壞了細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除之間的平衡，使得氧化物在細(xì)胞膜內(nèi)大量積累。MDA含量是衡量脂膜過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)，紫花苜蓿葉片的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞的半透性失效使得細(xì)胞膜中物質(zhì)滲透出來(lái)。在高溫脅迫下，MDA在植物體內(nèi)的積累導(dǎo)致蛋白質(zhì)的交聯(lián)和聚合，影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而對(duì)植物的正常生長(zhǎng)造成直接傷害[20-21]。

可溶性糖作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),當(dāng)植物受到非生物因子脅迫時(shí),滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量會(huì)增加以提高細(xì)胞液的滲透壓,提高細(xì)胞保水能力及從外環(huán)境的吸水能力,從而防止植物脫水,緩解脅迫對(duì)膜系統(tǒng)的損害,保護(hù)和調(diào)節(jié)植物正常生長(zhǎng)[22]。本次研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下紫花苜蓿葉片中可溶性糖含量均高于對(duì)照組(圖3)，結(jié)果與劉大林等[3]的研究相一致。趙壯軍等[23]通過(guò)對(duì)高羊茅初級(jí)代謝產(chǎn)物的分析發(fā)現(xiàn)，根系中的有機(jī)酸和脂肪酸含量較多，而氨基酸、糖類(lèi)以糖醇普遍積累在植株葉片中。紫花苜?？赡芡ㄟ^(guò)利用糖醇和肌醇的抗氧化能力來(lái)更好地適應(yīng)高溫逆境。紫花苜?？梢詫⒌矸坜D(zhuǎn)化為可溶性糖或通過(guò)光合作用直接合成高濃度的可溶性糖來(lái)維持紫花苜蓿的呼吸作用[24-25]，從而出現(xiàn)可溶性糖升高的結(jié)果。

本研究中株高、根長(zhǎng)、根莖葉干鮮重、葉綠素含量、MDA含量、可溶性糖含量等生長(zhǎng)、生理指標(biāo)在高溫脅迫前后的變化特征表明，紫花苜蓿不同品種之間不能通過(guò)單一的指標(biāo)來(lái)準(zhǔn)確判斷其耐熱性的強(qiáng)弱，必須對(duì)多個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行綜合分析與評(píng)價(jià)。近年來(lái)，隸屬函數(shù)值法被廣泛應(yīng)用于植物的抗逆性評(píng)價(jià)[26]，該方法已在黃瓜[27]，香菇[28]，大白菜[29]，杜鵑[30]等作物上應(yīng)用，效果良好。隸屬函數(shù)法作為耐熱性評(píng)價(jià)的常用方法，所用的指標(biāo)可分為3種：1)用發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、抗旱指數(shù)等來(lái)評(píng)價(jià)；2)用各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值累加求平均來(lái)評(píng)價(jià)；3)用各指標(biāo)的相對(duì)值來(lái)評(píng)價(jià)[27-29]。在10個(gè)品種中，WL-712系列雖然其秋眠級(jí)較高，但是通過(guò)隸屬函數(shù)值分析其耐熱性較差，說(shuō)明秋眠級(jí)高低與耐熱性強(qiáng)弱并無(wú)必然聯(lián)系。本研究采用生長(zhǎng)、生理等13個(gè)指標(biāo)，計(jì)算各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值并累加求平均值來(lái)評(píng)價(jià)10個(gè)紫花苜蓿品種的耐熱性，其耐熱性強(qiáng)弱依次為：WL-319HQ>WL65HQ>WL-354>WL-903>WL-168>愛(ài)菲>WL-363>三德利>維多利亞>WL-712。

4 結(jié)論

高溫脅迫對(duì)不同紫花苜蓿品種幼苗生長(zhǎng)和生理特性具有一定的影響。具體表現(xiàn)為，高溫處理14 d后的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)均低于對(duì)照組；葉綠素含量降低；細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著上升；可溶性糖含量上升。耐熱性綜合評(píng)價(jià)表明，紫花苜蓿WL-319HQ，WL-656HQ和WL-354是高溫耐受型品種， WL-712,三德利和維多利亞是高溫敏感型品種。