草地早熟禾NAC基因鑒定及非生物脅迫下表達模式分析

朱瑞婷，?？e，張然，馬暉玲

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅省草業(yè)工程實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

生存環(huán)境對植物生長具有重要影響[1]，其中，干旱、高鹽、低溫、高溫、重金屬等是抑制植物生長發(fā)育的主要非生物脅迫因素。干旱脅迫會限制植物生長，改變植物滲透平衡[2]。重金屬會破壞植物細胞中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生有害物質(zhì)[3]。鹽脅迫會破壞質(zhì)膜的完整性從而抑制植物生長[4]。高溫脅迫會影響植物的生理代謝，對植物生長造成一定的損害[5]。在長期演變過程中，植物自身形成了一套復(fù)雜的防御系統(tǒng)來抵御不良環(huán)境的傷害，在這些防御方法中，轉(zhuǎn)錄因子家族在植物響應(yīng)外界環(huán)境脅迫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起到了關(guān)鍵作用[6]。

轉(zhuǎn)錄因子是一類通過與脅迫相關(guān)基因的特異順式作用元件相結(jié)合從而激活或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄的DNA結(jié)合蛋白，參與植物在非生物脅迫下的響應(yīng)[7]。NAC家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，具有不同的生物學(xué)功能。NAC家族在N端具有保守的NAC結(jié)構(gòu)域，大約有150個氨基酸，C端為高度變異的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)[8]。其功能涉及植物生長發(fā)育、激素調(diào)控和脅迫響應(yīng)等重要方面[9]。目前在很多植物中已經(jīng)鑒定出大量NAC家族成員，如石榴(Punicagranatum)[10]、果梅(Prunusmume)[11]、苦蕎(Tartarybuckwheat)[12]、西瓜(Citrulluslanatus)[13]等。不同物種間家族成員的數(shù)量與功能存在重要差異，但大量的NAC轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫反應(yīng)中起到調(diào)控作用[14-17]。如玉米(Zeamays)ZmNAC84在煙草中的過表達可增強耐旱性[18]，過表達OsNAC5可以增強水稻(Oryzasativa)的耐鹽性[19]，低溫脅迫下番茄(Solanumlycopersicum)SINAM1的過表達減輕了番茄在遭受低溫脅迫后的氧化損傷[20]。

草地早熟禾(Poapratensis)是禾本科早熟禾屬植物，廣泛分布于北溫帶冷濕潤地區(qū)，是一種多年生冷季型禾草，葉形美觀，具根狀莖，是優(yōu)良的草坪草。草地早熟禾喜冷涼濕潤的氣候，耐寒性較強，但抗旱性較差[21]。隨著全球性氣候、生態(tài)和環(huán)境問題日益嚴重，尤其是全球變暖的加劇，干旱、高鹽、高溫、重金屬污染已經(jīng)成為制約農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要因素[22]，提高草坪草的抗逆性是目前草坪研究中的熱點問題。草坪草抗逆基因的鑒定對了解其響應(yīng)逆境脅迫的分子機制和抗逆新品種的選育具有重要意義。有關(guān)非生物脅迫下草坪草NAC基因表達模式分析的報道較少，草地早熟禾NAC基因尚未被完全鑒定。本課題組前期進行了草地早熟禾抗旱、抗寒、耐鎘轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)NAC基因家族基因參與草地早熟禾的逆境脅迫響應(yīng)。本研究以前期組裝的草地早熟禾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，對具有全長cDNA的草地早熟禾NAC基因進行鑒定并分析其不同脅迫下的表達模式，為草地早熟禾NAC基因家族的分子調(diào)控機理研究提供理論依據(jù)，有助于優(yōu)良基因資源的挖掘和新品種培育。

1 材料和方法

1.1 供試材料與生長條件

試驗材料為草地早熟禾品種巴潤，由北京克勞沃公司提供。采用砂培法種植，將清洗干凈的沙子等量的裝入直徑為9 cm、高度為17 cm的育苗缽中，種子直接播種后于生長室中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：白天溫度為25℃，時間為16 h，光照強度為6 000 lx，夜晚溫度為20℃，時間為8 h，濕度為50%。播種20 d后，用Hoagland營養(yǎng)液培育，持續(xù)培養(yǎng)4周，在此期間每隔5 d換1次營養(yǎng)液和蒸餾水。

1.2 植物處理

選擇長勢一致的幼苗，對其進行6組處理，每組處理4個重復(fù)，第1組為對照：正常營養(yǎng)液栽培；第2組為鹽處理：200 mmol/L NaCl溶液栽培；第3組為干旱處理：15% PEG-6000溶液栽培；第4組為低溫處理：0℃培養(yǎng)；第5組為高溫處理：38℃培養(yǎng)；第6組為重金屬處理：3 mmol/L CdCl2溶液栽培。處理時間6、24、48 h、7 d，每次取樣4次重復(fù)，取其葉片，迅速放入液氮中冷凍后保存于-80℃。

1.3 全長草地早熟禾NAC基因的鑒定

二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)NAC蛋白序列可根據(jù)文獻提供的登錄號在NCBI上搜索獲得(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)[23]。在BioEdit軟件中，將本實驗室已有和報道的5個草地早熟禾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫作為本地數(shù)據(jù)庫[24-28]，以二穗短柄草NAC蛋白序列作為請求序列，Program選擇：‘tblastn’，Expectation Value選擇E-20，搜索本地草地早熟禾數(shù)據(jù)庫。將所得到的序列通過NCBI網(wǎng)站中的blastX進行搜索比對，獲得候選序列。

1.4 序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)進化樹

通過ExPASy在線網(wǎng)站上的Prat Param工具對草地早熟禾NAC家族基因的理化性質(zhì)進行初步預(yù)測，包括基因的大小、分子量、等電點、不穩(wěn)定指數(shù)、親水性的平均值和脂肪指數(shù)。通過MEME網(wǎng)站(http://meme-suite.org/tools/meme)對草地早熟禾NAC基因的保守基序進行分析。根據(jù)在線網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)預(yù)測草地早熟禾NAC基因的編碼蛋白序列，采用鄰近法在MEGA 7.0軟件上對PpNACs進行聚類分析。

1.5 熒光定量PCR(qRT-PCR)

RNA提取使用天根公司植物RNA提取試劑盒，RNA反轉(zhuǎn)錄使用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒，第1步去除基因組DNA反應(yīng)，第2步為反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，稀釋20倍作為模板。使用NCBI在線網(wǎng)站Prime-BLAST( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)進行引物設(shè)計(表1)。利用天根熒光定量試劑盒進行qRT-PCR分析，20 μL反應(yīng)體系如下：模板5 μL，引物2 μL，ddH2O 3 μL，2×SuperReal PreMix Plus 10 μL。熒光定量PCR的條件為：95℃預(yù)變性15 min，40個循環(huán)的PCR擴增，包括95℃變性10 s和58℃退火30 s。內(nèi)參基因為ACT，每個樣品設(shè)3次技術(shù)重復(fù)，基因的相對表達量使用2-ΔΔCT法計算[29]。

表1 定量PCR引物

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 23.0軟件進行T檢驗，并用GraphPad Prism 8軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 草地早熟禾NAC基因家族的生物信息學(xué)分析

2.1.1 草地早熟禾NAC轉(zhuǎn)錄因子的鑒定 根據(jù)二穗短柄草的NAC蛋白序列，在BioEdit軟件中搜索本地草地早熟禾數(shù)據(jù)庫，通過搜索比對得到15個草地早熟禾NAC全長cDNA序列，具有完整的ORF序列，根據(jù)草地早熟禾拉丁名將其命名為PpNACs(表2)。結(jié)果表明，15個草地早熟禾NAC基因中分子量在61 184.22(PpNAC18)～163 713.04(PpNAC20)，等電點在4.89～5.04，都屬于酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)除了PpNAC16外都大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白；親水性系數(shù)在0.705～1.022，屬于疏水性蛋白(大于零表示疏水性蛋白，小于零表示親水性蛋白，在±0.5之間為兩性蛋白)。

表2 15個全長草地早熟禾NAC轉(zhuǎn)錄因子理化性質(zhì)分析

2.1.2 PpNACs基因的motif分析和聚類分析 采用MEME網(wǎng)站在線預(yù)測草地早熟禾NAC基因的保守結(jié)構(gòu)域，可知15個NAC家族基因一共由12種motif組成(圖1)。其中，motif 2和motif 7在所有草地早熟禾NAC基因中都存在。草地早熟禾NAC基因由多種motif組成，除PpNAC16、PpNAC18、PpNAC21和PpNAC23外都具有motif 1-7。Motif 1在80%的PpNACs中存在，Motif 2和motif 6在87%PpNACs中存在。

圖1 草地早熟禾NAC基因的基序結(jié)構(gòu)和聚類分析Fig.1 Motif composition and cluster analysis of NAC genes in Poa pratensis

對15個NAC家族基因進行聚類分析，可分為3大類，第1類包括PpNAC1、PpNAC9、PpNAC10、PpNAC11、PpNAC13、PpNAC24，都含有motif 1-7；第2類包括PpNAC2、PpNAC16、PpNAC18、PpNAC19、PpNAC21、PpNAC23，都含有motif2和motif7；第3類包括PpNAC6、PpNAC17和PpNAC20，都含有motif 1-7、motif 9和motif 11。

2.2 草地早熟禾NAC基因家族表達模式分析

2.2.1 重金屬脅迫下NAC基因的表達PpNAC9和PpNAC16隨著時間的增大，呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，在7 d時達到最大值，分別是對照的6.53倍和8.27倍；PpNAC1、PpNAC2在6 h時表達量顯著增大，隨后呈現(xiàn)下降又上升的趨勢；PpNAC23在48 h時表達量顯著增大，在其他時間段無顯著性變化；PpNAC10和PpNAC18在7 d時表達量達到最大，分別是對照的223.33倍和99.72倍；PpNAC1、PpNAC2、PpNAC10、PpNAC11、PpNAC13、PpNAC16、PpNAC17、PpNAC19、PpNAC24在4個時間段內(nèi)均有顯著性變化(圖2)。

圖2 重金屬脅迫下NAC基因的表達分析Fig.2 Relative expression level of NAC genes under heavy metal treatment注：豎線表示標(biāo)準(zhǔn)誤，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2.2 鹽脅迫下NAC基因的表達PpNAC9和PpNAC13在四個時間段內(nèi)都有顯著性變化，PpNAC9、PpNAC10、PpNAC11、PpNAC16、PpNAC18、PpNAC19、PpNAC20、PpNAC23在7 d時表達量達到最大值，PpNAC10在7 d時表達量是對照的50.88倍，PpNAC24在6 h時表達量顯著增大，在48 h時表達量達到最大，是對照的36.33倍。PpNAC1、PpNAC13、PpNAC17在6 h是表達量顯著性增大，隨后呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，響應(yīng)短期脅迫和長期脅迫(圖3)。

圖3 鹽脅迫下NAC基因的表達分析Fig.3 Relative expression level of NAC genes under salt treatment

2.2.3 干旱脅迫下NAC基因的表達PpNAC9、PpNAC11、PpNAC17在干旱脅迫48 h內(nèi)變化不大，在7 d時表達量有明顯的增大，響應(yīng)長期干旱脅迫。PpNAC1和PpNAC13在0～48 h內(nèi)呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在48 h～7 d呈現(xiàn)上升趨勢且在7 d時表達量達到最大，分別是對照的94.08倍和80.30倍。在干旱脅迫下PpNAC2和PpNAC24在6 h時表達量顯著增大，達到最大值，而其他基因在7 d時表達量達到最大值(圖4)。

圖4 干旱脅迫下NAC基因的表達分析Fig.4 Relative expression level of NAC genes under drought treatment

2.2.4 低溫脅迫下NAC基因的表達 在低溫脅迫下，PpNAC2和PpNAC13在6 h表達量顯著增大，24 h持續(xù)增大達到最大值，48 h呈現(xiàn)下降趨勢，表達水平受到抑制，7 d又出現(xiàn)上升趨勢。PpNAC1和PpNAC10的表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在24 h達到峰值，分別是對照的66.38倍、98.46倍。PpNAC17的表達量隨時間的增大表現(xiàn)出上升趨勢。PpNAC21的表達量與對照相比在短期處理時表現(xiàn)出顯著增大，在長期處理時表現(xiàn)出顯著減小。低溫脅迫下PpNAC1、PpNAC6、PpNAC10、PpNAC13、PpNAC16、PpNAC17的表達量均高于對照(圖5)。

圖5 低溫脅迫下NAC基因的表達分析Fig.5 Relative expression level of NAC genes under low temperature treatment

2.2.5 高溫脅迫下NAC基因的表達 研究表明，該家族大部分成員在高溫7 d時的表達水平較高。在高溫脅迫下，PpNAC16的表達量均具有顯著性變化，表達水平上調(diào)。隨著高溫處理時間的增大，PpNAC17、PpNAC19和PpNAC20的表達持續(xù)上調(diào)，在7 d時處于較高的表達水平，分別是對照的5.85倍、5.35倍和11.63倍(圖6)。

圖6 高溫脅迫下NAC基因的表達分析Fig.6 Relative expression level ofNAC genes under high temperature treatment

3 討論

在其他高等植物如擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻中，NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能已被闡明，具有相似結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)具有相同或相似的生物學(xué)功能[30]，已有文獻報道，構(gòu)建進化樹預(yù)測其功能的方法可應(yīng)用于其他物種[21]，因此，通過對草地早熟禾和二穗短柄草NAC基因家族的系統(tǒng)進化樹分析，有助于預(yù)測同一亞族的PpNACs基因的功能。已知的NAC基因家族成員參與植物的生長發(fā)育和不同脅迫反應(yīng)，揭示了NAC基因的序列多樣化導(dǎo)致功能的多樣化[31]，為草地早熟禾NAC基因家族的鑒定提供了堅實的基礎(chǔ)。草地早熟禾可用于草坪草的種植和提高城市綠化覆蓋率，但耐寒性強，抗旱性較差。NAC基因家族具有高度保守的結(jié)構(gòu)域，對植物的非生物脅迫應(yīng)答過程具有重要的作用。本試驗從草地早熟禾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定出15個全長cDNA 序列的NAC基因。PpNACs家族成員的等位點在4.89～5.04，與李偉[32]克隆所得PpNACs基因的等位點為5.30相一致，都屬于酸性蛋白；與二穗短柄草和水稻NAC基因家族成員數(shù)目相差較大，可能是在進化過程中出現(xiàn)了丟失，也可能是由于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫有限而導(dǎo)致NAC基因家族成員的不完整性。根據(jù)NAC基因的保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，PpNACs家族基因在N端含有基本的NAC結(jié)構(gòu)域，NAC結(jié)構(gòu)包括N端的DNA結(jié)合區(qū)和C端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，N端大約有150個氨基酸殘基，分為A～E 5個亞結(jié)構(gòu)域， A、C、D結(jié)構(gòu)域為主要的親水區(qū)，E結(jié)構(gòu)域為主要的疏水區(qū)，在PpNACs轉(zhuǎn)錄因子家族成員中都含有E結(jié)構(gòu)域，都屬于疏水性蛋白。

在重金屬脅迫下，PpNACs基因隨著脅迫時間的延長呈現(xiàn)不同的趨勢，而在此脅迫過程中PpNAC10、PpNAC18、PpNAC19和PpNAC24為高表達。研究表明，水稻中NAC基因參與銅脅迫過程[33]，在西瓜中NAC基因家族在緩解鎘脅迫中可能具有重要作用[34]，關(guān)于NAC基因家族在重金屬脅迫中的研究很少，初步推測PpNAC10、PpNAC18、PpNAC19和PpNAC24在鎘脅迫過程中起到重要作用。PpNACs基因在鹽脅迫下大部分呈現(xiàn)上升下降再上升的趨勢，而且在第7 d時都表現(xiàn)為上調(diào)，PpNAC10和PpNAC24在鹽脅迫過程中表現(xiàn)出高表達量，出現(xiàn)的峰值時間不同，分別在7 d和48 h。研究表明，過表達ONAC045可提高水稻的耐鹽性[35]，在擬南芥中過表達CiNAC3表現(xiàn)出更強的耐鹽性[36]。因此，PpNAC10和PpNAC24基因可作為研究草地早熟禾耐鹽性的候選基因。在干旱脅迫下，所有PpNACs基因在不同的時間響應(yīng)程度不同，表達量均有不同程度的增加，在第7 d時表達量具有顯著差異性(除PpNAC24外)，均高于對照。PpNAC1、PpNAC6、PpNAC10、PpNAC13基因在7 d表現(xiàn)出高表達量，而在擬南芥中超量表達NAC基因可提高其抗旱性[37]。在干旱脅迫下水稻OsNAC095基因的表達量增加，通過減少體內(nèi)水分的喪失提高水稻的抗旱性[38]。同樣在本試驗干旱脅迫下所有基因的表達量都有所增加，因此推測這些基因參與草地早熟禾對干旱脅迫的調(diào)控，PpNAC1、PpNAC6、PpNAC10、PpNAC13可能在抗旱性方面起到重要作用。

在低溫脅迫下，PpNACs基因具有不同的表達趨勢，有的基因在脅迫過程中表現(xiàn)為全部上調(diào)，如PpNAC1、PpNAC6、PpNAC10、PpNAC16和PpNAC17；有的基因在脅迫過程中的表達趨勢為先上升后下降再上升，如PpNAC2和PpNAC13；有的基因則表現(xiàn)為先上升后下降再上升又下降的趨勢，如PpNAC6、PpNAC9、PpNAC16、PpNAC21和PpNAC24。在高溫脅迫下，除PpNAC20外的其他基因表達量的變化在10倍以內(nèi)。PpNACs基因表達量的變化趨勢具有多樣性，如PpNAC1、PpNAC16和PpNAC20在脅迫過程中都表現(xiàn)為上調(diào)；PpNAC16、PpNAC23和PpNAC24在脅迫過程中為上升下降上升下降趨勢。由此發(fā)現(xiàn)在高低溫脅迫下PpNAC1和PpNAC16都表現(xiàn)為上調(diào)，PpNAC24都呈現(xiàn)“M”趨勢，它們在溫度脅迫下具有相同的變化趨勢，可能是受到相同的分子調(diào)控，參與相同的調(diào)控路徑。在茶樹(Camelliasinensis)中CsNAC1和CsNAC2響應(yīng)溫度脅迫并有復(fù)雜的調(diào)控機制[39]。本試驗表明PpNACs基因響應(yīng)高溫和低溫脅迫，不同基因響應(yīng)高低溫脅迫程度不同，體現(xiàn)了PpNACs基因在溫度脅迫下具有復(fù)雜的調(diào)控性。研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下番茄中SlNAM1基因的過表達會提高滲透物的含量，降低超氧陰離子的含量，提高植株的抗寒性[20]。PpNAC1和PpNAC10在24 h表現(xiàn)為高表達量，PpNAC18在48 h表現(xiàn)為高表達量，它們可以作為草地早熟禾對低溫脅迫下調(diào)控的候選基因。研究發(fā)現(xiàn)在番茄中抑制SlNAC1的表達影響熱激蛋白的積累，轉(zhuǎn)基因植株的抗性降低，SlNAC1在番茄耐高溫中起到正調(diào)控作用[40]，本研究中PpNAC20在高溫脅迫下為高表達，它可能在耐高溫過程中起到重要作用。

在本試驗中同時分析了PpNACs基因在重金屬、高鹽、干旱、高溫和低溫脅迫下的表達情況，15個PpNACs基因具有不同的表達模式，這些基因參與多種信號傳導(dǎo)途徑，為確定基因功能提供了重要信息[41-42]。試驗發(fā)現(xiàn)PpNAC10在重金屬、高鹽、干旱和低溫脅迫下為高表達，PpNAC18在重金屬、干旱和低溫脅迫下為高表達，PpNAC10和PpNAC18在多種非生物脅迫下表現(xiàn)突出，因此可將PpNAC10和PpNAC18作為候選基因進行功能驗證。

4 結(jié)論

根據(jù)二穗短柄草的蛋白序列和草地早熟禾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)分析得到15個PpNACs基因全長cDNA序列，具有完整的開放閱讀框。15個PpNACs轉(zhuǎn)錄因子都是酸性蛋白，除了PpNAC16，其他都屬于不穩(wěn)定蛋白，疏水性蛋白。PpNACs成員通過聚類分析可分為3類，Motif分析發(fā)現(xiàn)大部分PpNACs基因家族成員具有motif 1、2、3、4、5、6、7，具有相似的結(jié)構(gòu)。通過qRT-PCR分析草地早熟禾在不同非生物脅迫下的表達水平發(fā)現(xiàn)，15個PpNACs基因均能響應(yīng)不同的非生物脅迫，具有不同的表達模式，與重金屬脅迫相關(guān)的基因有PpNAC10、PpNAC18、PpNAC19和PpNAC24；與耐鹽性相關(guān)的基因有PpNAC10和PpNAC24；與抗旱性相關(guān)的基因有PpNAC1、PpNAC6、PpNAC10和PpNAC13；與耐寒性相關(guān)的基因有PpNAC1、PpNAC10和PpNAC18；與耐高溫相關(guān)的基因有PpNAC20，綜上發(fā)現(xiàn)PpNAC10和PpNAC18在多種抗逆過程中起到重要作用，可作為后續(xù)功能驗證試驗的候選基因。