硫磺菌子實(shí)體活性成分對(duì)植物病原真菌抑菌的初步研究*

權(quán) 琳，劉曉鳳，梁 洪，何建清

（1.德陽科貿(mào)職業(yè)學(xué)院，四川 德陽 618000；2.民辦四川天一學(xué)院，四川 德陽 618000；3.西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏 林芝 860000）

硫磺菌[Laetiporμs sμlphμreμs（Fr.）Murrill]，別名硫色干酪菌、硫磺多孔菌，是一種藥食兼用的高等真菌，廣泛分布在西藏、河北、吉林及遼寧等地[1]。陳士瑜等[2]研究表明，硫磺菌子實(shí)體被火焚燒后，能夠?qū)ξ谩Ⅱ膀斓炔∠x有驅(qū)逐作用，有望用于天然驅(qū)蟲藥物開發(fā)。據(jù)報(bào)道，硫磺菌子實(shí)體所產(chǎn)生的齒孔酸（eburicoic acid）能合成甾體藥物，可以調(diào)節(jié)機(jī)體，增加抵抗力，子實(shí)體所產(chǎn)生的麥角甾醇也可以作為重要的醫(yī)藥化工原料[3]；此外，硫磺菌子實(shí)體中還含有甜菜堿（betaine）和胡蘆巴堿（trigonelline）等生物堿[4]。一些生物堿，如鯨蠟基甜菜堿對(duì)生物膜有消除作用且對(duì)變形鏈球菌有抑制作用[5]。甜菜堿可用于殺滅包括結(jié)核菌在內(nèi)的多種細(xì)菌，可作為殺菌消毒洗滌劑使用[6]。通過對(duì)硫磺菌子實(shí)體中抑菌活性進(jìn)行研究，以期為其進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum） 是對(duì)小麥生產(chǎn)危害較大的一種真菌性病害，會(huì)造成小麥減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)80%～90%[7]，引起小麥籽粒腐敗變質(zhì)，嚴(yán)重危害人畜健康[8]。馬鈴薯干腐病菌（Fusarium coeruleum） 是一種世界性土傳病害，對(duì)全球馬鈴薯產(chǎn)業(yè)造成巨大危害，且防治較困難[9]，據(jù)報(bào)道，馬鈴薯病害逐年加重，嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和質(zhì)量，其中由鐮刀菌（Fusarium sp.）引起的干腐病更是制約馬鈴薯產(chǎn)業(yè)穩(wěn)步發(fā)展的頭號(hào)大敵，常造成6%～25%的減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)60%以上[10]。目前，普遍使用的傳統(tǒng)化學(xué)合成抗菌藥大多毒性大，殘留高，對(duì)環(huán)境、動(dòng)物和人類身體健康均有諸多不良影響，長(zhǎng)期使用會(huì)破壞生態(tài)的多樣性以及糧食作物的安全性。隨著環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)和研究技術(shù)的發(fā)展，人們開始關(guān)注從天然資源中獲得更安全、更環(huán)保及更高效的抗菌劑。藥用真菌種類豐富，是產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)與具有活性天然小分子化合物的重要生物類群，對(duì)其進(jìn)行深入研究，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)更多具有抗感染作用的藥用真菌，探索真菌抗菌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，作為生物抗菌劑進(jìn)行研發(fā)和利用，具有重大意義[11]。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備

試驗(yàn)所用儀器設(shè)備見表1。

表1 儀器設(shè)備信息Tab.1 Information of instrument and equipment

1.2 試劑、培養(yǎng)基與材料

供試菌種：硫磺菌子實(shí)體，來自西藏農(nóng)牧學(xué)院真菌實(shí)驗(yàn)室。

供試病原真菌：小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum） 和馬鈴薯干腐病菌（Fusarium coeruleum），來自西藏農(nóng)牧學(xué)院真菌實(shí)驗(yàn)室。

其他試驗(yàn)試劑見表2。

表2 試劑與材料Tab.2 Reagentsand materials

2 試驗(yàn)方法

2.1 硫磺菌子實(shí)體生物堿類化合物提純制備

精密稱定硫磺菌子實(shí)體粉末（甜菜堿含量0.79%）5 g，置于250 mL燒杯中，加入蒸餾水100 mL。在水浴鍋上加熱至100℃，再加入堿性氧化鋁25 g攪拌均勻，過濾。取濾液于蒸發(fā)皿中，置水浴鍋上揮干溶劑。稱取堿性氧化鋁（100目～200目） 50 g填充柱層析，把蒸干后的化合物填充于堿性氧化鋁柱上層，然后用95%乙醇500 mL洗脫，收集洗脫液，于水浴鍋上揮干溶劑[12]，即得硫磺菌子實(shí)體提純后的生物堿類化合物（以下簡(jiǎn)稱提取物A）。

2.2 提取物A對(duì)植物病原真菌抑菌活性試驗(yàn)

參照參考文獻(xiàn)[8]，精密稱定1.26 g硫磺菌子實(shí)體提取物A，置于10 mL容量瓶中，加95%乙醇制成含提取物A濃度為1 mg·mL-1的備用溶液。用無菌的超濾膜過濾后，分別吸取適量加入無菌PDA培養(yǎng)基，制成含提取物A濃度分別為100 μg·mL-1和10 μg·mL-1的培養(yǎng)基。甜菜堿培養(yǎng)基（濃度分別為100 μg·mL-1和10 μg·mL-1）也按照上述方法制成，以空白培養(yǎng)基作對(duì)照（CK）。將培養(yǎng)基放置在通風(fēng)櫥中24 h，揮發(fā)去除95%乙醇溶劑，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。用直徑為6 mm的打孔器打取生長(zhǎng)整齊一致的2種病原真菌菌餅（小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌），再將病原真菌菌餅移植到各處理培養(yǎng)基的中心。1個(gè)培養(yǎng)皿1個(gè)菌餅，使菌絲面向下接觸培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)3 d～5 d。根據(jù)菌落直徑平均值大小，計(jì)算出相應(yīng)的抑菌率（E，%），公式為：

式中：a為各處理培養(yǎng)基中菌落直徑（mm）；b為空白對(duì)照中菌落直徑（mm）。

2.3 提取物A與廣譜抗菌藥的抑菌作用比較

參照參考文獻(xiàn)[13]，取提取物A，加95%乙醇至溶解，再用無菌的超濾膜過濾，后用無菌PDA培養(yǎng)基制成梯度為 3.20 mg·mL-1、1.60 mg·mL-1、0.80 mg·mL-1、 0.40 mg·mL-1、 0.20 mg·mL-1、 0.10 mg·mL-1及0.05 mg·mL-1的供試培養(yǎng)基。百菌清與多菌靈為農(nóng)藥廣譜性殺菌劑，用無菌水分別稀釋經(jīng)精密稱定的98%多菌靈和75%百菌清，用無菌的超濾膜過濾。后加入無菌的PDA培養(yǎng)基，制成含98%多菌靈培養(yǎng)基濃度梯度為 15 μg·mL-1、10 μg·mL-1、5 μg·mL-1、3 μg·mL-1、1 μg·mL-1的培養(yǎng)基[13]和 75%百菌清培養(yǎng)基濃度梯度為20.00 mg·mL-1、10.00 mg·mL-1、5.00 mg·mL-1、2.50 mg·mL-1、1.25 mg·mL-1的培養(yǎng)基[15]，以空白培養(yǎng)基作對(duì)照（CK）。將培養(yǎng)基放置在通風(fēng)櫥中24 h，以揮發(fā)去除95%乙醇溶劑，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。用直徑為6 mm的打孔器打取生長(zhǎng)整齊一致的2種病原真菌菌餅（小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌），再將病原真菌餅移植到各處理培養(yǎng)基中心。1個(gè)培養(yǎng)皿1個(gè)病原真菌菌餅，使菌絲面向下接觸培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)3 d～5 d。根據(jù)菌落直徑平均值大小，按照2.2中的公式計(jì)算出相應(yīng)的抑菌率（%）。

2.4 提取物A的抑菌作用

取2.2中培養(yǎng)3 d和7 d的供試病原真菌，同時(shí)使用純化的小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌作為對(duì)照。在經(jīng)過滅菌后的載玻片上滴1滴蒸餾水，用無菌接種環(huán)挑取少量菌絲制成玻片，顯微鏡觀察并拍照。

2.5 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Microsoft Excel 2016、SPSS 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin 2018軟件進(jìn)行作圖。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果分析

3.1.1 提取物A對(duì)植物病原真菌的抑菌活性

不同濃度提取物A對(duì)植物病原真菌表現(xiàn)出不同程度的抑菌作用，抑菌效果見圖1、表3。

表3 不同濃度提取物A和甜菜堿對(duì)2種植物病原菌的抑制率Tab.3 Inhibition ratio of different concentrations of extract A and betaine on two plant pathogens

圖1 提取物A對(duì)2種植物病原菌的抑制效果Fig.1 Inhibition effect of extract A on two plant pathogens

如圖1、表3所示，提取物A和甜菜堿對(duì)小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌均有一定的抑制效果。當(dāng)提取物A濃度為100 μg·mL-1時(shí)，其對(duì)小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑制率分別是47.27%和43.48%；甜菜堿濃度為100 μg·mL-1時(shí)，其對(duì)小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑制率分別是34.66%和29.54%。隨著濃度的下降，抑菌率也下降，濃度與抑菌率呈正相關(guān)性，由抑菌率可知，提取物A的抑菌效果較甜菜堿好。

3.1.2 提取物A與廣譜抗菌藥的抑菌比較

7種濃度的提取物A對(duì)小麥赤霉病菌及馬鈴薯干腐病菌的抑制作用情況見圖2、表4。

圖2 提取物A不同濃度對(duì)小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑制情況Fig.2 Inhibition effect of different concentrations of extract A on Fusarium gramineaanum and Fusarium coeruleum

表4 不同濃度提取物A對(duì)小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑制作用Tab.4 The inhibitory effect of carbendazim on Fusarium gramineaanum and Fusarium coeruleum

如圖2、表4所示，與空白培養(yǎng)基CK相比，提取物A對(duì)病原真菌的抑制作用具有顯著性差異（P<0.05）。各濃度下提取物A均具有抑制小麥赤霉病菌的作用，其中濃度為1.6 mg·mL-1時(shí)對(duì)小麥赤霉病菌的抑制效果最佳，其抑菌率為88.42%。提取物A濃度為1.6 mg·mL-1時(shí)抑菌率大于濃度為3.2 mg·mL-1時(shí)抑菌率，而濃度小于1.6 mg·mL-1時(shí)，其抑菌率呈量效關(guān)系，證明1.6 mg·mL-1為其最大的抑菌濃度。各濃度提取物A均具有抑制馬鈴薯干腐病菌的作用，其中A濃度為3.2 mg·mL-1時(shí)對(duì)馬鈴薯干腐病菌抑制效果最佳，其抑菌率為86.46%，與其他濃度及CK的處理具有顯著性差異（P<0.05），與濃度為1.6 mg·mL-1的處理無顯著性差異 （P＞0.05）。

綜上所述，小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌對(duì)提取物A比較敏感，與CK相比抑菌效果明顯。提取物 A 為 0.8 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1及 3.2 mg·mL-1對(duì)小麥赤霉病菌的抑菌效果較理想，其抑菌率分別是88.16%、88.42%及88.35%。但當(dāng)提取物A濃度為 1.6 mg·mL-1與 3.2 mg·mL-1時(shí)，2 種濃度處理下的抑菌率無顯著性差異（P＞0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，硫磺菌子實(shí)體對(duì)供試的小麥赤霉病菌最大抑菌率為88.42%。提取物 A 濃度為 0.8 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1及3.2 mg·mL-1對(duì)馬鈴薯干腐病菌的抑菌效果較理想，其抑菌率分別是86.23%、86.35%及86.46%。但提取物A為1.6 mg·mL-1與3.2 mg·mL-1時(shí)，對(duì)馬鈴薯干腐病的抑菌率無明顯增加，且2種濃度處理下的抑菌率無顯著性差異（P＞0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，硫磺菌子實(shí)體對(duì)供試的馬鈴薯干腐病最大抑菌率為86.46%。從抑菌率表明，2種植物病原菌對(duì)提取物A表現(xiàn)出不同的敏感性，進(jìn)而表現(xiàn)出不同的抑菌效果：小麥赤霉病菌>馬鈴薯干腐病菌。

5種不同濃度的多菌靈對(duì)小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑制作用情況見圖3、表5。

如圖3所示，5種不同濃度的多菌靈對(duì)小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑制作用情況不同，與未接多菌靈的空白培養(yǎng)基CK的抑菌率相比具有顯著性差異（P<0.05）。不同濃度的多菌靈對(duì)小麥赤霉病菌均有抑菌作用，其中在多菌靈濃度為15 μg·mL-1、10 μg·mL-1及 5 μg·mL-1處理下對(duì)小麥赤霉病菌的抑制率較好，抑菌率均為100%。并且與3 μg·mL-1、1 μg·mL-1及 CK的處理相比較具有顯著性差異（P<0.05）。如表5所示，不同濃度的多菌靈對(duì)馬鈴薯干腐病菌均有抑菌作用，其中在濃度為15 μg·mL-1處理下對(duì)馬鈴薯干腐病菌抑制率最佳，抑菌率為100%，與其他濃度及CK相比具有顯著性差異（P<0.05）。

圖3 不同濃度的多菌靈對(duì)小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑菌效果Fig.3 The inhibitory effect of carbendazim on Fusarium gramineaanum and Fusarium coeruleum

表5 多菌靈對(duì)小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑制作用Tab.5 The inhibitory effect of carbendazim on Fusarium gramineaanum and Fusarium coeruleum

綜上所述，采用98%多菌靈作為抑菌對(duì)照試驗(yàn)組，2種植物病原菌中，多菌靈對(duì)小麥赤霉病菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用的濃度為5 μg·mL-1，對(duì)馬鈴薯干腐病菌的抑制作用的濃度為15 μg·mL-1。多菌靈為15 μg·mL-1，對(duì)2種植物病原真菌的抑菌率相同；濃度小于15 μg·mL-1時(shí)，其抑菌率大小為小麥赤霉病菌>馬鈴薯干腐病菌，抑菌作用和質(zhì)量濃度變化呈正相關(guān)性，隨著藥物濃度減小，抑制效果明顯減小。

5種不同濃度的百菌清對(duì)小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑制作用見圖4、表6。

圖4 不同濃度的百菌清對(duì)小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑菌效果Fig.4 The antimicrobial antimicrobial acivity of different concentrations of chlorothalonil on Fusarium gramineaanum and Fusarium coeruleum

如圖4所示，5種不同濃度的百菌清對(duì)小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌的抑制作用與空白培養(yǎng)基CK相比具有顯著性差異（P<0.05）。如表6所示，不同濃度的百菌清對(duì)小麥赤霉病菌均有抑菌作用，其中百菌清濃度為20 mg·mL-1的處理對(duì)小麥赤霉病菌的抑制率最佳，抑菌率為100%，且與其他濃度相比具有顯著性差異（P<0.05）。如表6所示，不同濃度的百菌清對(duì)馬鈴薯干腐病菌均有抑菌作用，其中在百菌清濃度為20 mg·mL-1處理下對(duì)馬鈴薯干腐病菌抑制率最佳，抑菌率為100%，且與其他濃度及CK相比具有顯著性差異（P<0.05）。綜上所述，百菌清對(duì)馬鈴薯干腐病菌和小麥赤霉病菌現(xiàn)出明顯抑制作用的MIC值為20 μg·mL-1，對(duì)小麥赤霉病菌的抑制作用減弱。其抑菌率，馬鈴薯干腐病菌>小麥赤霉病菌，抑菌作用和質(zhì)量濃度變呈正相關(guān)性，隨著藥物濃度減小，抑制效果明顯減小。

3.1.3 3種藥物對(duì)同種植物病原菌的抑制能力

廣譜抗菌藥和硫磺菌提取物對(duì)2種植物病原菌的抑制效果見圖5、圖6。

圖5 各處理對(duì)小麥赤霉病菌的抑制效果Tab.5 The inhibitory effect of different treatments on Fusarium gramineaanum

圖6 各處理對(duì)馬鈴薯干腐病菌的抑制效果Fig.6 The inhibitory effect of different treatments on Fusarium coeruleum

如圖5、圖6所示，提取物A與其他2種藥物對(duì)2種供試菌種都有明顯的抑菌效果。對(duì)于小麥赤霉病菌，多菌靈的抑菌能力強(qiáng)于提取物A和百菌清；而對(duì)于馬鈴薯干腐病菌，百菌清抑菌能力強(qiáng)于多菌靈與提取物A的抑菌能力。

3.1.4 顯微觀察提取物A的抑菌作用

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過處理的供試品小麥赤霉病菌在培養(yǎng)3 d后菌絲變細(xì)萎縮、產(chǎn)生畸形及顏色變淺等現(xiàn)象，而小麥赤霉病菌CK則未有此類現(xiàn)象發(fā)生；經(jīng)過處理的供試品馬鈴薯干腐病菌在培養(yǎng)3 d后菌絲體出現(xiàn)菌落生長(zhǎng)畸形和菌絲生長(zhǎng)量變少，菌絲形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，而馬鈴薯干腐病菌CK則未有此類現(xiàn)象發(fā)生。顯微觀察培養(yǎng)7 d后，提取物A對(duì)2種植物病原菌的抑制作用，結(jié)果見圖7。

圖7 培養(yǎng)7 d后提取物A對(duì)小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病的抑菌作用的顯微鏡觀察圖Fig.7 Microscopic observation of the antimicrobial activity of extract A on Fusarium gramineaanum and Fusarium coeruleum cultured for 7 days

如圖7所示，經(jīng)過處理的供試品小麥赤霉病菌在培養(yǎng)7 d后分生孢子出現(xiàn)明顯的膨大及畸形，導(dǎo)致芽管腫脹和扭曲菌等現(xiàn)象，而小麥赤霉病菌CK則未有此類現(xiàn)象發(fā)生；經(jīng)過處理的供試品馬鈴薯干腐病菌在培養(yǎng)7 d后孢子萌發(fā)量減少，菌絲出現(xiàn)變小、變短或斷裂及畸形等現(xiàn)象，而病原菌CK則未有此類現(xiàn)象發(fā)生。

3.2 討論

近年來，用生物抗菌劑以替代或部分替代化學(xué)殺菌劑的研究越來越受到重視，王娟等[16]研究表明，硫磺菌菌絲體發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物濃度為50 mg·mL-1，對(duì)小麥赤霉、辣椒疫霉及黃瓜炭疽病菌均顯示出較強(qiáng)的抑菌效果，對(duì)甘薯黑斑、煙草赤星、蘋果腐爛及小麥腐病菌具有較強(qiáng)的抑菌效果。本試驗(yàn)結(jié)果表明，小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌對(duì)提取物A比較敏感，當(dāng)提取物A濃度為0.8 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1及 3.2 mg·mL-1時(shí)對(duì)小麥赤霉病菌的抑菌率分別是88.16%、88.42%及88.35%；硫磺菌子實(shí)體對(duì)供試的馬鈴薯干腐病最大抑菌率為86.46%。表明2種植物病原菌對(duì)硫磺菌子實(shí)體粗提取物表現(xiàn)出不同的敏感性，進(jìn)而表現(xiàn)出不同的抑菌效果，即對(duì)小麥赤霉病菌的抑菌效果優(yōu)于對(duì)馬鈴薯干腐病菌的抑菌效果。研究結(jié)果表明以甜菜堿為代表的生物堿類成分為硫磺菌子實(shí)體活性物質(zhì)之一，為其生物抗菌劑的開發(fā)提供了參考。

人們長(zhǎng)期使用多菌靈類及百菌清類殺菌劑，導(dǎo)致我國(guó)多數(shù)地區(qū)的小麥赤霉病菌對(duì)此類殺菌劑已經(jīng)逐漸產(chǎn)生抗藥性[17-18]，最主要原因是此類殺菌劑與病原菌的親和性正在逐漸下降[9]。再者，多菌靈有低毒，殘留高，對(duì)人類皮膚和眼睛有刺激，口服中毒會(huì)出現(xiàn)頭昏、惡心及嘔吐等現(xiàn)象[19]；百菌清對(duì)生態(tài)環(huán)境破壞嚴(yán)重，殘留高，更會(huì)對(duì)人體造成致癌的風(fēng)險(xiǎn)，WHO在2017年10月27日發(fā)布的《致癌物清單》中，百菌清名列2B類致癌物?，F(xiàn)代農(nóng)業(yè)上迫切需要一種具有高效、長(zhǎng)效、廣譜、穩(wěn)定、無毒及對(duì)生態(tài)環(huán)境無污染的生物抗菌劑，本研究結(jié)果表明，提取物A對(duì)小麥赤霉病菌和馬鈴薯干腐病菌均有明顯的抑制效果。雖然對(duì)小麥赤霉病菌及馬鈴薯干腐病菌的抑制能力低于多菌靈和百菌清，但其來自于天然成分，可以避免長(zhǎng)期使用多菌靈和百菌清引起的弊端，值得進(jìn)一步開發(fā)研究。

研究結(jié)果表明提取物A對(duì)2種植物病原真菌的抑菌作用優(yōu)于甜菜堿，說明以甜菜堿為代表的生物堿類成分為硫磺菌子實(shí)體活性物質(zhì)之一，下一步應(yīng)對(duì)其他的活性成分進(jìn)一步研究。