澤瀉湯標準顆粒中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和23-乙酰澤瀉醇B含量的檢測方法探討

吳 俊，林徐劍，施曉萍

（正大青春寶藥業(yè)有限公司 浙江 杭州 310023）

澤瀉湯標準顆粒處方來源于《金匱要略》（東漢張仲景）。主治水停心下，清陽不升，濁陰上犯，頭目昏眩，現(xiàn)用于耳源性眩暈[1-3]。澤瀉湯標準顆粒由澤瀉和白術(shù)2味藥物組成，澤瀉中主要有三萜類、倍半萜類、二萜類化合物和其他成分，其中23-乙酰澤瀉醇B具有降脂、利尿的活性[4-5]。白術(shù)主要有苷類、多糖類、揮發(fā)性成分和氨基酸類等，其中白術(shù)內(nèi)酯類成分是白術(shù)的藥效成分，具有較好的降脂、抗炎活性。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ是內(nèi)酯類成分的主要物質(zhì)之一，含量較高，性質(zhì)穩(wěn)定[6-7]。所以含量測定指標為白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和23-乙酰澤瀉醇B。通過含量測定，為澤瀉湯標準顆粒質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1.儀器與材料

高效液相色譜儀（Agilent1260系列，DAD檢測器），色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；KQ-100DE超聲波清洗器（昆山超聲）；BS-224 S型電子分析天平（賽多利斯）。乙腈（色譜純，美國天地），其他為分析純，水為超純水，23-乙酰澤瀉醇B對照品（購于中國食品藥品檢定研究院，批號：111846-201504，含量以99%計算），白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品（購于中國食品藥品檢定研究院，批號：111978-201501，含量以99.9%計算）。

2.方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×150 mm, 5 μm）；流動相：乙腈-水，梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；波長：208 nm（檢測23-乙酰澤瀉醇B）、222 nm（檢測白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ），見表1。

表1 流動相梯度表

2.2 樣品溶液制備方法

2.2.1對照品溶液的制備 分別取適量的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品、23-乙酰澤瀉醇B對照品，精密稱定，加入60%甲醇制備，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取澤瀉湯顆粒（規(guī)格：4 g/袋）適量，研細，混合均勻，精密稱取2 g，置具塞錐形瓶中，加入60%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率45 KHz）30 min，放至室溫，再稱定重量，用60%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察[3,8]

2.3.1線性 取配置好的對照品溶液，進樣不同體積的量，進樣檢測，以對照品峰面積（X）為橫坐標，對照品進樣量（Y）為縱坐標作圖，繪制標準曲線，計算回歸方程，見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.2專屬性 將澤瀉湯標準顆粒處方中澤瀉去除，即只有白術(shù)，按澤瀉湯的制備方法制備成顆粒，配制成缺澤瀉的空白陰性對照溶液。相同方法制備成缺白術(shù)的空白陰性對照溶液。將上述空白陰性對照溶液進樣檢測。結(jié)果：各空白陰性對照溶液色譜圖中，在含量測定成分的色譜峰保留時間處無其他色譜峰出現(xiàn)，專屬性良好。見圖1～2。

圖1 23-乙酰澤瀉醇B陰性對照色譜圖

圖2 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ陰性對照色譜圖

2.3.3精密度（包括重復(fù)性和中間精密度）

2.3.3.1重復(fù)性 按供試品處理方法平行處理6份，進樣10 μL測定，根據(jù)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、23-乙酰澤瀉醇B峰面積和對照品線性方程，計算白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、23-乙酰澤瀉醇B含量和RSD。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量平均值為0.597 mg/袋，RSD為1.23%；23-乙酰澤瀉醇B含量平均值為1.671 mg/袋，RSD為1.54%。

2.3.3.2中間精密度 3人處理樣品，使用同一設(shè)備測定含量，操作方法同重復(fù)性試驗，考察不同人員所測得各成分含量和RSD。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量平均值分別為0.597 mg/袋、0.593 mg/袋、0.593 mg/袋，RSD為0.39%；23-乙酰澤瀉醇B含量平均值分別為1.671 mg/袋、1.651 mg/袋、1.613 mg/袋，RSD為1.79%。

2.3.4準確度（回收率實驗）

取已知含量的澤瀉湯標準顆粒樣品6份，取樣量為1 g，加入定量的對照品溶液，按供試品處理方法制備，測定含量，計算回收率。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ回收率試驗平均回收率結(jié)果為102.18%，RSD為0.67%；23-乙酰澤瀉醇B回收率試驗平均回收率結(jié)果為100.35%，RSD為1.73%。數(shù)據(jù)列于表3～表4。

表3 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ回收率試驗測定結(jié)果

表4 23-乙酰澤瀉醇B回收率試驗測定結(jié)果

2.3.5耐用性

2.3.5.1溶液穩(wěn)定性。取同一供試品溶液分別于0～24 h進樣，測定白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和23-乙酰澤瀉醇B的峰面積并計算RSD。結(jié)果：白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的RSD為0.43%，23-乙酰澤瀉醇B為0.77%。說明24 h內(nèi)溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.5.2色譜柱柱溫的變化。實驗方法按照含量測定的供試品溶液配置方法，保持其他色譜條件不變，改變柱溫±5℃（30±5℃），測定樣品含量，考察RSD。結(jié)果：柱溫25℃白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量平均值0.587 mg/袋，RSD為1.58%，23-乙酰澤瀉醇B含量平均值為1.849 mg/袋，RSD為1.01%；柱溫35℃白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量平均值0.597 mg/袋，RSD為1.46%，23-乙酰澤瀉醇B含量平均值為1.791 mg/袋，RSD為0.83%。說明在柱溫±5℃（30±5℃）的情況下，含量檢測結(jié)果不受影響。

2.3.5.3檢測波長的變化。實驗方法按照含量測定的供試品溶液配置方法，保持其他色譜條件不變，改變檢測波長±5 nm[白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ為（222±5）nm，23-乙酰澤瀉醇B為（208±5）nm]，測定樣品含量，考察RSD。結(jié)果：白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在波長217 nm下含量平均值為0.593 mg/袋，RSD為1.43%，在波長227 nm下含量平均值為0.596 mg/袋，RSD為1.44%；23-乙酰澤瀉醇B在波長207 nm下含量平均值為2.003 mg/袋，RSD為0.52%，在波長213 nm下含量平均值為1.935 mg/袋，RSD為0.45%。說明在檢測波長±5 nm的情況下，含量檢測結(jié)果不受影響。

2.3.5.4流速的變化。實驗方法 按照含量測定的供試品溶液配置方法，保持其他色譜條件不變，改變流速為（1.0±0.1）mL/min，測定樣品含量，考察RSD。結(jié)果：流速0.9 mL/min時，內(nèi)酯Ⅲ含量平均值0.589 mg/袋，RSD為1.30%，23-乙酰澤瀉醇B含量平均值為1.975 mg/袋，RSD為0.65%；流速1.1 mL/min時，內(nèi)酯Ⅲ含量平均值0.588 mg/袋，RSD為1.28%，23-乙酰澤瀉醇B含量平均值為1.972 mg/袋，RSD為0.70%。說明在流速為（1.0±0.1）mL/min的情況下，含量檢測結(jié)果不受影響。

2.4 樣品的含量測定

取4批樣品按正文中含量測定項下供試品溶液的制備與測定方法進行制備與測定，測定結(jié)果，見表5。

表5 樣品的含量測定結(jié)果

3.討論

該含量測定方法在同一色譜條件下，利用流動相梯度洗脫的方式和DAD檢測器同時開啟2個被測成分的檢測波長，同時測定白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和23-乙酰澤瀉醇B的含量。該方法進行了多種流動相梯度洗脫條件的摸索。最終選擇乙腈-水為流動相，以及最佳的梯度洗脫條件，并且研究了不同提取溶劑（20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、甲醇）對供試品的超聲提取研究，從含測成分的色譜峰峰面積以及分離度等方面考慮，優(yōu)選60%甲醇。并且明確了色譜柱類型、流速、波長、柱溫等參數(shù)。經(jīng)過方法學(xué)驗證，此含量測定方法有良好的精密度、準確度、線性、范圍、耐用性，且專屬性無干擾完全符合要求。

綜上所述，一般中藥復(fù)方制劑對于檢測不同藥味中的不同成分，采用不同的色譜條件進行檢測。本方法采用同一色譜條件同時測定澤瀉湯標準顆粒中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和23-乙酰澤瀉醇B含量，能夠簡化供試品制備步驟、提高檢測效率、降低檢測成本。