生長激素在多柔比星誘導小鼠肝細胞損傷中的保護作用及相關機制研究

張 健，劉 維

（廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院教學部 廣東 廣州 510080）

多柔比星，是臨床常用的抗惡性腫瘤的藥物，廣泛用于多種實體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤的治療。該藥物在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時，普遍存在多種毒副作用，因此也限制了其在臨床上的應用。肝臟作為人體全身最大的代謝器官，對于人體的穩(wěn)態(tài)、新陳代謝等各個方面起著關鍵性的作用，對于藥物引起的肝毒性可能與自由基的形成和活性氧（ROS）的產(chǎn)生有關。因此，抑制氧化應激可能是治療Dox引起肝臟損傷的有效方法[1]。生長激素（GH）由生長激素細胞分泌，可促進細胞分裂和生長等。有報道表明，在病理情況下GH可以增加細胞的抗氧化能力，降低細胞中ROS的水平，增加細胞的抗氧化應激反應而發(fā)揮有效的保護作用[2]。線粒體是細胞內(nèi)產(chǎn)生能量的場所。在維持細胞生長和新陳代謝起著十分重要的作用。而自噬是人體內(nèi)重要的生理現(xiàn)象之一，可通過溶酶體降解和去除細胞內(nèi)有害的蛋白質(zhì)和受損的細胞器來提供營養(yǎng)，從而恢復代謝穩(wěn)態(tài)。有研究表明，通過誘導增加線粒體自噬，能夠?qū)寡趸瘧げ⑵鸬奖Ｗo作用[3]。自噬的過程均由一種特殊的細胞器即自噬體所介導，其可分為非選擇性和選擇性，而自噬的選擇性是由自噬受體所介導的[4]。p62是一種選擇性自噬接頭蛋白，將自噬和Keap1-Nrf2通路相關聯(lián)，其中LC3相互作用結構域（LC3 interacting region, LIR）作為選擇性自噬受體，穿梭于受損的蛋白質(zhì)、線粒體和細胞器對其進行清除，在細胞選擇性自噬過程中發(fā)揮重要的作用[5]；而KIR結構域（keap1 interacting region, KIR）參與氧化應激，與Keap1在胞質(zhì)內(nèi)形成復合體，將Keap1固定在細胞質(zhì)中，增強細胞的抗氧化應激能力[6]。Keap1/Nrf2/NQO1信號通路是目前公認的機體抵抗內(nèi)外環(huán)境氧化和有害刺激的重要防御性轉導通路。Keap1是Nfr2的負性調(diào)節(jié)因子，Nrf2的激活可通過與Keap1解耦連或與p62形成復合體，進而啟動下游保護性基因的表達，如醌氧化還原酶1（NQO1）等[7]。本文旨在探究GH對Dox誘導小鼠肝細胞損傷中發(fā)揮保護作用的相關作用機制。

1.資料與方法

1.1 實驗動物

40只C57BL/6小鼠，SPF級，12周齡，購買于斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物合格證號：SCXK（京）2019-0010，使用許可證編號：SYXK（粵）2017-0124。動物自由進食飲水，12 h明暗交替光照，環(huán)境溫度22～25℃，相對濕度50%～55%。本實驗所有操作均符合實驗動物使用及保護條例，且通過本院倫理委員會審核通過。

1.2 藥品和主要試劑

攜帶小鼠生長激素基因的重組腺相關病毒-8型（mGH-rAAV8）（廣州派真生物技術有限公司）；BCA定量試劑盒、RT-PCR引物、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594標記的山羊抗兔或抗大鼠IgG（Thermo Scientific公司）；動物RNA抽提試劑盒、DAPI染液（江蘇碧云天生物技術公司）；逆轉錄、RT-PCR試劑盒（北京全式金生物公司）；兔抗小鼠Tom20、p62、GAPDH，大鼠抗小鼠Keap1、LC3抗體（Abcam公司）；HRP標記的山羊抗兔或抗大鼠IgG二抗、ECL發(fā)光液（Proteintech公司）。

1.3 免疫組織熒光法

將4%多聚甲醛固定的肝臟制成石蠟切片。隨后進行抗原修復，用PBS漂洗后置于封閉液中，于室溫下孵育40 min，加入p62、Keap1、Tom20、LC3（1:500）一抗于4℃孵育過夜，次日PBST漂洗3次，在暗室分別加入Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594標記的二抗于室溫下孵育1 h, PBST漂洗3次，最后用DAPI染液進行復染10 min, PBS漂洗后于熒光顯微鏡下進行觀察并拍照。

1.4 實時熒光定量PCR（real time-PCR）

取上述1.3等量的肝臟，利用動物RNA抽提試劑盒，提取肝組織中的總RNA。利用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。根據(jù)試劑說明書進行實時熒光定量PCR。RTPCR引物序列見表1。以GADPH作為待測GH的內(nèi)參進行分析。所有實驗單獨重復3次。

1.5 Western blot實驗

隨機選取各組小鼠的肝臟，提取組織中的總蛋白。BCA法進行蛋白定量。取50 μg的蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳進行蛋白分離，采用濕轉法將分離的蛋白轉至PDVF膜上，5%的脫脂奶粉于室溫下孵育1 h后，分別加入p62、Keap1、Nrf2、NQO1（1:1000）的一抗，4℃搖床孵育過夜。用TBST溶液清洗，以HRP標記的二抗（1:1000）室溫孵育1 h，以TBST溶液清洗。最后均勻滴加ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照[7]。以上實驗單獨重復3次。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差表示。兩組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的Dunnett’s或Bonferroni’s多重比較進行分析；P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 GH能增加肝細胞線粒體的自噬對Dox誘導的肝臟損傷發(fā)揮保護作用

如上所述，通過增加線粒體的自噬，能夠?qū)寡趸瘧げ⑵鸬奖Ｗo作用[3]。我們運用免疫組織熒光技術對各組中肝細胞中的線粒體自噬情況進行檢測。結果顯示，與正常對照組和模型對照組相比，mGH-rAAV8低、高劑量組能夠增加肝細胞的線粒體自噬，且高劑量組的效果更為明顯，見圖1。

圖1 肝細胞線粒體自噬熒光圖

2.2 GH對Dox誘導的肝臟損傷中Keap1/Nrf2/NQO1信號通路的影響

Keap1/Nrf2/NQO1信號通路是機體抵抗內(nèi)外環(huán)境氧化等的重要防御性轉導通路[7]。我們隨機選取各組的肝臟組織，對p62、Keap1、Nrf2和NQO1表達水平進行檢測。Real time-PCR和Western blot實驗結果顯示，與非藥物治療組相比，藥物治療組中的GH表達水平顯著增高；與空白對照組和模型對照組相比，藥物治療組中p62、Keap1、Nrf2和NQO1表達顯著增高，見圖2。

圖2 （A）各組Nrf2、Keap1、p62、NQO-1表達結果，（B）各組GH mRNA表達情況，（C）各組熒光圖

從以上結果可以得出，生長激素能夠通過上調(diào)p62的表達從而增加線粒體的自噬，同時可以上調(diào)Keap1、Nrf2和NQO1表達，進而發(fā)揮對肝臟的保護作用。

3.討論

Dox是常用的抗腫瘤藥物，因其具有較多的毒副作用，故臨床使用經(jīng)常受到限制[1]。在該實驗中，從模型對照組可見，Dox能引起較為嚴重的肝臟損傷。我們通過尾靜脈注射包含GH序列的rAAV8，結果顯示，注射該藥物后能有效改善Dox誘導的肝臟損傷。

線粒體的自噬是生物體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)重要的生理現(xiàn)象[8]。p62能將自噬和Keap1-Nrf2通路相關聯(lián)[7]。如上所述，Nrf2是體內(nèi)抗氧化調(diào)節(jié)的重要蛋白。鑒于此，我們猜測GH可能是通過增加細胞p62的表達進而增強線粒體的自噬，并進而調(diào)控Keap1/Nrf2/NQO1信號通路，對Dox誘導的肝臟損傷發(fā)揮保護作用。該研究的免疫組織熒光實驗結果表明，與正常對照組和模型對照組相比，mGH-rAAV8低、高劑量組能夠增加肝細胞的線粒體自噬，且高劑量組的效果更為明顯。同時Real time-PCR和Western blot實驗結果顯示，mGH-rAAV8低、高劑量組p62、Keap1、Nrf2和NQO1表達顯著增高，且高劑量組的增高更為顯著。

綜上所述，GH保護Dox誘導的肝臟損傷可能是通過增強細胞的線粒體自噬并參與調(diào)控Keap1/Nrf2/NQO1信號通路，從而增強細胞的抗氧化應激能力來實現(xiàn)的。其具體的機制仍需進一步闡明。