外泌體治療椎間盤退變的研究進展

劉明強，陳海偉，張廣智，康學文*

1蘭州大學第二醫(yī)院骨科，蘭州 730030；2甘肅省骨與關節(jié)疾病重點實驗室，蘭州 730030

下腰痛(low back pain，LBP)是一種常見疾病，全世界約80%的人在其一生中出現過LBP的癥狀，引起LBP的原因主要有脊柱病變、軟組織病變、神經病變及非特異性疼痛等。研究發(fā)現，椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)引起的椎間盤突出和椎管狹窄可能是導致LBP的最主要原因，給家庭和社會帶來了巨大的經濟負擔[1]。椎間盤組織由中心膠凍狀的髓核、外圍的纖維環(huán)和椎體上下緣的軟骨終板(cartilage endplate，CEP)組成。髓核位于椎間盤的中心位置，主要由富含Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、彈性蛋白的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)組成，是椎間盤承載和緩沖壓力載荷的重要功能成分[2]，在IDD過程中髓核最先發(fā)生改變。目前對IDD的治療僅可緩解患者的臨床癥狀，不能延緩或逆轉IDD的進程。因此，尋找新的更有效的IDD治療方法一直是該領域的研究熱點[3-4]。

近年來，隨著對干細胞療法、基因靶向治療及組織工程等再生醫(yī)學領域的深入研究，外泌體對骨科疾病的治療價值越來越受到關注[5-7]。來源于干細胞及其他細胞的外泌體是一類可以包裹多種生物活性物質如蛋白質、核酸等的細胞外囊泡[8]。外泌體容易獲得，無免疫原性且與靶細胞具有獨特的親和性，可參與機體多種病理生理過程，如細胞凋亡、異常血管生成、炎癥反應、凝血反應，以及蛋白質、脂質和RNA等物質的轉移，從而調節(jié)細胞通信和表觀遺傳修飾，目前已被應用于IDD的重塑研究[9]。本文就不同細胞來源外泌體的生物學特性和功能及其在IDD治療中的作用及機制進行綜述，以期為后續(xù)研究提供新的思路。

1 外泌體的生物學特性及功能

幾乎所有細胞都可在正常和異常狀態(tài)下釋放細胞外囊泡到細胞外空間。細胞外囊泡是被磷脂雙層膜包圍的小顆粒，根據其生物發(fā)生途徑、大小、蔗糖密度梯度、脂質組成、沉降力和內容物可分為微囊泡、凋亡小體與外泌體[10]。微囊泡和凋亡小體主要通過細胞膜出芽的方式形成。外泌體來源于細胞內，主要是由細胞膜內陷形成的多泡體(multivesicular bodies，MVBs)與細胞膜融合，并向外釋放其包含的腔內囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)，這些被釋放到細胞外的ILVs即外泌體[11-12]。三種細胞外囊泡的主要特征如表1所示。

表1 細胞外囊泡的分類及主要特征Tab.1 Classification and main characteristics of extracellular vesicles

外泌體是具有脂質雙層膜結構的參與細胞間通訊的納米級膜狀囊泡，呈膜性扁平狀，由干細胞等多種類型的細胞分泌，可通過超速離心、密度梯度離心、聚乙二醇沉淀等方法提取，并可用納米粒子跟蹤分析、動態(tài)光散射、流式細胞術等方法進行鑒定[19]。外泌體廣泛存在于血液、唾液、精液、滑液、羊水、母乳及體外的細胞培養(yǎng)基中，可通過有效轉運生物活性蛋白、信使核糖核酸(mRNA)和微核糖核酸(miRNA)在細胞間通訊和組織再生調節(jié)中發(fā)揮重要作用[20]。

外泌體的功能主要取決于其內容物，不同細胞來源的外泌體包裹的蛋白質、脂質、核酸、細胞因子等生物活性成分的含量和種類不同，其中脂質、蛋白質及核酸是外泌體中的主要功能成分。脂質膜可促進受體細胞對外泌體的吸收，并阻止其內容物在運輸過程被損壞，如保護miRNA免受RNA酶的降解，參與調控靶細胞的信息傳遞。外泌體中包含一系列蛋白質，如四次跨膜蛋白、熱休克蛋白及與外泌體來源相關的Tetraspanins蛋白等，這些蛋白可參與膜運輸及融合，并可作為表面標志物用于鑒定體外外泌體[21]。外泌體可轉運核酸，如mRNA、非編碼RNA，成熟的miRNA通過堿基互補配對原則與靶基因mRNA結合可抑制靶基因的轉錄后翻譯。此外，外泌體還可誘導干細胞分化、促進自噬、促進血管生成及調節(jié)免疫功能。綜上，外泌體的主要功能可能是通過保護并運輸其內容物而介導細胞間的通訊[22]。

2 外泌體與IDD的關系

隨著人口的老齡化，IDD已成為臨床多發(fā)疾病，且近年來其發(fā)病呈現年輕化趨勢。IDD是導致中老年人腰腿疼痛的主要原因之一，但其具體發(fā)病機制仍不清楚，是當前臨床亟待解決的一大難題?，F有的研究表明，IDD的發(fā)病機制與炎性因子的累積、ECM的異常分解代謝、細胞凋亡等關系密切[23]。外泌體作為細胞間相互調控的囊泡，主要通過其內容物調控基因的表達及細胞功能，從而延緩甚至逆轉IDD的發(fā)生與發(fā)展。

Lu等[24]將來源于骨髓間充質干細胞的外泌體與退變的髓核細胞共培養(yǎng)發(fā)現，隨著共培養(yǎng)時間延長，細胞增殖明顯增加；蛋白聚糖及Ⅱ型膠原等ECM的表達量與共培養(yǎng)時間呈正比，退變相關基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表達量隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸下降，表明骨髓間充質干細胞來源的外泌體可促進髓核細胞增殖及維持ECM平衡。

髓核細胞過度凋亡是IDD的主要病理特征。將尿液干細胞來源的不同濃度的外泌體與壓力載荷誘導的髓核細胞共培養(yǎng)，采用Western blotting及TUNEL染色檢測細胞凋亡情況，結果顯示，髓核細胞凋亡率隨外泌體濃度的增加而降低[25]。Luo等[26]分別用正常與退變終板軟骨干細胞來源的外泌體處理過氧化氫(H2O2)誘導的髓核細胞，結果顯示，與退變終板軟骨干細胞來源的外泌體比較，正常終板軟骨干細胞來源的外泌體明顯降低了凋亡蛋白cleaved caspase-3和Bax的表達以及TUNEL染色陽性率，增加了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。Zhang等[27]的研究發(fā)現，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)與外泌體共處理組髓核細胞中NLRP3、caspase-1和cleaved GSDMD的表達水平明顯低于脂多糖單獨誘導組。上述研究結果提示外泌體可減輕髓核細胞的凋亡反應。

此外，外泌體在治療IDD的其他方面也發(fā)揮了重要作用。例如干細胞來源的外泌體可降低CEP細胞凋亡蛋白caspase-3、7、9及鈣化相關蛋白runt相關轉錄因子2(Runx2)的表達，即外泌體可抑制CEP細胞的凋亡和鈣化反應[22]。脊索細胞來源的外泌體可抑制臍靜脈內皮細胞的遷移及血管管道的形成，且抑制效果與外泌體的給藥劑量呈正比；將非退變纖維環(huán)細胞外泌體與人臍靜脈內皮細胞共培養(yǎng)，結果顯示外泌體可降低內皮細胞的遷移速度。由此可見，外泌體可抑制椎間盤組織中異常血管再生，延緩IDD的發(fā)生[28-29]。干細胞來源的外泌體減少了H2O2誘導的髓核細胞炎性因子[一氧化氮合酶(iNOS)、白細胞介素-6(IL-6)]的表達，提示外泌體可減輕炎癥反應[30]。

IDD的主要特征是異常應力、炎癥反應等不利因素的刺激引起髓核細胞數量減少和ECM降解。外泌體通過促進髓核細胞增殖，抑制髓核細胞凋亡/焦亡、椎間盤異常血管增生以及炎性因子的產生而增加有活性髓核細胞的數量，改善椎間盤的炎癥微環(huán)境。因此，外泌體可能是延緩甚至逆轉IDD的潛在選擇。

3 外泌體治療IDD的潛在機制

3.1 促進干細胞向類軟骨樣髓核細胞轉化 近年來，促進干細胞向類軟骨樣髓核細胞轉化是IDD治療研究的一個重要方向。將正常髓核細胞來源的外泌體與干細胞共培養(yǎng)，檢測干細胞中蛋白聚糖、Ⅱ型膠原基因和蛋白的表達，發(fā)現干細胞中蛋白聚糖和Ⅱ型膠原等ECM的表達量與共培養(yǎng)時間呈正比，即共培養(yǎng)時間越長，ECM的表達量越多，提示髓核細胞來源的外泌體可誘導干細胞向類軟骨樣髓核細胞分化，從而促進有活性的髓核細胞數量增加，維持ECM的穩(wěn)態(tài)[24,31-32]。

3.2 抑制炎癥反應 研究發(fā)現，炎性小體可通過增加IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性因子的表達來誘導MMP、解聚蛋白樣金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTs)的產生而水解蛋白聚糖、Ⅱ型膠原等ECM成分，進而參與IDD的病理過程[33]。外泌體可明顯抑制炎癥反應及炎性小體的形成。Xia等[30]的研究發(fā)現，干細胞來源的外泌體與H2O2共處理組炎性因子環(huán)氧化酶-2(COX-2)、iNOS和炎性小體TXNIP-NLRP3的蛋白和mRNA表達水平高于空白對照組，低于H2O2單獨處理組，提示干細胞來源的外泌體可通過抑制炎性小體的形成來發(fā)揮抗炎作用，從而下調ECM降解蛋白酶的表達，減緩ECM的分解代謝反應，維持ECM的穩(wěn)態(tài)，延緩IDD的進程。

3.3 抑制細胞凋亡、促進細胞增殖 IDD主要是因細胞死亡導致髓核細胞數量減少及ECM降解，異常應力、炎癥反應、內質網應激等不利因素刺激可引起細胞死亡，而凋亡是髓核細胞死亡的主要形式。因此，IDD的治療應以抑制髓核細胞凋亡、促進細胞增殖為主。

錯誤折疊蛋白質的累積、Ca2+的消耗及氧化還原狀態(tài)的改變可介導內質網過度應激反應，引起細胞凋亡。研究發(fā)現，在壓力負荷或糖基化終末產物誘導的髓核細胞凋亡模型中加入干細胞來源的外泌體后，內質網應激相關蛋白(GRP78、GRP94)、激活作用轉錄因子(ATF6)、內質網應激的凋亡調節(jié)因子(CHOP)表達降低，未折疊蛋白反應(UPR)的分支蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)、肌醇依賴性激酶1α(IRE1α)的磷酸化水平降低，而蛋白激酶B(AKT)和細胞信號調節(jié)激酶(ERK)的磷酸化水平升高，髓核細胞凋亡相關蛋白caspase-3、12的表達明顯降低，提示干細胞來源的外泌體可通過激活AKT、ERK信號轉導通路來抑制內質網應激誘導的細胞凋亡[25,34]。

3.4 通過miRNA調控椎間盤組織修復 miRNA是一類長度不超過20個堿基的非編碼RNA，是調節(jié)基因表達的關鍵轉錄后抑制因子。miRNA主要是與靶基因mRNA的3'UTR通過堿基互補配對原則結合抑制轉錄后翻譯來進行基因表觀遺傳學修飾，沉默靶基因的表達或調控多個疾病相關信號轉導通路[35]。骨髓、胎盤來源的外泌體可改變椎間盤組織中多種miRNA的表達水平，尤其是一些調節(jié)細胞凋亡、炎癥反應的關鍵miRNA分子，是外泌體應對組織損傷和修復的有效調節(jié)因子。多項研究發(fā)現，miRNA在延緩IDD的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，miRNA的表達譜與髓核細胞的增殖、凋亡，炎癥反應，以及ECM重塑等明顯相關；但miRNA在椎間盤組織間隙容易被降解，而外泌體的遞送可通過保護miRNA不被降解來改善miRNA的短期穩(wěn)定性[36]。因此，不同細胞來源的外泌體包裹的miRNA可通過調節(jié)基因表達和細胞功能參與椎間盤的修復及重塑，是外泌體治療IDD的潛在機制[37]。具體如表2所示。

表2 外泌體中miRNA在IDD治療中的研究Tab.2 Studies on miRNA in exosomes in the treatment of intervertebral disc degeneration

Zhang等[38]的研究發(fā)現，自噬激活髓核細胞來源外泌體包裹的miR-27a可與MMP13靶向結合而降低MMP1、3、9、13以及ADAMTs 4、5基因的表達，增加蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白的表達以維持ECM的穩(wěn)態(tài)。Zhu等[40]發(fā)現，骨髓間充質干細胞來源的外泌體可顯著減輕ECM降解及髓核細胞凋亡，且主要是外泌體中miR-532-5p通過下調RASSF5基因的表達來實現的；雙重熒光素酶報告實驗分析結果顯示，miR-532-5p含有野生型RASSF5基因3'UTR的互補結合位點，表明野生型RASSF5是miR-532-5p的直接靶基因。Zhu等[37]研究發(fā)現，骨髓間充質干細胞來源外泌體中的miR-142-3p可通過下調混合譜系激酶3(MLK3)的表達來調控髓核細胞的凋亡和炎癥反應，顯著降低TNF-α、IL-6、IL-8、IL-12等炎性因子的表達及髓核細胞凋亡率；通過miRNA靶標分析工具(TargetScan)分析發(fā)現，miR-142-3p可與野生型MLK3的3'UTR互補結合；進一步研究發(fā)現，外泌體中的miR-142-3p可通過靶向結合MLK3而降低IL-1β誘導的p38、JNK、ERK的磷酸化水平，即外泌體中miR-142-3p通過靶向結合MLK3來抑制MAPK信號通路的激活，從而延緩IDD的發(fā)生與發(fā)展。

Cheng等[41]的研究發(fā)現，間充質干細胞來源外泌體中的miR-21可與PTEN靶向結合并下調其表達，從而抑制TNF-α誘導的髓核細胞凋亡，進一步研究發(fā)現，沉默PTEN基因后磷酸化的AKT表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達上調，而凋亡相關蛋白Bax、cleaved caspase-3的表達明顯下調，提示外泌體包裹miR-21可靶向抑制PTEN基因的表達，從而激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-AKT)信號轉導通路，進而抑制髓核細胞的凋亡。

此外，Xie等[22]使用H2O2誘導終板軟骨細胞建立退變模型發(fā)現，與H2O2單獨誘導組相比，使用間充質干細胞來源的外泌體與H2O2誘導的終板軟骨細胞共處理，可明顯下調終板軟骨干細胞凋亡相關蛋白caspase-3、7、9及鈣化相關蛋白Runx2和BMP-2的表達；生物信息學分析發(fā)現，外泌體中miR-31-5p水平明顯升高，且可靶向結合并抑制ATF6基因的表達，提示外泌體中miR-31-5p通過下調ATF6的表達來減輕終板軟骨細胞的凋亡和鈣化。

綜上，不同細胞來源的外泌體主要是通過其包裹的miRNA與相應的靶基因結合而抑制炎癥、凋亡相關基因的表達，進而發(fā)揮延緩IDD的作用，提示外泌體中包裹的miRNA可能是其發(fā)揮保護作用的潛在機制。外泌體作為一種潛在的促進椎間盤修復的細胞外囊泡，其作用機制可能是包含的內容物通過調節(jié)靶基因及相關信號通路來發(fā)揮抗炎、抗凋亡、維持ECM穩(wěn)態(tài)的作用，然而具體調節(jié)機制尤其是外泌體促進髓核細胞增殖的機制仍不明確，仍需進一步研究。

4 總結與展望

多項研究表明，外泌體參與并減輕了IDD的多種病理生理過程，但其延緩或治療IDD的作用機制仍不明確。盡管外泌體可通過其內容物進行細胞間通訊和表觀遺傳修飾，調節(jié)髓核細胞的功能，從而恢復有活性的髓核細胞數量，維持ECM穩(wěn)態(tài)，減輕炎癥反應，但其應用于IDD的治療仍存在諸多挑戰(zhàn)。如外泌體提純、靶向運輸、給藥劑量、給藥方式，以及外泌體的細胞來源、生長狀態(tài)和培養(yǎng)條件等均可影響外泌體的作用；椎間盤作為體內最大的無血管組織，承載著持續(xù)的壓力負荷，椎間盤組織中高滲、低氧、低pH、低營養(yǎng)的微環(huán)境不利于髓核細胞的增殖和外泌體的穩(wěn)定[42]；一些外泌體可能通過其包裹的非編碼RNA沉默髓核細胞中有利基因的表達而加速IDD的發(fā)生[43]。然而隨著對椎間盤及外泌體研究的不斷深入，外泌體在IDD治療中的應用前景將更加廣闊。