應(yīng)對(duì)ESKAPE病原菌醫(yī)院感染的新興抗菌策略研究進(jìn)展

萬(wàn)美辰，仇珺，蒙萌，馬雨軒，顧俊婷，焦凱，牛麗娜*

1軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/口腔疾病國(guó)家臨床醫(yī)學(xué)研究中心/陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，西安 710032；2軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/口腔疾病國(guó)家臨床醫(yī)學(xué)研究中心/陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，西安 710032；3軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/口腔疾病國(guó)家臨床醫(yī)學(xué)研究中心/陜西省口腔疾病臨床研究中心/空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院口腔黏膜科，西安 710032

ESKAPE病原菌即屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌屬(Enterococcus faecium，Staphylococcus aureus，Klebsiella pneumonia，Acinetobacter baumannii，Pseudomonas aeruginosa，Enterobacter species，縮寫ESKAPE)，是醫(yī)院感染中最常見(jiàn)的條件致病菌。ESKAPE病原菌突變能力強(qiáng)，對(duì)目前臨床使用的多種抗菌藥物均能產(chǎn)生耐藥性，增加了耐藥菌感染的治療難度，且使耐藥菌感染治療失敗所致的病死率明顯增高[1]。預(yù)計(jì)在2050年，全球范圍內(nèi)因耐藥菌感染導(dǎo)致的死亡人數(shù)將會(huì)上升到百萬(wàn)級(jí)別[2]。本文綜述了后抗生素時(shí)代ESKAPE病原菌產(chǎn)生的抗生素問(wèn)題，以及這一系列問(wèn)題帶來(lái)的思考和警示，并詳述了應(yīng)對(duì)ESKAPE病原菌的新興策略，包括抗毒力策略、抑制生物膜形成、抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)、植物來(lái)源的抗菌制劑、納米藥物輸送系統(tǒng)(nanoparticle drug delivery system，NDDS)、光動(dòng)力抗菌療法及噬菌體療法等。

1 概 述

ESKAPE病原菌感染常導(dǎo)致較高的病死率，且其治療費(fèi)用高昂，往往帶來(lái)較重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心估測(cè)，在美國(guó)，每年由ESKAPE病原菌導(dǎo)致的感染超過(guò)200萬(wàn)人次，至少造成23 000人死亡[3]。同時(shí)，美國(guó)應(yīng)對(duì)5種病原菌(金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌)的成本約為29億美元/年[4]。對(duì)于一些中、低收入的發(fā)展中國(guó)家來(lái)說(shuō)，形勢(shì)則更加嚴(yán)峻。2000－2015年，全球抗生素消耗量增長(zhǎng)了65%，主要是由中低收入國(guó)家推動(dòng)的[5]。

掌握ESKAPE病原菌的某些遺傳特性是解決這一系列問(wèn)題的重要策略之一。為逃逸抗生素的作用，細(xì)菌可產(chǎn)生兩種不同類型的耐藥性：先天性耐藥和獲得性耐藥。先天性耐藥是指某些細(xì)菌天生對(duì)某些抗菌藥物不敏感。其中，鮑曼不動(dòng)桿菌能夠產(chǎn)生碳青霉烯酶，這類酶可以水解碳青霉烯類抗生素的β-內(nèi)酰胺酶[6]；銅綠假單胞菌的耐藥性則更為復(fù)雜，可能與酶的產(chǎn)生、膜通透性及靶位的改變、生物膜的合成及適應(yīng)性耐藥的產(chǎn)生等有關(guān)[7]。而腸桿菌科、多耐藥銅綠假單胞菌、多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌可產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，這種β-內(nèi)酰胺酶能夠破壞β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物(如青霉素類、頭孢菌素類)的β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使該類藥物失去抗菌性能。獲得性耐藥的破壞性則更強(qiáng)，它是指細(xì)菌借助于可移動(dòng)元件(如接合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、插入序列和整合子)獲得耐藥相關(guān)基因[8]。ESKAPE病原菌突變能力強(qiáng)，繁殖速度快，其產(chǎn)生的適應(yīng)性基因突變可通過(guò)質(zhì)粒迅速傳播。其中，肺炎克雷伯菌臨床分離株通常攜帶多樣性的可接合性質(zhì)粒，使耐藥性可以通過(guò)接合作用在菌株間甚至不同菌種間傳播[9]。

另外，一些客觀原因也起著重要作用。其中，抗生素的不規(guī)范使用一直以來(lái)是全球范圍內(nèi)較為公認(rèn)又難以解決的問(wèn)題之一?？股胤N類選擇不當(dāng)、劑量不足，患者對(duì)抗菌治療的依從性差等，均會(huì)增加抗生素的耐藥性。其原因可能在于學(xué)界對(duì)于ESKAPE病原菌耐藥性產(chǎn)生機(jī)制的理解尚不全面以及不平衡的經(jīng)濟(jì)因素制約了新藥的研發(fā)進(jìn)度。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2007－2009年美國(guó)門診共開(kāi)具4000萬(wàn)例抗生素處方，其中2700萬(wàn)例(67.5%)被證明是不必要的[10]。我國(guó)的情況也不容樂(lè)觀。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上80%的β-內(nèi)酰胺類抗生素及90%的氨基糖苷類抗生素均產(chǎn)自我國(guó)，且我國(guó)抗生素人均年消費(fèi)量約為138 g[11]。世界衛(wèi)生組織的調(diào)查顯示，在我國(guó)門診感冒患者中，抗生素使用率約為75%，住院患者抗生素使用率為80%，而對(duì)于外科手術(shù)患者來(lái)說(shuō)，抗生素使用率高達(dá)95%，這些數(shù)據(jù)均高于國(guó)際水平[12]。

抗生素的研發(fā)投入成本高、周期長(zhǎng)、失敗率高、投資回報(bào)率低。據(jù)估計(jì)，在全球范圍內(nèi)，平均每種抗生素的研發(fā)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)11.8年，需耗資15億美元[13]。這導(dǎo)致多數(shù)醫(yī)藥企業(yè)不愿研發(fā)抗生素類藥物。泰地唑利作為一種可有效應(yīng)對(duì)ESKAPE病原菌的 唑烷酮類抗生素，就因生產(chǎn)成本過(guò)高而限制了其推廣。除產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的成本外，因生產(chǎn)抗生素而造成的環(huán)境污染也成為抗菌道路上的又一阻礙。制藥廢水中的大部分為抗生素生產(chǎn)廢水，且此類廢水中的重鉻酸鹽指數(shù)(CODcr，即采用重鉻酸鉀作為氧化劑測(cè)定出的化學(xué)耗氧量)高、生物毒性高、色度高、pH波動(dòng)較大，治理難度大[14]。2014－2019年應(yīng)對(duì)ESKAPE病原菌的抗菌藥物發(fā)展迅速，已被批準(zhǔn)的新藥[15-23]見(jiàn)表1。但是，這些關(guān)于ESKAPE病原菌的相關(guān)報(bào)道目前主要集中在實(shí)驗(yàn)室研究或臨床前研究階段，仍需對(duì)此類藥物的安全性及有效性進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

表1 2014－2019年批準(zhǔn)的應(yīng)對(duì)ESKAPE病原菌的新藥Tab.1 New drugs approved from 2014 to 2019 for combating ESKAPE pathogens

傳統(tǒng)方法應(yīng)對(duì)耐藥菌感染耗時(shí)、耗材，效率低。近年來(lái)，一些應(yīng)對(duì)ESKAPE病原菌的新興策略不斷出現(xiàn)，逐漸成為臨床試驗(yàn)及抗菌治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)。學(xué)界正試圖通過(guò)這些潛在新興抗菌策略在一定程度上緩解耐藥菌給醫(yī)院感染帶來(lái)的壓力。

2 抗毒力策略

毒力是病原菌致病的主導(dǎo)因素，尤其是在慢性感染中發(fā)揮著重要作用?？苟玖Σ呗阅軌虬邢蚋蓴_細(xì)菌的重要毒力因子或抑制毒力相關(guān)性狀的表達(dá)，且不會(huì)抑制其他益生菌的活性?？苟玖λ幬锏氖褂糜型麥p少?gòu)V譜抗菌藥物的用量，并降低耐藥菌株出現(xiàn)的頻率。

2.1 黏附、定植及侵襲抑制劑 細(xì)菌進(jìn)入宿主后，必須傳播到特定部位才能導(dǎo)致感染的發(fā)生。因此，掌握細(xì)菌黏附、定植的機(jī)制對(duì)于實(shí)現(xiàn)抗毒力策略至關(guān)重要。例如，菌毛是大腸埃希菌黏附在宿主特定位點(diǎn)的特殊結(jié)構(gòu)，其多樣性可能與致病過(guò)程中細(xì)菌的組織趨向性及物種特異性相關(guān)，這一靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)為抗耐藥菌感染的治療提供了新思路。Dang等[24]發(fā)現(xiàn)，菌毛抑制劑(pilicides)可通過(guò)Chaperone-Usher途徑抑制1型黏附性菌毛的裝配，使菌毛無(wú)法在細(xì)菌表面表達(dá)，從而抑制細(xì)菌的黏附，為抑制大腸桿菌在宿主細(xì)胞上的附著提供了可能性。同時(shí)，研究表明，這些菌毛分子也是肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌抗感染治療的目標(biāo)靶點(diǎn)之一[25]。然而，菌毛容易發(fā)生基因突變，這將會(huì)給菌毛相關(guān)抗菌藥物的研發(fā)帶來(lái)一定挑戰(zhàn)。

2.2 抑制毒力基因表達(dá) 銅綠假單胞菌能夠活躍表達(dá)外毒素A(toxin exotoxin A，ETA)、T3SS等毒力因子。其中，T3SS在多種病原菌中均可穩(wěn)定表達(dá)，因此T3SS抑制劑可能對(duì)多細(xì)菌感染的臨床治療有效。目前，已研發(fā)出抑制銅綠假單胞菌ETA的分子——1,8-萘二甲酰亞胺(1,8-naphthalimide，NAP)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NAP是抑制銅綠假單胞菌ETA表達(dá)最有潛力的藥物之一。然而，NAP較低的溶解度限制了其體內(nèi)活性[26]。相關(guān)證據(jù)表明，銅綠假單胞菌毒力因子的表達(dá)與組氨酸激酶?jìng)鞲衅鹘M成的雙組分系統(tǒng)(two-component systems，TCS)相關(guān)。在燒傷患者創(chuàng)面提取的銅綠假單胞菌分離物中加入TCS抑制劑PA14后，試驗(yàn)菌株的毒力顯著下降[27]。細(xì)菌活性酶是另一種病原菌毒力相關(guān)因子。細(xì)菌活性酶抑制劑ClpP(caseinolytic mitochondrial matrix peptidase proteolytic subunit)是一種ATP依賴的蛋白水解酶，其誘導(dǎo)的蛋白水解可在不殺死病原菌的條件下使細(xì)菌失去毒力，有研究發(fā)現(xiàn)ClpP可有效作用于金黃色葡萄球菌，使其失去致病性[28]。

3 抑制生物膜形成

生物膜是被胞外大分子包裹的有組織的細(xì)菌群體。它作為細(xì)菌在宿主中生存和傳播的重要機(jī)制，能夠?qū)⒕w包裹在生物膜內(nèi)，使其免于暴露在抗生素的作用下，從而增加耐藥菌對(duì)傳統(tǒng)抗菌藥物的耐受能力。因此，能夠合成生物膜的細(xì)菌造成的臨床感染具有更加頑固的耐藥性[29]。

生物膜的形成及擴(kuò)散是一個(gè)受基因和環(huán)境高度調(diào)控的過(guò)程。其中，群體效應(yīng)(quorum sensing，QS)系統(tǒng)作為主要調(diào)節(jié)因子，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞密度依賴性基因的表達(dá)，抵抗環(huán)境中的不利因素，調(diào)控菌體的群體行為。銅綠假單胞菌擁有復(fù)雜的包含多個(gè)靶點(diǎn)的QS系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，精密調(diào)控著細(xì)菌毒力基因的表達(dá)。干擾銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)，不僅能夠抑制銅綠假單胞菌毒力因子的生成，有助于機(jī)體通過(guò)自身免疫系統(tǒng)清除致病菌，同時(shí)也可抑制生物膜的形成，從而增強(qiáng)抗菌藥物的作用效果，有望緩解銅綠假單胞菌耐藥性的產(chǎn)生[30]。目前已發(fā)現(xiàn)了幾種QS抑制劑，包括假單胞菌喹諾酮信號(hào)通路阻滯劑、丁子香酚、阿司匹林、布洛芬、ZnO納米顆粒及吲哚美酰亞胺[30]等。同時(shí)，一些已用于臨床的藥物也具有潛在的QS抑制活性：部分大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(如阿奇霉素)可通過(guò)抑制銅綠假單胞菌QS活性而降低其毒力因子的表達(dá)；氨溴索可破壞銅綠假單胞菌生物被膜；抗寄生蟲藥物氯硝柳氨可明顯抑制銅綠假單胞菌毒力因子的合成及生物被膜的形成[31]。一些體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，抗生物膜藥物與抗生素聯(lián)合使用可靶向作用于ESKAPE病原菌的生物膜，并增強(qiáng)抗生素的作用效能。其中，碳霉素能破壞鮑曼不動(dòng)桿菌形成的生物膜，并可增強(qiáng)左氧氟沙星對(duì)生物膜內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌的清除作用；阿奇霉素與亞胺培南聯(lián)合使用可下調(diào)肺炎克雷伯菌luxS基因的表達(dá)，從而進(jìn)一步抑制生物膜的活性[32]。

4 抗菌肽

AMPs是由機(jī)體特定基因編碼并經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的多肽，普遍存在于動(dòng)物、植物和微生物中，是自然界生物非常重要的免疫防御體系，可防御入侵的病原菌并增強(qiáng)免疫反應(yīng)，故又稱為宿主防御肽。AMPs具有廣泛的抗菌特性，其藥效動(dòng)力學(xué)有別于傳統(tǒng)抗生素，且其導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的可能性較低。目前已有大量AMPs成為新型抗菌治療策略或其補(bǔ)充治療的潛在候選藥物。

4.1 作用機(jī)制及耐藥性 AMPs具有多重殺傷機(jī)制，其中最重要的一點(diǎn)在于其對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞。帶正電荷的AMPs可通過(guò)靜電吸附作用黏附至帶負(fù)電荷的細(xì)菌胞膜脂質(zhì)上，使細(xì)菌膜通透性改變、膜功能喪失并通過(guò)膜干擾殺死細(xì)菌[33]。一些非膜干擾型AMPs則以抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，使關(guān)鍵酶失活及干擾細(xì)菌細(xì)胞膜及細(xì)胞壁合成的方式發(fā)揮抗菌作用[34-36]。AMPs因具有廣泛的抗菌活性及抗炎作用，可有效應(yīng)對(duì)嚴(yán)重皮膚屏障破壞導(dǎo)致的多耐藥菌感染，促進(jìn)傷口恢復(fù)，有助于長(zhǎng)期慢性感染傷口的愈合[37-38]。因此，AMPs被認(rèn)為是治療皮膚及軟組織感染的理想方案之一。

4.2 作為備選藥物的AMPs 哺乳動(dòng)物來(lái)源的AMPs一度成為新藥研發(fā)的熱點(diǎn)之一。防御素和LL-37是由哺乳動(dòng)物中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞表達(dá)的AMPs。其中，防御素由一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)域和雙鏈反平行β折疊結(jié)構(gòu)域組成，而LL-37是具有兩親性α螺旋結(jié)構(gòu)的線性肽鏈，二者對(duì)ESKAPE病原菌均具有選擇性和穩(wěn)定性，現(xiàn)已投入工業(yè)生產(chǎn)。在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)及銅綠假單胞菌所致的小鼠肺囊性纖維化模型中，恒河猴θ防御素-1氣霧劑表現(xiàn)出明顯的抗菌和免疫調(diào)節(jié)活性，相關(guān)臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中[39]。

細(xì)菌素是一種由細(xì)菌核糖體合成的AMPs，可靶向調(diào)控病原菌生物膜的形成及其群體效應(yīng)。羊毛硫作為Ⅰ類細(xì)菌素，對(duì)多耐藥革蘭陽(yáng)性菌尤其是MRSA、耐萬(wàn)古霉素中間金黃色葡萄球菌和耐萬(wàn)古霉素的糞腸球菌等均具有抗菌活性[40]。目前，已有3種羊毛硫抗生素NAI-107[41]、Mu114012[42]和NVB302[43]進(jìn)入臨床前研究，且發(fā)現(xiàn)它們與傳統(tǒng)抗生素聯(lián)合使用時(shí)抗菌效能更高。其中，NAI-107與多黏菌素聯(lián)合應(yīng)用治療鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌及銅綠假單胞菌感染具有較好的效果[44]。

環(huán)狀A(yù)MPs可以防止外源肽酶的水解作用。目前可用于臨床的環(huán)狀A(yù)MPs包括多黏菌素、短桿菌肽、酪氨酸、桿菌肽和達(dá)托霉素等。其中，多黏菌素包括多黏菌素B和黏菌素，二者均為小的脂肽分子，已成為多耐藥銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯菌引起感染的最后防線[45]。此外，大環(huán)肽類藥物可有效應(yīng)對(duì)革蘭陰性ESKAPE病原菌。G0775是一種大環(huán)脂肽類的衍生物，通過(guò)非典型細(xì)菌外膜滲透機(jī)制，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均對(duì)革蘭陰性ESKAPE病原菌顯示出一定活性[46]。

近年來(lái)，工業(yè)生產(chǎn)的AMPs成為新的研究熱點(diǎn)。研究表明，帶正電荷和疏水基團(tuán)的AMPs類似物對(duì)ESKAPE病原菌的抗菌活性較為顯著，其靈活的骨架也為關(guān)鍵基團(tuán)的化學(xué)修飾和編輯提供了可能性。其中，胍基官能化聚碳酸酯是一種可生物降解的合成大分子，在小鼠感染模型中，其對(duì)多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和MRSA均具有較好的療效，且毒性可忽略不計(jì)[47]。有兩種具有兩親性結(jié)構(gòu)的帶正電荷的AMPs(WLBU2、WR12)對(duì)ESKAPE臨床分離株具有顯著抗菌活性。其中，WLBU2可抑制銅綠假單胞菌在氣道上皮形成生物膜，且對(duì)氣道上皮細(xì)胞無(wú)毒性[48]。結(jié)構(gòu)納米工程化抗菌肽聚合物(structurally nanoengineered antimicrobial peptide polymers，SNAPPs)是指由賴氨酸和纈氨酸殘基組成的星形肽聚合物納米顆粒，具有穩(wěn)定的單體分子結(jié)構(gòu)，可以長(zhǎng)期維持有效濃度。目前已有一些SNAPPs在體外實(shí)驗(yàn)中顯示出較高的治療指數(shù)[49]。然而，在添加動(dòng)物血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，觀察到SNAPPs的抗菌活性有所降低?？梢?jiàn)，研發(fā)出能夠在生理?xiàng)l件下保持較高活性的抗菌肽尤為重要。

工業(yè)生產(chǎn)的單克隆抗體(monoclonal antibodys，mAbs)也是一類具有顯著抗菌效能的AMPs。mAbs的作用具有特異性，發(fā)生交叉耐藥的可能性較小，也不會(huì)損害體內(nèi)的有益菌群。它能夠靶向作用于細(xì)菌抗原表位(如金黃色葡萄球菌的514G3，銅綠假單胞菌的MEDI3902)，通過(guò)增強(qiáng)抗體依賴性的細(xì)胞吞噬和(或)補(bǔ)體介導(dǎo)的殺菌活性、非免疫系統(tǒng)依賴性細(xì)菌殺滅機(jī)制，提高細(xì)菌清除率[50]。另外，一些mAbs對(duì)多種可溶性外毒素具有一定活性，可識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞表面的靶點(diǎn)(如金黃色葡萄球菌的MEDI4893、ASN100、Salvecin)，并與其產(chǎn)生的外毒素特異性結(jié)合，繼而中和毒素，抑制其對(duì)宿主細(xì)胞的毒性。mAbs具有較長(zhǎng)的半衰期，不僅可減少單位時(shí)間內(nèi)的給藥次數(shù)，又能以類似“疫苗”的作用預(yù)防耐藥菌感染。但是，mAbs在體內(nèi)的作用可受宿主免疫功能的影響，因此其在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及藥效學(xué)過(guò)程是復(fù)雜、非線性的。在過(guò)去的5年中，已開(kāi)展過(guò)5項(xiàng)關(guān)于mAbs的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)，其中3種mAbs抗菌產(chǎn)品獲得了FDA批準(zhǔn)，但均不是針對(duì)ESKAPE病原菌的。值得欣慰的是，目前至少有9種與ESKAPE病原菌相關(guān)的mAbs正在開(kāi)展臨床試驗(yàn)，其中5種與金黃色葡萄球菌相關(guān)，3種與銅綠假單胞菌相關(guān)，1種與大腸埃希菌相關(guān)[51]。

AMPs作為一種新興的抗菌策略，近年來(lái)的確展現(xiàn)出了一些令人欣喜的數(shù)據(jù)，但是，關(guān)于AMPs的大量研究仍停留在體外實(shí)驗(yàn)階段，僅少數(shù)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段。由于體外環(huán)境無(wú)法反映先天性免疫的復(fù)雜性，因此AMPs在體內(nèi)的抗菌活性仍需進(jìn)一步研究。與此同時(shí)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)細(xì)菌會(huì)通過(guò)膜修飾、外排泵的合成等方式對(duì)AMPs產(chǎn)生耐藥性。由此可見(jiàn)，在將AMPs用于臨床治療之前，仍需進(jìn)行更加深入的研究。

5 植物來(lái)源的抗菌制劑

一些植物來(lái)源的活性肽及其衍生物在結(jié)構(gòu)和功能上與AMPs相似，對(duì)細(xì)菌群體效應(yīng)及生物膜的形成均具有抑制作用。它們可與病原菌蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，以影響其致病的關(guān)鍵步驟。以下介紹幾種可作用于ESKAPE病原菌的植物來(lái)源的抗菌制劑。

精油是一種主要來(lái)源于植物葉子和花朵的提取物，可通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性而產(chǎn)生殺菌作用。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，精油與AMPs聯(lián)合使用可對(duì)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抗菌活性，但其作用原理及給藥方式仍需進(jìn)一步研究[52]。其中，來(lái)源于羊食阿魏(一種多年生草本植物)與紫果云杉的精油提取物對(duì)MRSA有一定抗菌活性[53]；來(lái)源于非洲扁柏及尋常百里香的精油提取物對(duì)腸桿菌科細(xì)菌有一定抗菌活性，且可作為抗生素增效劑與常規(guī)抗生素聯(lián)合使用[54]；卡氏瘧原蟲EO精油與常規(guī)抗生素聯(lián)合使用可應(yīng)對(duì)多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染；從地中海植物中提取的許多精油在極低濃度下便可使銅綠假單胞菌的生物膜降解；來(lái)源于黃花草的納米乳劑對(duì)產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌及MRSA的殺菌活性均較強(qiáng)；茶樹(shù)油可抑制細(xì)菌呼吸作用并破壞細(xì)菌膜的通透性，對(duì)MRSA、耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌均具有一定的殺菌特性[55]。盡管植物來(lái)源的抗菌制劑在應(yīng)對(duì)ESKAPE病原菌方面表現(xiàn)出優(yōu)異的特性，但由于這些抗菌肽的分子結(jié)構(gòu)較特殊，其大規(guī)模的工業(yè)合成仍較難實(shí)現(xiàn)。此外，精油穩(wěn)定性欠佳，水溶性差，對(duì)環(huán)境因素極其敏感，這也在一定程度上限制了其應(yīng)用。為應(yīng)對(duì)這一問(wèn)題，有學(xué)者提出可以使用納米顆粒來(lái)封裝薄荷、黃連及西番蓮的精油，以提高其穩(wěn)定性[56]。

天然黃酮類化合物也具有優(yōu)異的抗菌活性。Farhadi等[57]發(fā)現(xiàn)，類黃酮可通過(guò)抑制脂肪酸合成酶復(fù)合物的活性而降低銅綠假單胞菌的毒力，且在低于最小抑菌濃度時(shí)即可抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成。類黃酮kβ-內(nèi)酰胺類抗生素(如奧沙西林及頭孢唑林)聯(lián)合使用可對(duì)MRSA產(chǎn)生明顯的抗菌作用[58]。但這一觀點(diǎn)也備受爭(zhēng)議：有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，從肯尼亞的某些植物中分離出的類黃酮化合物是細(xì)菌外排泵的基質(zhì)。因此，類黃酮與外排泵抑制劑的聯(lián)合使用也是十分有必要的。

除此以外，還有多種植物可對(duì)ESKAPE病原菌產(chǎn)生良好的抗菌活性。半枝蓮(Scutellaria barbata)在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中對(duì)多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌均表現(xiàn)出一定活性，與黏菌素聯(lián)合使用時(shí)顯示出比單用黏菌素更強(qiáng)的抗菌作用[59]。無(wú)水紅褐色素的提取物含有大量的游離羥基，這種特殊結(jié)構(gòu)使其對(duì)金黃色葡萄球菌及肺炎克雷伯菌的抗菌活性進(jìn)一步增強(qiáng)[60]。從牛蒡中提取的綠原酸可通過(guò)抑制肺炎克雷伯菌生物膜及β-內(nèi)酰胺酶的合成而有效應(yīng)對(duì)頑固性肺炎克雷伯菌感染。厚葉多肉植物玉吊鐘的提取物對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)均有抑制作用。二氫白屈菜紅堿和N-甲基卡丹汀是兩種苯并菲啶生物堿，它們對(duì)MRSA均有一定的抗菌活性，可為新藥的設(shè)計(jì)研發(fā)提供方向[61]。

6 納米藥物輸送系統(tǒng)

NDDS在抗菌治療領(lǐng)域中具有劃時(shí)代的意義，它是一種新型給藥系統(tǒng)，相較于傳統(tǒng)的抗菌藥物給藥系統(tǒng)具有多重優(yōu)勢(shì)：可增加抗菌藥物溶解度，增強(qiáng)抗菌藥物穩(wěn)定性，改善抗菌藥物的生物利用度，延長(zhǎng)抗生素半衰期以及減少藥物不良反應(yīng)。此外，一些NDDS還具有組織靶向性。絕大多數(shù)情況下，吞噬細(xì)胞能夠識(shí)別并殺滅細(xì)菌，但仍有不少細(xì)菌可在吞噬細(xì)胞內(nèi)生存，常規(guī)抗菌藥物無(wú)法應(yīng)對(duì)這類細(xì)菌，而納米載體可將抗生素輸送至被感染的吞噬細(xì)胞內(nèi)，以應(yīng)對(duì)吞噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌。目前已有一些納米制劑(如脂質(zhì)體和聚合物納米顆粒等)被用作給藥載體，相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NDDS可顯著提高藥物的治療指數(shù)，降低藥物的毒性。

6.1 脂質(zhì)體NDDS 脂質(zhì)體是一種球形的脂質(zhì)囊泡，其大小從幾納米到幾微米不等。正電荷脂質(zhì)體可與帶負(fù)電的生物膜表面相互作用，促進(jìn)藥物對(duì)生物膜的靶向作用。其中，油酸組成的脂質(zhì)體對(duì)多耐藥銅綠假單胞菌具有某些抗菌活性。采用油酸納米脂質(zhì)體輸送法尼醇(一種抑制真菌群體效應(yīng)的分子)及環(huán)丙沙星，可有效抑制多耐藥銅綠假單胞菌生物膜的合成；采用聚乙二醇對(duì)這種油酸脂質(zhì)體進(jìn)行修飾可進(jìn)一步提高其臨床治療效果[62]。此外，用殼聚糖修飾的脂質(zhì)體輸送鹽酸萬(wàn)古霉素，不僅可顯著提高脂質(zhì)體的封裝性能，還可增強(qiáng)其對(duì)MRSA感染的治療效果，減少腎毒性等藥物不良反應(yīng)[63]。脫氧膽酸鈉(具有較強(qiáng)滲透能力的膽汁鹽)修飾脂質(zhì)體可增強(qiáng)所載藥物的生物利用度。目前，相關(guān)實(shí)驗(yàn)正在研究可變形脂質(zhì)體輸送非甾體類抗炎藥吡羅昔康的臨床作用，以期用于感染性皮膚病的局部治療[64]。

6.2 聚合物納米顆粒 聚合物納米顆粒通常來(lái)源于聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)或殼聚糖，以形成脂質(zhì)-聚合物納米顆?；旌衔铩Ｋ鼈兣c脂質(zhì)體相似，均具有良好的生物相容性及可降解性，且其化學(xué)和物理性質(zhì)也很穩(wěn)定，可進(jìn)一步提高納米載體的穩(wěn)定性及輸送效率，目前已被FDA批準(zhǔn)用于藥物輸送。用PLGA納米顆粒輸送阿米卡星可降低其藥物毒性，且能夠改善其對(duì)銅綠假單胞菌的抗菌及抗生物膜效率。此外，PLGA納米顆?？梢酝高^(guò)銅綠假單胞菌產(chǎn)生的生物膜/黏液的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，也可以進(jìn)入病原菌所在的巨噬細(xì)胞，因此有望用于銅綠假單胞菌引起的肺部感染的臨床治療。殼聚糖是一種帶正電荷、無(wú)毒的線性多糖聚合物，其納米顆?？纱┻^(guò)假單胞菌產(chǎn)生的黏液，協(xié)助抗菌藥物發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖已被用作一些多耐藥革蘭陽(yáng)性菌抗菌藥物的載體[65]。

6.3 其他納米藥物輸送載體 納米銀顆粒(silver nanoparticles，AgNPs)的應(yīng)用具有悠久的歷史，其抗菌作用機(jī)制包括：(1)干預(yù)細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的合成；(2)干擾細(xì)菌能量代謝；(3)抑制細(xì)菌關(guān)鍵酶的活性；(4)抑制病原菌DNA的合成；(5)產(chǎn)生活性氧以影響生物膜的形成等。其中，羧甲基羅望子多糖封端的AgNP、殼聚糖封端的AgNP、阿拉伯膠封端的AgNP、聚乙烯吡咯烷酮封端的AgNP及二氧化鈦封端的AgNP不僅對(duì)ESKAPE病原菌有一定的抑制活性，且可降低所輸送藥物的細(xì)胞毒性[66]。

此外，二維納米抗菌劑與細(xì)胞膜間的作用機(jī)制也已引起學(xué)界的廣泛關(guān)注。二硫化鉬是由兩個(gè)平行硫原子(S)層之間夾著單層的過(guò)渡金屬原子(Mo)構(gòu)成的。分子動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，二硫化鉬的氧化應(yīng)激作用可導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜快速去極化，并通過(guò)在細(xì)胞膜表面形成凹痕及對(duì)磷脂的萃取破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性[67]。

石墨烯和氧化石墨烯也是十分有前景的納米抗菌制劑。氧化石墨烯邊緣尖銳，能夠產(chǎn)生活性氧，可破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，這些獨(dú)特的理化性質(zhì)決定了其優(yōu)異的抗菌活性。在體外實(shí)驗(yàn)中，氧化石墨烯表現(xiàn)出了對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抗菌及抗生物膜活性[68]，而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示其可有效控制多耐藥肺炎克雷伯菌的感染[69]。納米二氧化硅也擁有優(yōu)異的生物相容性和表面活性，對(duì)銅綠假單胞菌及MRSA臨床分離株生物膜的形成具有顯著活性[70]。

近年來(lái)NDDS發(fā)展迅速，但一些納米抗菌顆粒也會(huì)引起安全隱患。納米顆粒可穿過(guò)血腦屏障，從而引起心臟自主控制失調(diào)及DNA損傷。目前認(rèn)為，納米顆粒的一些理化性質(zhì)，如降解性、表面性質(zhì)、表面電荷、顆粒直徑和形狀等，可能與其細(xì)胞毒性相關(guān)[71]。因此，在投入臨床使用之前，仍需對(duì)其生產(chǎn)控制、毒性測(cè)定及其代謝過(guò)程進(jìn)行更加細(xì)致深入的研究。

7 光動(dòng)力抗菌療法

20世紀(jì)初，光動(dòng)力抗菌化學(xué)療法(photodynamic antimicrobial chemotherapy，PACT，也稱光動(dòng)力療法，photodynamic therapy，PDT)逐漸成為一種新興抗菌策略[72-73]。PDT技術(shù)有3個(gè)重要元素：氧氣、光敏抗菌劑及光源。白光可使活化的光敏抗菌劑將氧氣轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧和羥基自由基等活性氧以殺死附近的病原菌。良好的光敏抗菌劑具有較高的水溶性、對(duì)病原菌的選擇性及對(duì)人體細(xì)胞較低的毒性。其中，甲苯胺藍(lán)、TiO2納米顆粒及ZnO納米顆粒等光敏劑對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抗菌活性已被證實(shí)[74]。

多項(xiàng)臨床試驗(yàn)證實(shí)，PDT可影響病原菌生物膜的形成[75]。由于革蘭陰性細(xì)菌帶負(fù)電荷，因此帶正電的光敏抗菌劑對(duì)其更有效；同理，帶負(fù)電的光敏抗菌劑通常僅對(duì)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌有效。近5年關(guān)于PDT抗菌療法的研究進(jìn)展如下：含碘化物的富勒烯可用于治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染[76]；具有一個(gè)N+-甲基-吡咯烷鎓的富勒烯可用于治療金黃色葡萄球菌感染[77]；單壁碳納米管-卟啉結(jié)合物介導(dǎo)的滅活作用對(duì)金黃色葡萄球菌具有顯著抗菌活性[78]。在燒傷小鼠模型中，新型光敏抗菌劑Sinoporphyrin介導(dǎo)的PDT對(duì)多耐藥金黃色葡萄球菌有明顯的殺菌活性[79]；在豬眼感染模型中，使用光敏抗菌劑卟啉二氫卟酚e6時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[80]；在體外，帶正電的卟啉及其衍生物已被用作光敏抗菌劑，以應(yīng)對(duì)MRSA和銅綠假單胞菌感染[81]。在臨床上將PDT與抗生素聯(lián)合使用可提高金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的清除率[82]。雖然PDT在理論上可很大程度滿足臨床需求，但目前這種抗菌策略對(duì)宿主細(xì)胞毒性的相關(guān)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不足，仍需進(jìn)一步研究。

8 噬菌體療法

噬菌體可吸附在致病菌的表面受體上，抑制生物膜形成，導(dǎo)致其毒性減弱，甚至使病原菌幾乎喪失致病能力。目前已有幾項(xiàng)臨床試驗(yàn)證實(shí)，一些噬菌體可用于應(yīng)對(duì)銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌感染[83]。噬菌體雞尾酒療法是指對(duì)宿主使用多種治療相關(guān)噬菌體的新興抗菌策略。此療法首先需要分離并鑒定出相關(guān)致病菌，然后依據(jù)不同的致病菌使用不同種類的噬菌體，同時(shí)還需考慮患者癥狀、給藥途徑和藥物劑量。近年來(lái)，學(xué)界正密切關(guān)注著噬菌體療法的療效及安全性，相關(guān)臨床試驗(yàn)和病例報(bào)告數(shù)量也在明顯上升。本節(jié)將簡(jiǎn)述2014－2019年噬菌體療法的研究成果。

天然噬菌體PP1131(包含12種應(yīng)對(duì)銅綠假單胞菌的噬菌體混合物)可有效應(yīng)對(duì)銅綠假單胞菌導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)性心內(nèi)膜炎，其與環(huán)丙沙星的作用十分相似[84]。噬菌體OMKO1可用于治療銅綠假單胞菌引起的主動(dòng)脈瓣移植術(shù)后慢性感染，且未觀察到復(fù)發(fā)感染[85]。此外，一些噬菌體對(duì)尿路感染患者尿液中分離出的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌菌株均有一定的溶解作用[86]。在一項(xiàng)隨機(jī)雙盲Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，對(duì)銅綠假單胞菌感染的燒傷創(chuàng)面使用PP1131，結(jié)果顯示，PP1131能夠有效降低病原菌活力，但其作用往往慢于常規(guī)治療。肌病毒科噬菌體家族成員(LysAm24、LysECD7及LysSi3)的內(nèi)溶素能夠殺滅銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯菌[87]。目前，雞尾酒療法已成功應(yīng)用于合并多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染的彌散性結(jié)核患者中。有研究在1例急性腎損傷患者中發(fā)現(xiàn)，單體噬菌體也有一定的抗菌活性，可有效治療銅綠假單胞菌所致的敗血癥，患者經(jīng)治療后血液細(xì)菌培養(yǎng)及C反應(yīng)蛋白結(jié)果均轉(zhuǎn)為陰性，發(fā)熱癥狀也消退[88]。

噬菌體與抗生素聯(lián)合使用可干擾細(xì)菌耐藥性的進(jìn)化，從而顯著降低細(xì)菌致病性；且由于耐藥機(jī)制間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，對(duì)噬菌體和抗生素同時(shí)產(chǎn)生耐藥性的突變菌株極少見(jiàn)。其中，噬菌體KARL-1與傳統(tǒng)抗生素(美洛培南、環(huán)丙沙星、黏菌素)聯(lián)合使用可有效應(yīng)對(duì)多耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌[89]。然而，盡管許多體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)了噬菌體與抗生素聯(lián)合使用的有效性，但也有研究提出了噬菌體治療的風(fēng)險(xiǎn)，如一些噬菌體突變體的出現(xiàn)會(huì)影響此新型療法的效果。因此，在二者聯(lián)合使用時(shí)，噬菌體與抗生素類型的選擇及比例的確定均須經(jīng)過(guò)完善的科學(xué)研究和臨床試驗(yàn)證實(shí)。

噬菌體療法有一定研究潛力，但也面臨很多挑戰(zhàn)。首先，噬菌體雞尾酒療法需針對(duì)每位患者的不同情況量身定制，而泛泛的藥品調(diào)控機(jī)制與個(gè)性化的噬菌體療法常常難以統(tǒng)一。因此，越來(lái)越多的學(xué)者提倡立法者應(yīng)完善針對(duì)特殊藥品的法規(guī)。其次，噬菌體抗菌制劑的生產(chǎn)及監(jiān)管系統(tǒng)尚未規(guī)范，且噬菌體療法的相關(guān)研究和臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)仍然較少，限制了其臨床應(yīng)用。第三，噬菌體的一些自身特性也限制了其抗菌效率。作為一種毒力因子，噬菌體可被宿主的先天性免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)快速清除，因此，應(yīng)合理優(yōu)化噬菌體的輸送過(guò)程。第四，一些雞尾酒療法涉及未知的噬菌體混合物，而此類混合物是否能夠用于臨床治療仍有待商榷。在推進(jìn)噬菌體臨床應(yīng)用的過(guò)程中，用藥監(jiān)測(cè)、藥物劑量和個(gè)體化制劑的管控尤為重要。部分初期臨床試驗(yàn)證實(shí)，噬菌體的體內(nèi)運(yùn)用暫未出現(xiàn)明顯安全隱患，但仍有少數(shù)臨床試驗(yàn)顯示，噬菌體療法的療效具有不確定性[89-90]。因此，必須開(kāi)展噬菌體療法的Ⅲ期臨床試驗(yàn)。同時(shí)，藥物開(kāi)發(fā)人員與監(jiān)管機(jī)構(gòu)應(yīng)盡快建立監(jiān)管框架，以便于進(jìn)一步的測(cè)試和研究，以驗(yàn)證藥物的安全性和有效性。

9 總結(jié)與展望

本文總結(jié)了應(yīng)對(duì)ESKAPE病原菌的新興策略(如AMPs、NDDS、PDT等)，其中NDDS作為一種新興的藥物輸送載體，可協(xié)助藥物到達(dá)作用位點(diǎn)，從而減少藥物用量，并顯著提高抗菌藥物的治療指數(shù)。噬菌體與抗生素聯(lián)合使用可干擾細(xì)菌耐藥性的進(jìn)化，從而使細(xì)菌的致病性明顯降低。然而，噬菌體作為一種毒力因子，可被宿主的先天性免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)快速清除。此外，PDT被認(rèn)為是一種難以產(chǎn)生耐藥性的療法，可影響生物膜的形成。相關(guān)數(shù)據(jù)已證實(shí)，PDT與抗生素聯(lián)合使用可提高金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的清除率[43]。雖然此類新興抗菌策略的研究數(shù)據(jù)大多尚停留在臨床前階段，但是這些階段性研究成果提示新興抗菌策略具有廣闊的應(yīng)用前景。相信隨著未來(lái)臨床試驗(yàn)的進(jìn)一步開(kāi)展，這些潛在的新興抗菌策略有望成為傳統(tǒng)抗菌療法的補(bǔ)充和替代手段，在一定程度上緩解耐藥菌給醫(yī)院感染帶來(lái)的壓力。