草蓯蓉多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞侵襲遷移的影響及機(jī)制

華龍，王晨宇，姚坤厚，李小全

1河南大學(xué)淮河醫(yī)院普通外科，河南開(kāi)封 475000；2河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南開(kāi)封 475001

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)為臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均較高，嚴(yán)重影響人類(lèi)的生命健康[1]。HCC起病隱匿，早期缺乏明顯的臨床表現(xiàn)，惡性程度較高，多數(shù)患者確診時(shí)已為中晚期，腫瘤已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和侵襲[2-3]。目前臨床上主要通過(guò)手術(shù)并輔以放化療等治療HCC，但術(shù)后極易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[4]，患者術(shù)后5年生存率較低，因此尋找新的藥物抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移對(duì)提高患者生存率具有重要意義。草蓯蓉常用于抗衰老，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、潤(rùn)腸止血等功效，草蓯蓉多糖(Boschniakia rossicapolysaccharides，BRPS)是其主要活性成分之一，具有調(diào)節(jié)免疫、抗癌、抗氧化等多種生理活性，且無(wú)毒副作用，應(yīng)用前景廣闊[5]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是細(xì)胞應(yīng)對(duì)低氧環(huán)境的保護(hù)因子[6]，可通過(guò)調(diào)節(jié)多種因子的表達(dá)而激活相關(guān)信號(hào)通路，參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，促使腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)病灶發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[7-8]。目前BRPS與肝癌相關(guān)的研究較少，其作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討B(tài)RPS對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲遷移的影響并分析其可能機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用BRPS治療HCC提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 BRPS(95%，陜西新天域生物科技有限公司)；LV-HIF-1α和LV-HIF-1α-NC慢病毒及感染增強(qiáng)液ENi.s.(江蘇吉?jiǎng)P生物技術(shù)有限公司)；Hoechst33258試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗人HIF-1α單抗、E-鈣黏蛋白單抗、波形蛋白單抗及山羊抗兔IgG-HRP(美國(guó)Abcam公司)。Transwell小室(美國(guó)Corning公司)；DYCP-31DN電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，37 ℃水浴復(fù)蘇后于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁80%左右，用胰酶消化傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，PBS清洗，0.25%胰蛋白酶消化，接種于96孔板中(1×105個(gè)/ml)，分別加入含有不同濃度(12.5、25、50、100、200 μg/L)BRPS的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，另設(shè)不加BRPS的空白對(duì)照組，培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)孵育4 h；每孔加入150 μl二甲基亞砜，充分振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=藥物組A490/空白對(duì)照組A490×100%。選取細(xì)胞存活率接近50%的BRPS濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 轉(zhuǎn)染方法：轉(zhuǎn)染前1 d，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，使用ENi.s.將聚凝胺稀釋至5 μg/ml，并將LV-HIF-1α和LV-HIF-1α-NC慢病毒稀釋至1×108TU/ml，每孔分別加入880 μl ENi.s.、100 μl聚凝胺和20 μl病毒液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，觀察細(xì)胞形態(tài)。更換新鮮培養(yǎng)基，72 h后熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定株。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、HIF-1α-NC組、HIF-1α組、BRPS組與BRPS+HIF-1α組。對(duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)；HIF-1α-NC組細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV-HIF-1α-NC后，篩選穩(wěn)定株常規(guī)培養(yǎng)；HIF-1α組細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV-HIF-1α后，篩選穩(wěn)定株常規(guī)培養(yǎng)；BRPS組細(xì)胞加入50 μg/L BRPS培養(yǎng)；BRPS+HIF-1α組細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV-HIF-1α篩選穩(wěn)定株后，再加入50 μg/L BRPS培養(yǎng)。

1.2.4 Hoechst33258染色觀察肝癌細(xì)胞凋亡情況

取各組肝癌細(xì)胞，PBS清洗，加入0.5 ml固定液作用10 min，棄去固定液，PBS清洗，加入0.5 ml Hoechst33258染色液，室溫染色5 min，PBS清洗，滴加熒光淬滅封片液，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡率 取各組肝癌細(xì)胞，接種于6孔板中(1×106個(gè)/ml)，常規(guī)培養(yǎng)48 h，胰酶消化，PBS清洗，2000 r/min離心5 min，棄上清，PBS清洗；用500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC避光孵育15 min，加入10 μl PI染色5 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肝癌細(xì)胞，待細(xì)胞90%貼壁后，棄去培養(yǎng)基，用20 μl無(wú)菌槍頭在孔板底部中央垂直劃線(xiàn)，PBS沖洗脫落細(xì)胞，分別于0、24 h進(jìn)行拍照，觀察劃痕愈合情況，計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕距離－24 h劃痕距離)/0h劃痕距離×100%。

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞侵襲能力 用無(wú)血清培養(yǎng)液按3:1比例稀釋Matrigel膠，取50 μl稀釋后的Matrigel膠加入Transwell小室上室，培養(yǎng)箱中孵育1 h。重懸細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105個(gè)/ml，取200 μl細(xì)胞懸液加入上室，取600 μl含血清的培養(yǎng)液加入下室，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS清洗，4%多聚甲醛溶液固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色5 min，隨機(jī)選取5個(gè)視野，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞，取平均值。

1.2.8 Western blotting檢測(cè)肝癌細(xì)胞中HIF-1α、E-鈣黏蛋白、波形蛋白的表達(dá)水平 收集各組肝癌細(xì)胞，PBS清洗，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，12 000 r/min離心20 min，取上清；采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，制膠、上樣，行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，加入封閉液室溫封閉2 h，加入HIF-1α(1:500)、E-鈣黏蛋白(1:500)、波形蛋白(1:500)、β-actin(1:800)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，10 min/次；加入HRP標(biāo)記的二抗(1:2000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次；加入ECL發(fā)光液，顯影、定影，使用ImageJ軟件分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度BRPS對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，不同濃度BRPS作用于肝癌細(xì)胞后，細(xì)胞存活率均降低，且呈濃度依賴(lài)性(P＜0.05，圖1)。選取肝癌細(xì)胞存活率接近50%的BRPS濃度(50 μg/L)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度BRPS對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響(n=5)Fig.1 Effect of different concentrations of BRPS on the proliferation of hepatocarcinoma cells (n=5)

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的效果 熒光顯微鏡下觀察顯示，轉(zhuǎn)染HIF-1α及HIF-1α-NC的肝癌細(xì)胞內(nèi)均可見(jiàn)綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率均＞85%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖2)。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞的效果(×100)Fig.2 Transfection effect of hepatocarcinoma HepG2 cells with lentivirus (×100)

2.3 各組肝癌細(xì)胞凋亡情況 Hoechst33258染色結(jié)果顯示，對(duì)照組和HIF-1α-NC組肝癌細(xì)胞發(fā)出微弱藍(lán)色熒光，細(xì)胞核無(wú)明顯形態(tài)學(xué)變化；HIF-1α組肝癌細(xì)胞藍(lán)色熒光較弱，形態(tài)無(wú)明顯變化；BRPS組發(fā)出較強(qiáng)藍(lán)色熒光的細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞核碎裂呈致密濃染；BRPS+HIF-1α組致密濃染細(xì)胞較BRPS組減少(圖3)。

圖3 各組肝癌細(xì)胞Hoechst33258染色結(jié)果(×100)Fig.3 Hoechst33258 staining results of hepatocarcinoma cells in each group (×100)

2.4 各組肝癌細(xì)胞凋亡率比較 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、HIF-1α-NC組、HIF-1α組、BRPS組及BRPS+HIF-1α組細(xì)胞凋亡率依次為3.89%±1.25%、4.02%±1.18%、1.67%±0.86%、26.58%±1.63%、12.14%±1.05%。與對(duì)照組、HIF-1α-NC組比較，HIF-1α組細(xì)胞凋亡率降低，BRPS組細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；BRPS+HIF-1α組細(xì)胞凋亡率高于HIF-1α組，低于BRPS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

圖4 各組肝癌細(xì)胞凋亡情況(n=5)Fig.4 Cell apoptosis in each group of hepatocarcinoma cells (n=5)

2.5 各組肝癌細(xì)胞劃痕愈合率比較 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、HIF-1α-NC組、HIF-1α組、BRPS組及BRPS+HIF-1α組劃痕愈合率依次為63.35%±3.35%、64.29%±3.57%、87.48%±3.92%、14.82%±3.81%、32.59%±3.76%。與對(duì)照組、HIF-1α-NC組比較，HIF-1α組劃痕愈合率升高，BRPS組劃痕愈合率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；BRPS+HIF-1α組劃痕愈合率低于HIF-1α組，高于BRPS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖5)。

圖5 各組肝癌細(xì)胞劃痕愈合情況比較(n=5)Fig.5 Cell healing in each group of hepatocarcinoma cells (n=5)

2.6 各組穿膜細(xì)胞數(shù)比較 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、HIF-1α-NC組、HIF-1α組、BRPS組及BRPS+HIF-1α組穿膜細(xì)胞數(shù)依次為(122.60±3.29)個(gè)、(125.20±3.63)個(gè)、(208.60±6.17)個(gè)、(68.80±4.25)個(gè)、(123.40±4.94)個(gè)。與對(duì)照組、HIF-1α-NC組比較，HIF-1α組穿膜細(xì)胞數(shù)增多，BRPS組穿膜細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；BRPS+HIF-1α組穿膜細(xì)胞數(shù)少于HIF-1α組，多于BRPS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖6)。

圖6 各組肝癌細(xì)胞侵襲能力比較(n=5)Fig.6 Cell invasion in each group of hepatocarcinoma cells (n=5)

2.7 各組肝癌細(xì)胞中HIF-1α、E-鈣黏蛋白、波形蛋白表達(dá)水平比較 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組、HIF-1α-NC組比較，HIF-1α組肝癌細(xì)胞中HIF-1α、波形蛋白表達(dá)水平升高，E-鈣黏蛋白表達(dá)水平降低，BRPS組肝癌細(xì)胞中HIF-1α、波形蛋白表達(dá)水平降低，E-鈣黏蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；BRPS+HIF-1α組肝癌細(xì)胞中HIF-1α、波形蛋白表達(dá)水平低于HIF-1α組，高于BRPS組，E-鈣黏蛋白表達(dá)水平高于HIF-1α組，低于BRPS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖7)。

圖7 各組肝癌細(xì)胞中HIF-1α、E-鈣黏蛋白、波形蛋白表達(dá)水平比較(n=5)Fig.7 Comparison of the expression levels of HIF-1α, E-cadherin, and vimentin in each group of hepatocarcinoma cells (n=5)

3 討 論

HCC的發(fā)生發(fā)展涉及多基因、多環(huán)節(jié)的共同參與，其中腫瘤微環(huán)境在該過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。正常情況下，細(xì)胞與周?chē)M織環(huán)境之間處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，細(xì)胞發(fā)生惡變則打破了這種平衡，構(gòu)建了新的營(yíng)養(yǎng)代謝網(wǎng)絡(luò)，產(chǎn)生了大量趨化因子及生長(zhǎng)因子，構(gòu)成缺氧、低pH值、間質(zhì)高壓的腫瘤微環(huán)境，有利于腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲等，這是腫瘤不斷惡化并發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要原因[9-10]。缺氧是EMT的誘發(fā)因素之一，而EMT是肝癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的起始過(guò)程，因此，阻斷缺氧誘導(dǎo)的EMT成為治療HCC的新靶點(diǎn)[11]。

BRPS具有多種生物活性，其保肝作用已被證實(shí)。尹學(xué)哲等[12]發(fā)現(xiàn)，BRPS可通過(guò)增強(qiáng)抗氧化能力而保護(hù)肝細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。此外，BRPS還具有抗腫瘤作用。Yao等[13]發(fā)現(xiàn)，BRPS可通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。伍海鷹等[14]發(fā)現(xiàn)，BRPS可減輕脂質(zhì)過(guò)氧化，對(duì)早中期肝癌荷瘤小鼠具有明顯的抑瘤作用。本研究采用不同濃度的BRPS處理肝癌HepG2細(xì)胞，結(jié)果顯示，不同濃度的BRPS均可抑制肝癌細(xì)胞的增殖，表明BRPS對(duì)肝癌細(xì)胞具有增殖抑制作用。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)BRPS對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲的影響，本研究采用Hoechst33258染色法、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，BRPS組肝癌細(xì)胞凋亡率明顯增高，劃痕愈合率降低，穿膜細(xì)胞數(shù)減少，提示BRPS可促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，并降低其遷移和侵襲能力。

缺氧是多種實(shí)體瘤的常見(jiàn)情況，腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖形成瘤塊，阻塞周?chē)埽瑢?dǎo)致中心瘤區(qū)供氧不足，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和遷移[15]。HIF-1α是一種在缺氧條件下廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在多種腫瘤中呈高表達(dá)，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、凋亡及轉(zhuǎn)移產(chǎn)生重要影響[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)HIF-1α后凋亡細(xì)胞較對(duì)照組明顯減少，劃痕愈合率升高，穿膜細(xì)胞數(shù)增多，提示過(guò)表達(dá)HIF-1α可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究在過(guò)表達(dá)HIF-1α后使用BRPS干預(yù)肝癌細(xì)胞，結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡較BRPS組減少，劃痕愈合率升高，穿膜細(xì)胞數(shù)增多，減弱了BRPS對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用，提示BRPS抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲的能力可能與抑制HIF-1α表達(dá)有關(guān)。

EMT是上皮腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移和侵襲能力的重要途徑，上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)或缺失、間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白表達(dá)上調(diào)是腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的重要標(biāo)志[18]。E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞黏附力下降，易于脫落，波形蛋白表達(dá)上調(diào)表明腫瘤細(xì)胞獲得間質(zhì)表型，運(yùn)動(dòng)及遷移能力增強(qiáng)，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中E-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)，對(duì)于了解腫瘤細(xì)胞EMT的進(jìn)展具有重要意義[19]。HIF-1α與EMT密切相關(guān)，參與調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，可促進(jìn)糖尿病腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT[20]。在前列腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HIF-1α可上調(diào)波形蛋白的表達(dá)，下調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)[21]。本研究Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，HIF-1α組肝癌細(xì)胞中HIF-1α、波形蛋白的表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)，E-鈣黏蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，BRPS組上述指標(biāo)呈現(xiàn)相反趨勢(shì)，而B(niǎo)RPS+HIF-1α可逆轉(zhuǎn)BRPS對(duì)EMT的抑制作用，證實(shí)了BRPS對(duì)HIF-1α的調(diào)控作用，提示BRPS可通過(guò)下調(diào)HIF-1α的表達(dá)，阻止EMT的發(fā)生，減弱肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，BRPS可降低肝癌HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能與調(diào)控HIF-1α表達(dá)、阻止EMT發(fā)生有關(guān)。該結(jié)果為臨床治療HCC提供了理論依據(jù)。但本研究仍存在一定不足：首先，僅停留在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)水平，仍需進(jìn)一步動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證；其次，僅從BRPS調(diào)控HIF-1α的角度證實(shí)了與EMT的關(guān)系，是否存在其他相關(guān)因子參與EMT過(guò)程，尚需更多有針對(duì)性的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。