副干酪乳桿菌HD1.7在乙酸脅迫下轉錄組學研究

葛菁萍，康 杰，平文祥,*

(黑龍江大學 a.農業(yè)微生物技術教育部工程研究中心；b.生命科學學院 黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，哈爾濱 150080)

0 引 言

細菌素是由核糖體合成的具有殺菌和抗癌功能的小分子多肽。因此細菌素對多種病原微生物和食品腐敗菌生長具有良好的抑制作用。近10 a，細菌素在生物醫(yī)學領域應用的文獻占多數(shù)[1]，其中大部分涉及革蘭氏陰性菌產生的細菌素研究。細菌素對革蘭氏陽性菌的研究尚處于起步階段，主要集中在乳酸菌上。細菌素產生伴隨著乙酸產生[2]，說明乙酸代謝與細菌素產生之間有一定的聯(lián)系。細菌素可作為定殖肽、抗菌肽和信號肽來調節(jié)微生物的生態(tài)功能[3]。作為競爭者的代理人，細菌素將入侵一個新的群體[4]。競爭者在成功建立自己的群落之后，細菌素可以防止其它物種入侵，并通過調節(jié)細胞間競爭來調節(jié)種群動態(tài)[3]。

當細胞在有氧條件處于快速生長時，細菌、真菌和高等生物細胞均可通過某些機制產生發(fā)酵產物，如有機酸，以調節(jié)細胞碳代謝和能量流動，進而調節(jié)細胞的生長和代謝，稱為“溢流代謝(overflow metabolism)”[5]。而且細菌的溢流代謝被認為是當中心代謝(糖代謝、脂肪酸代謝、氨基酸代謝)出現(xiàn)飽和時，重新啟用的一種獨立于中心代謝的路徑[6]。溢流代謝對細菌是有益的，這些發(fā)酵產物(乙醇、乙酸、乳酸等)能夠為細胞提供種群競爭的有力武器，使其在生態(tài)競爭中獲利，同時作為一種備用的碳源，調節(jié)細胞的群體行為[7]。

乙酸代謝調節(jié)細胞內的生理活動，細菌素調節(jié)細胞外的生理活動。最重要的是，兩者密不可分。在革蘭氏陽性菌中，許多生物學特性都受到乙酸代謝的調節(jié)，如生物膜形成[8]、細菌素生產和顯示毒力[9]。細菌通過乙酸代謝間接調節(jié)細菌素的產生和生態(tài)功能。通過不同濃度乙酸脅迫副干酪乳桿菌HD1.7后，通過轉錄組學技術檢測分析，對細菌素濃度和差異基因展開研究，進一步探討乙酸對副干酪乳桿菌HD1.7生長代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

副干酪乳桿菌HD1.7由黑龍江大學微生物重點實驗室從酸菜發(fā)酵液中分離獲得，能夠產生天然的細菌素；枯草芽孢桿菌ATCC 11774也由該實驗室提供，用于細菌素測定過程中的指示菌株；冰乙酸購自天津市恒興化學試劑制造有限公司?？俁NA提取試劑盒(R1200)購自北京索萊寶科技有限公司；ChamQTM Universal SYBR? qPCR Master Mix(Q711-02)購自南京諾唯贊生物科技有限公司；TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(AT341-02)試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基(g·L-1)：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，K2HPO42 g，Na2SO30.1 g，NaAc 5 g，MgSO40.2 g，MnSO40.05 g，吐溫-80 1 mL，檸檬酸銨2 g，pH值調至5.5，121 ℃滅菌15 min，作為副干酪乳桿菌HD1.7種子液培養(yǎng)基；BP培養(yǎng)基(g·L-1)：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g。pH值調至7.0，121 ℃滅菌15 min，作為枯草芽孢桿菌ATCC 11774種子液培養(yǎng)基；水瓊脂：瓊脂20 g，水1 000 mL，121 ℃滅菌15 min，作為抑菌試驗的下層培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器

紫外可見分光光度計(UVmini-1240) 島津國際貿易上海有限公司；熒光定量PCR儀(ABI7500) 美國Life Technologies公司；高效液相色譜儀(LC20A) 島津國際貿易上海有限公司；pH Meter (FE20 pH Meter) 梅特勒-托利多(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 副干酪乳桿菌HD1.7的乙酸脅迫試驗

將活化后的副干酪乳桿菌HD1.7以1%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃、140 rpm培養(yǎng)至12 h，分別添加2 g·L-1、6 g·L-1和10 g·L-1乙酸，繼續(xù)搖瓶發(fā)酵至60 h，每隔12 h取樣。

1.2.2 細菌素濃度檢測

1) 細菌素粗制液制備：將每個時間點發(fā)酵液進行5 000 rpm、4 ℃離心10 min，上清液經0.22 μm細菌濾器除菌，過濾后的上清液即為含有細菌素的粗制液。

2) 細菌素濃度測定：瓊脂擴散法檢測發(fā)酵上清液的抑菌活性。①將30 mL水瓊脂倒入直徑14 cm的培養(yǎng)皿中，作為下層培養(yǎng)基，待凝固后擺放牛津杯；②將濃度為107CFU·mL-1的指示菌懸液，以1%比例加入70 mL已融化的BP半固體培養(yǎng)基中，倒在水瓊脂上，作為上層培養(yǎng)基；③待上層培養(yǎng)基凝固后，無菌條件下，將牛津杯垂直拔出，在平板底部做好標記；④取0.2 mL細菌素粗制液樣品加入到點樣孔中；⑤將平板放入4 ℃冰箱正置1 h，使待測樣品充分滲透進入半固體培養(yǎng)基中，然后移入37 ℃培養(yǎng)箱中，正置培養(yǎng)18 h，測量抑菌圈大??；⑥將樣品抑菌圈直徑與對照抑菌圈直徑差值代入標準曲線方程，可得到細菌素濃度。

1.2.3 理化指標檢測

將每個時間點發(fā)酵液稀釋100倍進行12 000 rpm、4 ℃離心10 min，取上清液通過液相色譜儀檢測代謝產物，如葡萄糖、乳酸和乙酸；將每個時間點發(fā)酵液稀釋10倍，通過紫外可見分光光度計測定OD600 nm值；通過pH Meter測定每個時間點發(fā)酵液pH值。

1.2.4 轉錄組學檢測

將活化后的副干酪乳桿菌HD1.7以1%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃、140 rpm培養(yǎng)至12 h，分別添加2 g·L-1(簡寫為Ace2試驗組)、6 g·L-1(簡寫為Ace6試驗組)和10 g·L-1(簡寫為Ace10試驗組)乙酸，未加乙酸的為CK組，進行3次平行試驗，培養(yǎng)至24 h。發(fā)酵液轉入2 mL離心管中，12 000 rpm、4 ℃離心10 min，棄上清，菌體馬上-80 ℃冰箱冷凍，送樣測序。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用Origin2020b (OriginLab Corp，美國) 進行分析并作圖；轉錄組數(shù)據(jù)中差異基因篩選標準為FC>1.50和P value<0.05；使用基迪奧在線平臺進行GO和KEGG富集分析(https://www.omicshare.com/tools/)。

2 結果與分析

2.1 乙酸脅迫對副干酪乳桿菌HD1.7的影響

副干酪乳桿菌HD1.7單獨培養(yǎng)產生5.48±0.10 g·L-1乙酸，選擇添加2 g·L-1、6 g·L-1和10 g·L-1乙酸，初步探究乙酸溢流對副干酪乳桿菌HD1.7生長代謝的影響見圖1。乙酸脅迫能提高細菌素濃度，但存在閾值，如6 g·L-1乙酸。Ace2試驗組、Ace6試驗組和Ace10試驗組細菌素濃度分別為54.86±1.08 AU·mL-1、99.46±7.82 AU·mL-1和100.35±8.72 AU·mL-1，分別比對照組提高了27.88%、131.84%和133.92%。

圖1 不同濃度乙酸對副干酪乳桿菌HD1.7發(fā)酵的影響

Ace2試驗組和Ace6試驗組(乙酸濃度分別為7.40±0.17 g·L-1和12.17±0.21 g·L-1)未影響到自身產生乙酸(對照組最大乙酸濃度為5.48±0.10 g·L-1)的能力，而Ace10試驗組(最大乙酸濃度為14.70±0.20 g·L-1)減弱了自身乙酸代謝，自身乙酸產量降低了14.55%，另外Ace10試驗組也降低了乳酸代謝。乙酸脅迫下，葡萄糖消耗速率出現(xiàn)減弱，CK組在24 h時葡萄糖已經消耗完，Ace10試驗組在24 h時葡萄糖還剩4.98±0.19 g·L-1。而且隨著乙酸濃度增加，OD600 nm值和pH值都出現(xiàn)一定程度下降。

2.2 比較差異基因

相比CK組，Ace2試驗組差異基因數(shù)為36，其中上調基因為33，下調基因為3； Ace6試驗組差異基因數(shù)為269，其中上調基因為131，下調基因為138；Ace10試驗組差異基因數(shù)為296，其中上調基因為209，下調基因為87(圖2)。隨著乙酸濃度增加，差異基因數(shù)也增加。Ace2、Ace6和Ace10試驗組相同的差異基因有5個，分別為ydjP、glmS、cspLA、oppA和ykfC；Ace6和Ace10試驗組相同的差異基因有90個(圖3)。Ace6和Ace10試驗組細菌素均被誘導增加，而且細菌素濃度基本一致，因此這90個基因中可能和細菌素被誘導產生相關，以后試驗可進一步篩選出和誘導細菌素產生相關的基因。

圖2 不同濃度乙酸處理下的差異基因

圖3 比較不同濃度乙酸處理下的差異基因

2.3 差異基因GO富集分析

差異基因GO富集分析結果分為3部分,見圖4。由圖4可見，分別為細胞組分、分子功能和生物學過程。在細胞組分方面，Ace2試驗組富集的組分種類多；而Ace10試驗組富集的組分種類少，但組分內差異基因數(shù)多。而且Ace2試驗組富集的組分種類包括Ace10試驗組富集的組分種類。Ace6試驗組沒有富集到顯著的結果?？赡苷f明少量乙酸對細胞組分影響范圍更廣，但程度低。在分子功能方面，Ace2試驗組富集到4個方面；Ace6試驗組富集到3個方面；Ace10試驗組富集到7個方面。Ace2試驗組、Ace6試驗組和Ace10試驗組富集結果中，存在一個交集，為核苷堿基跨膜轉運蛋白活性(nucleobase transmembrane transporter activity)——它能改變胞外核苷堿基向胞內運輸?shù)哪芰Γ患Y果中為上調基因，說明添加乙酸有助于細胞吸收胞外核苷堿基。另外也有多種連接酶活性分子功能也被富集到，可能說明酸脅迫時，細胞在節(jié)約能量條件下，更多吸收胞外核苷，有助于基因表達。在生物學過程方面，Ace6試驗組和Ace10試驗組富集結果更廣，前10的富集結果見圖4，主要集中在基因表達。另外Ace10試驗組還明顯富集到大分子代謝過程和蛋白質代謝過程。

綜上所述，添加乙酸明顯改變細胞內基因表達過程，但Ace2試驗組改變的范圍和程度較小；Ace10試驗組改變的范圍和程度較大，而且大分子代謝過程和蛋白質代謝過程也發(fā)生改變。

2.4 差異基因KEGG富集分析

差異基因KEGG富集分析結果見圖4。由圖4可見，Ace2試驗組富集的通路為核糖體、RNA降解和維生素B6代謝；Ace6試驗組富集的通路為嘧啶代謝、丙氨酸代謝、天冬氨酸代謝、谷氨酸代謝、嘌呤代謝；Ace10試驗組富集的通路為核糖體代謝、嘌呤代謝、嘧啶代謝、丙氨酸代謝、天冬氨酸代謝、谷氨酸代謝、脂肪酸生物合成、脂肪酸代謝、碳青霉烯生物合成。因此Ace2試驗組主要集中在基因表達方面；Ace6試驗組主要集中在基因表達和氨基酸代謝方面；Ace10試驗組主要集中在基因表達、氨基酸代謝和脂肪酸代謝方面。

注：CK為對照組；Ace2、Ace6、Ace10為分別添加2、6、10 g·L-1乙酸的試驗組。橫坐標為基因數(shù)；黑色字體分析方法閾值p值<0.05；紅色字體分析方法閾值q值<0.05。

綜上所述，表明酸脅迫使胞內相關基因表達發(fā)生改變，在此基礎上，6 g·L-1乙酸使胞內氨基酸代謝發(fā)生改變；10 g·L-1乙酸進一步使胞內脂肪酸代謝發(fā)生改變。

3 討 論

乙酸代謝是中樞代謝核心環(huán)節(jié)，不同濃度乙酸會使細菌產生不同的生理變化。當細菌素增加時，伴隨著乙酸濃度增加[10]，說明乙酸代謝和細菌素調控系統(tǒng)存在相關性。乙酸排泄以ATP形式產生能量，群體感應系統(tǒng)使用ATP作為其磷酸基團供體(組氨酸蛋白激酶自動磷酸化一個保守的組氨酸殘基)[11-12]，激活的群體感應系統(tǒng)進一步調控細菌素產生。乙酸代謝不僅為群體感應系統(tǒng)提供磷酸基團，而且胞外乙酸脅迫能觸發(fā)群體感應系統(tǒng)[13]，同時乙酸進入胞內發(fā)生電離，氫離子能結合σ因子(σ因子是一種全局轉錄調控因子，間接調控細菌素產生)蛋白，使其蛋白結構穩(wěn)定和成熟，易于發(fā)揮轉錄調控因子功能[14]。這是因為其蛋白含有組氨酸，氫離子能使組氨酸質子化，氫離子通過組氨酸開關的pH敏感性耦合到信號識別和基因調節(jié)。因此，乙酸脅迫通過多種途徑影響細菌素產生。

過量的乙酸脅迫可能會擾亂中心代謝的通量，不利于葡萄糖利用，進一步影響生長[15]，與本文研究結果一致。本試驗得出6 g·L-1乙酸脅迫影響了氨基酸代謝。胞內乙酸電離后，陰離子的存在增加了內部滲透壓，為了維持滲透壓，細胞內其他陰離子(最突出的是谷氨酸)的濃度減少[16-17]，由此產生的陰離子庫的擾動可能會影響新陳代謝的功能，從而影響生長。

4 結 論

與CK組相比，Ace2、Ace6和Ace10試驗組細菌素濃度分別提高了27.88%、131.84%和133.92%；轉錄組學數(shù)據(jù)中差異基因數(shù)分別為36、269和296。Ace6試驗組顯著改變胞內氨基酸代謝，說明胞外11.10±0.19 g·L-1乙酸已經影響到胞內陰離子池的濃度。Ace10試驗組顯著影響胞內脂肪酸代謝，表明乙酸濃度為14.70±0.20 g·L-1時，能改變副干酪乳桿菌HD1.7自身乙酸代謝能力。