FSCN1與Vimentin在結(jié)腸癌中的表達(dá)與意義

邱輝

（新泰市人民醫(yī)院腫瘤二科，山東 泰安 271200）

結(jié)腸癌是發(fā)病率、死亡率均較高的消化道惡性腫瘤[1]。我國是結(jié)腸癌的高發(fā)國家之一，2012年有新發(fā)結(jié)直腸癌24.5萬例及13.9萬例結(jié)直腸癌相關(guān)死亡病例[2-3]，結(jié)腸癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡率較高的重要原因。結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移涉及多個細(xì)胞內(nèi)、外因素，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞骨架成分肌動蛋白結(jié)合蛋白可能是其中一個重要因素[4]。FSCN1是一種進(jìn)化上保守的肌動蛋白結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞突起形成與細(xì)胞絲狀偽足的形成過程，與腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5-6]。FSCN1可以促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），而EMT在腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中具有重要作用[7-8]。FSCN1是否通過促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT過程進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移，目前尚未見相關(guān)報道。Vimentin（波形蛋白）是EMT的標(biāo)志蛋白，因此，檢測人結(jié)腸癌及癌旁組織中FSCN1與Vimentin的表達(dá)情況，并進(jìn)一步研究結(jié)腸癌細(xì)胞中FSCN1與Vimentin的調(diào)控關(guān)系，可為闡明結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)資料 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW-480細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。兔抗人FSCN1抗體（Abcam）、兔抗人Vimentin（CST）、FSCN1-siRNA（Santa Cruz）、Control-siRNA（Santa Cruz）、Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑（碧云天公司）、SABC免疫組化試劑盒（博士德）、Transwell小室（Corning公司）、Matrigel膠（BD公司）。人結(jié)腸癌組織芯片購自西安艾麗娜公司，人結(jié)腸癌組織芯片含有結(jié)腸癌原發(fā)灶和對應(yīng)癌旁組織，所有患者術(shù)前均未行化療和放療。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 SABC法檢測結(jié)腸癌及癌旁組織中FSCN1與Vimentin的表達(dá)情況，具體步驟參照SABC試劑盒說明書進(jìn)行。采用兩級評分法，①陽性細(xì)胞計數(shù)：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。②染色強(qiáng)度分級：無染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕色為3分。當(dāng)兩級評分乘積＞4時為陽性表達(dá)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培接種于六孔板中，在5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染于六孔板中進(jìn)行，細(xì)胞密度達(dá)30%左右，進(jìn)行FSCN1-siRNA、Control-siRNA轉(zhuǎn)染，具體步驟參考Lipo6000?轉(zhuǎn)染試劑說明書。

1.2.3 實(shí)時定量PCR Trizol法提取結(jié)腸癌SW-480細(xì)胞中RNA，測定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時定量PCR檢測，反應(yīng)條件：50℃2 min，95℃10 min；95℃0.5 min，60℃0.5 min，40個循環(huán)。運(yùn)行溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析。FSCN1的引物為5’-GCCAGGGTATGGACCTGTCTG-3’和5’-CACGCCACTC GA TG TC AA AGTA-3’，Vimentin的引物為5’-AAATGGCTCGTCACCTTC-3’和5’-AC CTGAGGCTTTGGATTCCT-3’，內(nèi)參β-actin的引物為5’-AGCGAGCAT CCCCCAAAGTT-3’和5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’。

1.2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡 提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定細(xì)胞蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后100℃變性5 min。進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、10%脫脂奶封閉、一抗4℃孵育過夜、二抗室溫孵育1 h、熒光顯色。采用Image J軟件分析灰度值。

1.2.5 Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn) Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：將200μL無血清培養(yǎng)基稀釋的細(xì)胞（約5萬個）加入小室上層，下室加入600μL含血清的培養(yǎng)液；侵襲實(shí)驗(yàn)：小室鋪有Matrigel膠，將200μL無血清培養(yǎng)基稀釋的細(xì)胞（約2萬個）加入小室上層；培養(yǎng)24 h，取出小室，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以“±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，3組間比較行單因素F分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組FSCN1與Vimentin蛋白的表達(dá)情況 FSCN1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，其在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)陽性率為51.1%（46/90），而在癌旁組織中無表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=69.791，P＜0.001）；Vimentin主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，其在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)陽性率為62.2%（56/90），而癌旁組織中陽性率為20.0%（18/90），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=33.136，P＜0.001），見圖1。

圖1 FSCN1與Vimentin在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達(dá)情況Figure 1 The expression of FSCN1 and Vimentin in colon cancer and adjacent tissues

2.2 FSCN1與Vimentin在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 FSCN1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與性別、年齡無關(guān)，與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度呈正相關(guān)；Vimentin在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與性別、年齡無關(guān)，與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度呈正相關(guān)，見表1。

表1 FSCN1、Vimentin在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 1 The expression of FSCN1 and Vimentin in colon cancer and their relationship with clinicopathological parameters

2.3 結(jié)腸癌組織中FSCN1與Vimentin表達(dá)的相關(guān)性FSCN1與Vimentin在結(jié)腸癌中共同表達(dá)陽性者44例，共同表達(dá)陰性者32例，F(xiàn)SCN1表達(dá)陽性而Vimentin表達(dá)陰性者2例，F(xiàn)SCN1表達(dá)陰性而Vimentin表達(dá)陽性者12例，兩者在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)均呈顯著正相關(guān)（r=0.705，P＜0.001）。

2.4 SW-480細(xì)胞中，F(xiàn)SCN1對Vimentin mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響 Real time-PCR結(jié)果顯示，SW-480細(xì)胞轉(zhuǎn)染FSCN1-siRNA后，F(xiàn)SCN1 mRNA、Vimentin mRNA水平均明顯降低，而Blank組（空白組）與Control-siRNA組無明顯變化（F=18.88，P=0.003；F=12.073，P=0.008），見圖2。

Western blot結(jié)果顯示，SW-480細(xì)胞轉(zhuǎn)染FSCN1-siRNA后，F(xiàn)SCN1、Vimentin蛋白表達(dá)水平均明顯降低，而Blank組與Control-siRNA組無明顯變化（F=10.531，P=0.011；F=9.43，P=0.014），見圖2。

圖2 FSCN1對Vimentin的mRNA與蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effect of FSCN1 on Vimentin mRNAand protein expression

2.5 Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn) 人結(jié)腸癌SW-480細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染FSCN1-siRNA與Control-siRNA 24 h后，與ControlsiRNA組比較，F(xiàn)SCN1-siRNA組細(xì)胞的遷移、侵襲能力均明顯降低（t=4.189，P=0.014；t=-5.143，P=0.007），見圖3。

圖3 敲低FSCN1的表達(dá)后對SW-480細(xì)胞運(yùn)動能力的影響Figure 3 Effect of knockdown of fscn1 expression on motility of SW-480 cells

3 討論

我國作為結(jié)腸癌的高發(fā)國家之一，大部分患者確診時已發(fā)生淋巴結(jié)或者其他臟器轉(zhuǎn)移，進(jìn)而失去最佳手術(shù)時機(jī)。因此，闡明結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)制對于結(jié)腸癌的診治具有重要意義。如果發(fā)生浸潤與轉(zhuǎn)移，腫瘤細(xì)胞需要具備一定的運(yùn)動和侵襲能力，并有相應(yīng)的形態(tài)特征（如伸長、極化、細(xì)胞突起的出現(xiàn)等）及細(xì)胞之間連接的紊亂[9]。所有上述改變均與細(xì)胞骨架（尤其肌動蛋白）的改變和重排有關(guān)[10]。作為一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，F(xiàn)SCN1與腫瘤細(xì)胞的絲狀偽足形成、細(xì)胞粘附及運(yùn)動遷移等生物學(xué)行為有關(guān)，進(jìn)而影響結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[11]。目前FSCN1在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中涉及的具體分子機(jī)制尚不明確。

EMT是指上皮細(xì)胞在相關(guān)因子的刺激下向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的過程，上皮細(xì)胞發(fā)生EMT化后具有間質(zhì)細(xì)胞特性，通過EMT過程，腫瘤細(xì)胞可以獲得較高遷移、侵襲與降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，從而誘導(dǎo)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[12-13]。EMT對于結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要，且與結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14]。研究證實(shí)，F(xiàn)SCN1可以誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞的EMT化及參與人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的EMT過程[15-16]。因此，推測FSCN1可能通過誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移。Vimentin是EMT化的重要分子標(biāo)志物，表達(dá)上調(diào)后腫瘤細(xì)胞遷移運(yùn)動和侵襲能力明顯增強(qiáng)，參與了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等惡性表型[17]。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)SCN1與Vimentin在結(jié)腸癌組織中均呈高表達(dá)，且與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)，說明二者可能與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，且兩種蛋白在結(jié)腸癌組織中表達(dá)呈正相關(guān)，因此，進(jìn)一步用siRNA敲低人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480中的FSCN1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)Vimentin的mRNA與蛋白表達(dá)水平明顯降低，進(jìn)而證實(shí)了在結(jié)腸癌細(xì)胞中FSCN1對Vimentin具有正向調(diào)控作用。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)FSCN1與結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移有關(guān)，從而推測出FSCN1通過調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT進(jìn)而促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，為結(jié)腸癌的診治提供了新的思路。