噴施KH2PO4對孕穗期低溫脅迫下小麥葉片抗氧化特性與幼穗凍害的影響

蘇 慧，李金鵬，胡燕美，朱玉磊，李金才，宋有洪

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，安徽合肥 230036)

黃淮海平原是我國最大的小麥生產(chǎn)基地，該地區(qū)小麥年生產(chǎn)量占全國的70%左右[1]。近幾十年來，隨著全球氣候變暖，極端低溫發(fā)生的頻率、強(qiáng)度和持續(xù)時間都在不斷的增加[2-3]，低溫冷害對世界各國小麥生產(chǎn)均產(chǎn)生了很大影響[4-6]。孕穗期是小麥幼穗發(fā)育的關(guān)鍵生育時期，該階段幼穗對溫度反應(yīng)敏感，此時期的低溫冷害會對小麥生產(chǎn)帶來較大影響[7]。研究表明，孕穗期低溫脅迫主要影響小穗發(fā)育，進(jìn)而影響幼穗結(jié)實(shí)性，尤其是上部小穗在凍害發(fā)生后容易會出現(xiàn)變白現(xiàn)象或部分死亡，嚴(yán)重時造成小麥大幅減產(chǎn)[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，在小麥孕穗期0 ℃連續(xù)處理3 d，單株產(chǎn)量較對照降低87.9%～97.8%[10]。孕穗期低溫脅迫會引起小麥植株發(fā)生一系列的變化，包括代謝酶的失活[11]、滲透物質(zhì)的積累[12-13]、內(nèi)源激素含量及光合特性的改變[14]，最終影響小麥小穗發(fā)育和物質(zhì)運(yùn)輸。

利用外源物質(zhì)減輕作物遭受逆境脅迫后的危害已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一，常見的外源物質(zhì)有KH2PO4[15]、水楊酸[16]、脫落酸[17]、海藻糖[18]、胺類物質(zhì)[19]等。KH2PO4是一種磷鉀高效復(fù)合肥，具有促進(jìn)葉片光合作用、增強(qiáng)作物抗逆性的功能。因?yàn)殁涬x子(K+)在植物體內(nèi)能通過影響葉綠素的降解和淀粉的合成等方式來調(diào)節(jié)作物的光合作用[20]，并且K+能夠維持同化物向韌皮部的運(yùn)輸，因而增加K+營養(yǎng)供應(yīng)可提高植物對低溫脅迫的耐受性[21]。研究發(fā)現(xiàn)，水稻孕穗期葉面噴施KH2PO4后群體葉面積指數(shù)提高，群體干物質(zhì)積累量顯著增加[22]。在水稻穗分化期低溫條件下噴施KH2PO4能提高穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重，進(jìn)而達(dá)到增產(chǎn)的效果[23]。小麥孕穗期噴施KH2PO4能提高葉片光合性能，增強(qiáng)抗氧化酶活性，顯著提高小麥產(chǎn)量[24]。盡管KH2PO4在不同作物中的逆境調(diào)節(jié)具有重要作用，且發(fā)現(xiàn)KH2PO4在15 mmol·L-1(0.2%)的濃度下效果更佳[25]，但是目前在小麥孕穗期低溫脅迫發(fā)生前噴施KH2PO4對幼穗凍害的緩解作用及其調(diào)控機(jī)理尚不明確。

鑒于此，本研究針對黃淮海麥區(qū)小麥生產(chǎn)中面臨的孕穗期低溫脅迫問題，以兩種抗寒性不同的小麥為試驗(yàn)材料，低溫處理前葉面噴施0.2% KH2PO4溶液，考察低溫后小麥幼穗凍害情況以及小穗形態(tài)和旗葉生理特征和結(jié)實(shí)率的變化，探討孕穗期噴施KH2PO4對小麥低溫脅迫的緩解作用，以期為黃淮海麥區(qū)倒春寒防控提供理論 參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選用煙農(nóng)19(冬性、低溫不敏感型)和新麥26(半冬性、低溫敏感型)為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2018-2019年在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)萃園(北緯N31°52′0.99″，東經(jīng)E117°16′57.72″)進(jìn)行。試驗(yàn)采用盆栽種植，盆栽土壤取自于農(nóng)萃園土壤耕層(0～20 cm土層)。耕層土壤有機(jī)質(zhì)含量10.6 g·kg-1，全氮含量1.13 g·kg-1，速效氮含量 81.5 mg·kg-1，速效磷含量33.1 mg·kg-1，速效鉀含量 76.2 mg·kg-1。盆缽直徑為30 cm，高度為25 cm，每盆裝土10 kg。全生育期施225 kg N·hm-2、120 kg P2O5·hm-2和120 kg K2O·hm-2，其中磷肥、鉀肥作為基肥一次性施入，氮肥的基追比例為5∶5(拔節(jié)期追肥)。基肥按目標(biāo)施肥量計(jì)算，采用稀釋法與土壤混合拌勻，裝入盆缽里；拔節(jié)肥于葉齡余數(shù)2.5葉時追施。播種前每盆澆水800 mL，播種后覆 1 cm土。播種期為2018年10月20日，每盆播種16粒種子，三葉期定苗，最終留苗8株，每品種播40盆，田間管理按一般高產(chǎn)栽培要求進(jìn)行。在超低溫光照培養(yǎng)箱(DGXM-1008，寧波江南儀器廠)中進(jìn)行低溫處理。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于小麥孕穗期選取植株長勢一致的盆缽，進(jìn)行一次低溫處理(2 ℃和-2 ℃)，低溫時間為23:00-04:00，其他時間設(shè)置15 ℃。在低溫處理前兩天的上午8：00-9：00(晴朗無風(fēng))葉面噴施0.2% KH2PO4溶液，連續(xù)兩次，每盆每次噴施量為200 mL，以噴施等量清水為對照。處理結(jié)束后移至自然條件下生長至成熟。

1.4 測定項(xiàng)目與方法

1.4.1 小穗凍害程度等級的劃分

在低溫后10 d(凍害癥狀已經(jīng)完全顯示)，每盆隨機(jī)抽取5株小麥，三次重復(fù)。調(diào)查主莖小穗的凍害情況，根據(jù)全國小麥區(qū)域試驗(yàn)凍害5級指標(biāo)進(jìn)行凍害程度的調(diào)查。0級：幼穗未產(chǎn)生傷害；1級：幼穗<1/3受到傷害；2級：幼穗1/3～1/2受到傷害；3級：幼穗1/2～3/4受到傷害；4級：幼穗>3/4受到傷害或全部凍死。

凍害發(fā)生率=達(dá)到凍害級別的莖蘗數(shù)/總莖蘗數(shù)×100%

凍害指數(shù)=∑[凍害等級(0級以上)×凍害發(fā)生率]/4

1.4.2 綠素含量的測定

低溫結(jié)束第一天取各處理小麥旗葉待測。采用浸提法[26-27]測定旗葉的葉綠素含量，低溫環(huán)境下取5片旗葉剪碎混合均勻后稱取0.2 g，三次重復(fù)，加入5 mL N,N-二甲基甲酰胺，于4 ℃避光條件下浸提24 h至葉片完全變白后過濾，過濾浸提液采用UV-1800紫外可見分光光度計(jì)(日本，島津)分別測量647 nm、664 nm和470 nm下OD值，計(jì)算葉綠素(葉綠素a、葉綠素b和胡蘿卜素三者的總和)含量。

1.4.3 酶活性測定

低溫結(jié)束第一天取各處理小麥旗葉0.1 g，重復(fù)三次，用液氮研磨，加5 mL 0.05 mol·L-1磷酸緩沖液(PBS，pH=7.8；0.1% PVPP)，低溫冷凍離心機(jī)離心，上清液即為所需酶液。過氧化物酶(POD)活性測定參考愈創(chuàng)木酚法[28]。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法測定[29]。采用紫外吸收法測定過氧化氫酶(CAT)活性[30]。以每分鐘OD值變化 0.1為一個酶活單位。

1.4.4 丙二醛(MDA)含量的測定

低溫結(jié)束后第一天取各和目不暇接小麥旗葉0.5 g，重復(fù)三次，加5% TCA 5 mL研磨后所得勻漿在3 000 r·min-1下離心10 min，得上清液。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法[31]。

1.4.5 主莖穗上部內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察

低溫結(jié)束第一天取各處理主莖穗上部小穗待測。將新鮮上部小穗立即用配好的FAA固定液(50%酒精∶乙酸∶甲醛=90∶5∶5)固定24 h，置于4 ℃冰箱保存用于后續(xù)制作石蠟切片，石蠟切片制作方法采用番紅-固綠雙重染色法[32]。

1.4.6 主莖穗上部糖含量的測定

低溫結(jié)束第一天取各處理小麥主莖穗上部，105 ℃殺青后70 ℃烘干至恒重，再將樣品研磨成粉末，過篩(40目)。稱取樣品粉末0.05 g，三次重復(fù)，加入 2 mL 80%的酒精，混合均勻，80 ℃恒溫水浴浸提40 min，于4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，重復(fù)浸提兩次，合并上清液，用80%酒精定容至8 mL，再加10 mg活性炭吸附色素40 min，用濾紙過濾去除活性炭，濾液即為所需提取液。

蔗糖含量測定采用間苯二酚法[33]，測量其485 nm處的吸光度值，用蔗糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線；果糖含量測定也采用間苯二酚法[34]，取0.4 mL提取液，加入0.8 mL 0.1%間苯二酚，2.8 mL 30% HCl，80 ℃下溫育10 min，置于流水冷卻，在測量其480 nm處的吸光度值，用果糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線；還原糖含量測定采用3.5-二硝基水楊酸法(DNS法)[35]，測定其540 nm處的吸光度值，以葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.7 主莖結(jié)實(shí)率測定

在小麥成熟后，隨機(jī)收取10株主莖穗，三次重復(fù)，調(diào)查單株結(jié)實(shí)率，求主莖穗的平均結(jié)實(shí)率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan分析方法進(jìn)行多重比較，并使用Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施KH2PO4對孕穗期低溫下小麥小穗凍害程度的影響

隨著溫度的降低，小麥小穗凍害程度加重(表1)。2 ℃下僅發(fā)生1、2和3級凍害，無4級凍害；-2 ℃下開始出現(xiàn)4級凍害，2級和3級凍害發(fā)生率增加，凍害指數(shù)呈上升趨勢。低溫處理下，新麥26輕度凍害發(fā)生率顯著低于煙農(nóng)19，而其2級、3級和4級凍害發(fā)生率顯著高于煙農(nóng)19；同一溫度下，噴施KH2PO4能顯著提高輕度凍害發(fā)生率，顯著降低2級、3級和4級的凍害發(fā)生率，兩品種的凍害指數(shù)在2 ℃和-2 ℃下分別降低至0.20～0.27和0.25～0.30?？傊?，噴施KH2PO4能顯著降低幼穗凍害指數(shù)，-2 ℃下緩解效果好于 2 ℃，與新麥26相比，煙農(nóng)19噴施降低凍害效果更明顯。

表1 噴施KH2PO4對孕穗期低溫下小麥幼穗凍害發(fā)生率的影響Table 1 Effect of KH2PO4 spraying on freezing injury rate of young spike of wheat under low temperature at the booting stage

2.2 噴施KH2PO4對孕穗期低溫下小麥旗葉葉綠素含量的影響

低溫導(dǎo)致小麥旗葉葉綠素含量顯著下降。噴施0.2% KH2PO4能顯著提高小麥旗葉的葉綠素含量(圖1)。與噴施清水對照相比，噴施KH2PO4后，噴施煙農(nóng)19和新麥26的葉綠素含量在2 ℃下分別提高21.2%和17.7%，在-2 ℃下分別提高了14.8%和11.3%，說明孕穗期低溫前噴施0.2% KH2PO4能維持較高的葉片葉綠素含量，從而有利于降低低溫危害程度。

2.3 噴施KH2PO4對孕穗期低溫下小麥旗葉保護(hù)性酶活性的影響

由表2可知，隨著溫度降低，兩個小麥品種旗葉的三種保護(hù)性酶活性均顯著提高；同一溫度下，噴施KH2PO4能顯著提高小麥旗葉的保護(hù)性酶活性。與噴施等量清水相比，噴施KH2PO4后，煙農(nóng)19和新麥26的SOD、POD和CAT活性在2 ℃下分別提高了13.4%、78.4%、58.4%和 7.5%、67.0%和50.4%，在-2 ℃下分別提高了 5.9%、12.3%、26.7%和19.7%、1.0%、14.9%。

相同品種圖柱上不同小寫字母表示處理間差異顯著(P< 0.05)。圖2和圖4同。

表2 噴施KH2PO4對孕穗期低溫下小麥旗葉保護(hù)性酶活性的影響Table 2 Effect of KH2PO4 spraying on protective enzyme activity in flag leaves of wheat under low temperature at booting stage

由此可知，噴施KH2PO4能顯著提高旗葉的抗氧化能力，有利于增強(qiáng)小麥抗逆性，在2 ℃下效果較明顯。

2.4 噴施KH2PO4對孕穗期低溫下小麥旗葉MDA含量的影響

小麥旗葉的MDA含量隨著溫度的降低而升高(圖3)。相比于噴施清水對照，噴施KH2PO4后煙農(nóng)19旗葉的MDA含量在2 ℃和-2 ℃下分別降低了5.7%和22.1%，新麥26旗葉的MDA含量分別降低了12.1%和31.0%；其中，在-2 ℃下噴施KH2PO4對小麥旗葉MAD含量的影響達(dá)顯著水平。這表明噴施KH2PO4能不同程度減輕低溫脅迫對小麥的膜脂損傷。

圖2 噴施KH2PO4對孕穗期低溫下小麥旗葉MDA含量的影響

2.5 噴施KH2PO4對孕穗期低溫下小麥主莖穗上部細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

從小穗解剖結(jié)果可以看出，低溫影響小麥主莖穗上部細(xì)胞解剖結(jié)構(gòu)。隨著溫度的降低，細(xì)胞損傷程度加重，薄壁細(xì)胞變形，核糖體數(shù)目減少，開始產(chǎn)生質(zhì)壁分離。與2 ℃下的細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)圖3A)相比，在-2 ℃下煙農(nóng)19小穗的薄壁細(xì)胞較明顯變形，結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，核糖體數(shù)目明顯減少；新麥26的損傷程度更嚴(yán)重(圖3C)。與噴施清水對照相比，噴施KH2PO4后小麥主莖穗上部核糖體數(shù)目增多，核仁凝集程度更高，基粒片層排列整齊、規(guī)則，細(xì)胞活性較高(圖3B、D、F、H)。由此可見，噴施KH2PO4能緩解低溫脅迫對上部小穗的影響，維持細(xì)胞完整性，保證器官的正常功能。

2.6 噴施KH2PO4對孕穗期低溫下小麥主莖穗上部可溶性糖含量的影響

隨著溫度的降低，主莖穗上部的蔗糖和果糖含量上升，還原糖含量下降(表2)。與噴施清水對照相比，噴施KH2PO4后蔗糖和果糖的含量顯著降低，降幅分別為5.6%～63.1%和12.2%～ 27.5%；而還原糖含量顯著提高，增幅4.4%～ 33.2%。由此可見，噴施KH2PO4能通過改變糖含量和組成來調(diào)整細(xì)胞液濃度，從而對低溫傷害起到減輕作用。

2.7 噴施KH2PO4對孕穗期低溫下小麥結(jié)實(shí)性的影響

兩個品種小麥的結(jié)實(shí)率隨著溫度的降低而顯著下降(圖4)。相比于噴施清水對照，噴施KH2PO4后，煙農(nóng)19和新麥26的結(jié)實(shí)率在2 ℃下分別提高17%和10%，在-2 ℃下分別提高11%和8%，說明孕穗期低溫發(fā)生前噴施KH2PO4能顯著增強(qiáng)小麥穗結(jié)實(shí)能力，有利于產(chǎn)量形成。

A～D表示煙農(nóng)19的四個不同處理：A表示2 ℃對照，B表示2 ℃噴施KH2PO4，C表示-2 ℃對照，D表示-2 ℃噴施KH2PO4,E～H表示新麥26的四個不同處理，順序同煙農(nóng)19。

表3 噴施KH2PO4對孕穗期低溫下小麥主莖穗上部糖含量的影響Table 3 Effect of KH2PO4 spraying on contents of soluble sugar of main stem spikes of wheat under low temperature stress at booting stage

3 討 論

研究表明，春季低溫脅迫對小麥穗數(shù)和穗粒數(shù)有顯著的影響[36]，尤其是孕穗期低溫脅迫可導(dǎo)致小麥穗粒數(shù)降幅達(dá)55.1%，這也是低溫脅迫下小麥產(chǎn)量降低的主要原因[37]。小麥孕穗期遭遇低溫主要加速了幼穗中小花退化，減少可育小花數(shù)和結(jié)實(shí)籽粒數(shù)，從而致使小麥結(jié)實(shí)率大幅度下降[38]。研究發(fā)現(xiàn)，通過葉片噴施外源物質(zhì)能一定程度上可降低低溫脅迫對小麥帶來的危害[39-40]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，孕穗期低溫處理后小麥結(jié)實(shí)率下降，而不同低溫處理前通過葉面噴施KH2PO4則顯著降低了低溫危害程度，相比于噴施清水處理，兩個品種下噴施KH2PO4小麥的結(jié)實(shí)率分別提高了11%～17%和8%～10%(圖4)。由此說明，小麥孕穗期低溫脅迫前噴施 0.2% KH2PO4可通過增強(qiáng)穗結(jié)實(shí)能力來緩解對小麥產(chǎn)量形成帶來的不利影響。

圖4 噴施KH2PO4對孕穗期低溫下小麥結(jié)實(shí)率的影響

孕穗期是小麥幼穗發(fā)育的關(guān)鍵生育時期，該時期小穗對低溫十分敏感，低溫脅迫會導(dǎo)致小穗畸形發(fā)育[41]。此外，小麥穗上部發(fā)育進(jìn)程遲于中部，孕穗期低溫脅迫更容易對小麥上部小穗的結(jié)構(gòu)造成更大程度的破壞，導(dǎo)致物質(zhì)向小穗運(yùn)輸過程受阻，進(jìn)而造成籽粒敗育，降低結(jié)實(shí)率[42]。本研究發(fā)現(xiàn)，噴施KH2PO4均明顯提高了小麥穗上部不同器官細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使器官內(nèi)細(xì)胞之間排列更加緊密，細(xì)胞核的數(shù)目明顯增多(圖3)；同時，噴施KH2PO4能減輕小麥幼穗的凍害程度，顯著降低了小麥在不同低溫脅迫下的凍害指數(shù)(表1)，且均在-2 ℃的減輕效果更明顯。孕穗期低溫發(fā)生前噴施KH2PO4顯著地降低了主莖穗上部的蔗糖和果糖的含量，提高了其還原糖的含量，說明KH2PO4能促進(jìn)小麥植株滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)快速恢復(fù)，推動了小麥由受凍緩慢生長向正常生長的轉(zhuǎn)變，這與李春燕等[43]研究成果較為 一致。

旗葉作為小麥的主要光合器官，其光合性能對小麥其他部位的物質(zhì)供應(yīng)有很大的影響。葉片充足的物質(zhì)生產(chǎn)及供應(yīng)能力對保證幼穗的物質(zhì)供應(yīng)和提高抗逆性具有重要的作用。研究表明，低溫會破壞小麥葉片中葉綠體和葉肉細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，引起葉綠素含量下降，降低葉片光合性能[44]。KH2PO4作為一種重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)，在作物關(guān)鍵生育時期噴施可以增強(qiáng)葉片抗逆性，提高物質(zhì)生產(chǎn)能力，從而增加干物質(zhì)積累量和產(chǎn)量[22-24]。本研究結(jié)果表明，降低溫度導(dǎo)致小麥旗葉的葉綠素含量下降，提高保護(hù)性酶活性，而在相同低溫下噴施KH2PO4后小麥旗葉的葉綠素含量和保護(hù)性酶活性均顯著提高，從而能降低逆境下產(chǎn)生的活性氧對葉片的不利影響?？傊驹囼?yàn)結(jié)果表明了小麥孕穗期低溫前噴施KH2PO4可降低低溫脅迫對葉片的物質(zhì)生產(chǎn)及供應(yīng)能力的不利影響，有利于減輕凍害對幼穗的傷害。

本研究進(jìn)一步證實(shí)孕穗期低溫脅迫前噴施KH2PO4能起到減輕低溫對小麥傷害，但有關(guān)KH2PO4在小麥春季低溫脅迫防控中對小麥不同部位小穗、小花育性的影響及其分子機(jī)制尚需進(jìn)一步的探究。

4 結(jié) 論

孕穗期低溫處理前每盆噴施200 mL 0.2% KH2PO4能提高旗葉光合生產(chǎn)對穗部的物質(zhì)供應(yīng)，調(diào)控低溫對小麥旗葉和穗部生理的影響，有效抑制低溫對小麥幼穗的損傷，降低低溫對小麥產(chǎn)量造成的損失。噴施KH2PO4緩解機(jī)制主要體現(xiàn)在旗葉清除活性氧能力的提高，維持葉片光合性能，從而保證旗葉對小穗發(fā)育的物質(zhì)供應(yīng)，提升了小穗結(jié)構(gòu)完整性與糖含量。