右美托咪定改善術(shù)后早期認(rèn)知功能障礙的研究

胡雅娟，胡格吉胡

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 麻醉科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

隨著外科手術(shù)操作技術(shù)的日益提高，接受外科手術(shù)的患者越來越多，與此同時(shí)，麻醉藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響也備受關(guān)注。有研究[1]顯示麻醉藥物在產(chǎn)生麻醉的同時(shí)對神經(jīng)元具有一定的毒性，并產(chǎn)生一系列中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，增加患者住院時(shí)間，產(chǎn)生并發(fā)癥，從而增加患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。術(shù)后認(rèn)知 功 能 障 礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）作為術(shù)后主要的并發(fā)癥，是指手術(shù)干預(yù)后新出現(xiàn)的認(rèn)知能力下降，臨床常見表現(xiàn)為認(rèn)知水平降低、精神錯(cuò)亂、記憶力下降、語言能力受損、情感焦慮等。根據(jù)發(fā)生的時(shí)間劃分為早期和長期認(rèn)知能力下降，前者為術(shù)后7天內(nèi)發(fā)生的POCD；后者為術(shù)后持續(xù)3個(gè)月以上出現(xiàn)的POCD。POCD發(fā)病機(jī)制目前尚未明了，有學(xué)者[2，3]認(rèn)為中樞炎癥反應(yīng)是其中心環(huán)節(jié)，因此如何發(fā)揮抗炎效應(yīng)進(jìn)行腦保護(hù)是改善POCD的主要切入點(diǎn)。

右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）作為一種選擇性高的α2受體激動劑，本身具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮作用，目前在臨床得到廣泛應(yīng)用。圍術(shù)期的鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛可以使用右美托咪定，大量資料通過多中心、大樣本臨床研究證實(shí)右美托咪定對POCD有確切的療效[4，5]。本研究建立動物模型，旨在證實(shí)右美托咪定能夠改善大鼠手術(shù)后的認(rèn)知功能，進(jìn)而探究右美托咪定改善POCD的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 動物手術(shù)模型制備

SD大鼠經(jīng)腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，確認(rèn)麻醉成功后實(shí)施剖腹探查術(shù)，常規(guī)完成備皮，使用4.5%～5.5%碘伏消毒切口2遍，鋪無菌洞巾，于大鼠上腹部正中部位作大約3 cm長的一個(gè)縱行切口，逐層解剖進(jìn)入腹腔后行剖腹探查術(shù)，依次探查大鼠的肝臟、脾、胃和腸道等臟器，手術(shù)探查時(shí)間大約為30 min。剖腹探查手術(shù)嚴(yán)格遵循無菌原則，手術(shù)操作過程避免副損傷，生理鹽水清洗腹腔，同時(shí)腹腔注射青霉素防止感染，充分止血。術(shù)中大鼠體溫保持在恒定的狀態(tài)，術(shù)畢蘇醒后再將大鼠放回飼養(yǎng)籠內(nèi)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組和干預(yù)措施

從術(shù)前3天開始，每天對所有大鼠進(jìn)行Morris水迷宮適應(yīng)性訓(xùn)練。將大鼠麻醉后進(jìn)行剖腹探查術(shù)，術(shù)后24 h對大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測試，包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。將定位航行實(shí)驗(yàn)中60 s找不到平臺的大鼠標(biāo)記為POCD大鼠。納入本研究的50只大鼠進(jìn)行數(shù)字隨機(jī)分組，其中生理鹽水對照組25只（對照組）、右美托咪定組25只（DEX組）。

干預(yù)措施：DEX組大鼠經(jīng)腹腔注射DEX 25 μg/kg，對照組則經(jīng)腹腔注射等量的生理鹽水。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 Morris水迷宮測試Morris水迷宮測試系統(tǒng)主要由攝像機(jī)、監(jiān)視器、廣角變焦鏡頭、圖像采集卡及motanaly軟件等記錄顯示系統(tǒng)組成。將水迷宮平臺放在西南象限（第三象限）正中距池壁22 cm處，迷宮中放置牛奶液面高于安全平臺1 cm，水溫（22±0.5）℃，室溫25℃，訓(xùn)練期間保持環(huán)境安靜，迷宮外的參照物不變。

1.3.2 定位航行測試 通過定位航行測試大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。在術(shù)前3天每天對受試大鼠進(jìn)行訓(xùn)練，從固定相對的兩個(gè)象限入水點(diǎn)依次加以訓(xùn)練，將受試大鼠放入水中且面向池壁，記錄入水大鼠的逃避潛伏期（從入水開始，計(jì)算找到安全平臺的時(shí)間）。在剖腹探查術(shù)后3天、7天對大鼠進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 空間探索能力 大鼠對平臺空間位置的記憶力可以反映空間探索能力。術(shù)前進(jìn)行適應(yīng)性測試，3天后去掉測試平臺，從固定的象限入水點(diǎn)將大鼠放入水中并面向池壁，記錄大鼠120 s內(nèi)穿過原平臺位置的次數(shù)和在原平臺象限即第四象限探索時(shí)間（探索時(shí)間）作為空間記憶成績。干預(yù)結(jié)束后3天、7天分別對各組大鼠進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄探索時(shí)間。

1.4 Western Blot

右美托咪定或生理鹽水干預(yù)結(jié)束后72 h，從各組分別隨機(jī)抓取3只大鼠，取海馬組織加入適量蛋白裂解液，將組織置于4℃，15000r/min離心15 min后取上清液，取25 μL，利用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定。隨后將樣本加入點(diǎn)泳凝膠（5%濃縮膠，12%分離膠）中，在60 V，40 mA條件下電泳2.5 h，隨后將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜中，之后用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，TBST洗3次，5 min/次，隨后加入一抗抗體，4℃環(huán)境下孵育過夜，TBST洗2次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗IgG后室溫孵育50 min，TBST洗3次，5 min/次。將濾膜置于ECL顯色液中反應(yīng)1 min，計(jì)算機(jī)掃描圖像，并由生物圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn)后，將正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，偏態(tài)分布的計(jì)量資料則采用中位數(shù)表示，計(jì)量資料數(shù)據(jù)組間比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測量資料采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法加以分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮測試結(jié)果

術(shù)后3天兩組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，DEX組有更多的大鼠能徑直游往平臺，定向能力明顯強(qiáng)于對照組（見圖1）。

圖1 Morris水迷宮軌跡圖

2.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果 術(shù)后第3天、第7天DEX組大鼠潛伏期時(shí)長較對照組的潛伏期明顯降低，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。

表1 兩組大鼠術(shù)后水迷宮潛伏期時(shí)長的比較（±s）

表1 兩組大鼠術(shù)后水迷宮潛伏期時(shí)長的比較（±s）

P術(shù)后3天術(shù)后7天P DEX組33.5±2.1 25.2±1.9＜0.01對照組44.2±3.9 35.9±2.4＜0.01＜0.01＜0.01

2.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果 術(shù)后第3天、第7天DEX組大鼠平臺穿越次數(shù)較對照組明顯上升，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；組內(nèi)不同時(shí)點(diǎn)比較，術(shù)后7天大鼠平臺穿越次數(shù)比術(shù)后3天明顯上升（P＜0.05）（見表2）。

表2 兩組大鼠術(shù)后水迷宮測試平臺穿越次數(shù)的比較（±s）

表2 兩組大鼠術(shù)后水迷宮測試平臺穿越次數(shù)的比較（±s）

DEX組3.1±0.7 3.7±0.6＜0.05對照組1.8±0.5 2.7±0.6＜0.05 P術(shù)后3天術(shù)后7天P＜0.01＜0.01

2.2 DEX對大鼠海馬相關(guān)蛋白的作用

與對照組比較，DEX組IBAI、β-actin蛋白的表達(dá)水平明顯降低（見圖2）。

圖2 Western blot結(jié)果圖

3 討論

麻醉和手術(shù)創(chuàng)傷誘發(fā)的中樞神經(jīng)功能減退可引起POCD。記憶受損是POCD的核心癥狀。記憶的形成是一個(gè)時(shí)間依賴性過程，記憶形成必須經(jīng)過時(shí)間強(qiáng)化，研究表明記憶的強(qiáng)化常常從記憶訓(xùn)練結(jié)束開始，后續(xù)可持續(xù)數(shù)小時(shí)[6]，本研究在術(shù)前對受試大鼠進(jìn)行了3天的水迷宮訓(xùn)練，形成了一定的記憶基礎(chǔ)。

近年來實(shí)驗(yàn)研究重點(diǎn)主要側(cè)重于對中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥通路激活后蛋白表達(dá)以及炎癥對中樞神經(jīng)的損傷的研究[7]。此外，手術(shù)創(chuàng)傷引起POCD也是中樞神經(jīng)損傷的重要表現(xiàn)。海馬區(qū)是負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)記憶的主要部位，也是神經(jīng)細(xì)胞最容易受損的部位，小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，是多種信號傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控多種靶基因（細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子及氧化應(yīng)激相關(guān)酶等）的表達(dá)[8]。NF-κB平時(shí)存在于神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，處于非活性狀態(tài)，受多種因素刺激活化后，可發(fā)生磷酸化，解離后轉(zhuǎn)位入核，參與調(diào)節(jié)多種靶基因，活化小膠質(zhì)細(xì)胞，激活其下游的炎癥因子信號通路，參與POCD的發(fā)生與進(jìn)展[7]。POCD的發(fā)生發(fā)展與中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞的異常活化有關(guān)，NFκB-MMP-9信號通路是介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨闹匾罚狙芯客ㄟ^Western blot測試了蛋白表達(dá)，提示右美托咪定通過降低大鼠海馬相關(guān)蛋白IBAI、βactin的表達(dá)，從而影響NF-κB-MMP-9信號通路的表達(dá)，進(jìn)一步起到積極防治術(shù)后認(rèn)知功能障礙的作用。

右美托咪定具有鎮(zhèn)靜、輔助鎮(zhèn)痛、抗焦慮作用，臨床證實(shí)其還具有抗炎、抗交感以及較輕的呼吸抑制的作用。有相關(guān)研究比較行髖關(guān)節(jié)手術(shù)的患者術(shù)中使用右美托咪定或丙泊酚輔助鎮(zhèn)靜對術(shù)后認(rèn)知功能的影響，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)用右美托咪定的患者術(shù)后早期發(fā)生認(rèn)知功能障礙的發(fā)病率更低，術(shù)后能早期下床完成恢復(fù)功能訓(xùn)練，加速康復(fù)，且出院時(shí)間更早，從而得出相關(guān)結(jié)論，即老年患者行髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)，應(yīng)用右美托咪定能加速改善患者的短期康復(fù)效果[9]。也有相關(guān)研究觀察右美托咪定對患者主觀睡眠質(zhì)量的影響，結(jié)果顯示右美托咪定能縮短重癥監(jiān)護(hù)室的治療時(shí)間，增加術(shù)后早期出院率，且未增加術(shù)后不良事件的發(fā)生[10]。另有研究顯示，術(shù)中應(yīng)用七氟烷的患者，在麻醉恢復(fù)期會導(dǎo)致認(rèn)知功能下降，具體發(fā)生機(jī)制可能與手術(shù)創(chuàng)傷應(yīng)激、機(jī)體炎癥、免疫功能障礙、麻醉深度等有關(guān)，而在應(yīng)用七氟醚的基礎(chǔ)上聯(lián)合使用右美托咪定，可減少麻醉藥七氟醚的用量，并且能降低術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率[11]。兒科患者行扁桃體切除術(shù)后最常見的不良事件是POCD，臨床特征以意識受損和思維模式紊亂為主[12]。有研究觀察到，扁桃體切除患兒應(yīng)用右美托咪定，術(shù)后早期認(rèn)知功能障礙患兒的血漿皮質(zhì)醇水平發(fā)生了改變，且相關(guān)性分析結(jié)果表明，皮質(zhì)醇水平與認(rèn)知功能障礙風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)[13]。因此，研究結(jié)論認(rèn)為右美托咪定的應(yīng)用可降低患兒術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生。Li等[14]的臨床研究發(fā)現(xiàn)，通過比較應(yīng)用不同劑量的右美托咪定，患者POCD的發(fā)生率存在差異，劑量大的右美托咪定組POCD發(fā)生率明顯低于劑量低的右美托咪定組，說明右美托咪定臨床抗炎及腦保護(hù)作用與劑量存在相關(guān)性。水迷宮實(shí)驗(yàn)是動物實(shí)驗(yàn)中評估POCD的主要方法。

在動物實(shí)驗(yàn)方面，有研究人員[15]建立POCD小鼠模型，結(jié)果顯示右美托咪定可降低小鼠海馬內(nèi)炎癥因子的表達(dá)，包括IL-1β、TNF-α及細(xì)胞凋亡相關(guān)因子caspase-3，同時(shí)右美托咪定可減少相關(guān)蛋白的沉積，包括β淀粉樣蛋白（Aβ）、tau蛋白，行為學(xué)測試結(jié)果顯示右美托咪定能明顯改善小鼠術(shù)后的認(rèn)知功能，從而提示海馬內(nèi)炎性反應(yīng)與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡可促進(jìn)POCD的發(fā)生，加以證實(shí)右美托咪定對腦細(xì)胞有保護(hù)作用，且能降低神經(jīng)炎癥反應(yīng)[16]。本研究分別給予手術(shù)創(chuàng)傷模型大鼠腹腔注射右美托咪定和生理鹽水加以比較，可以從水迷宮實(shí)驗(yàn)中看出右美托咪定明顯改善POCD。然而由于經(jīng)費(fèi)有限，本研究未完成相關(guān)炎性因子的測定和POCD關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的β淀粉樣蛋白（Aβ）、tau蛋白的檢測，后續(xù)研究中可以進(jìn)一步完成。綜上所述，右美托咪定可以明顯改善大鼠術(shù)后的認(rèn)知功能，但具體機(jī)制仍需要加以研究。