四種替米考星制劑在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

錢(qián)坤 張浩 劉學(xué)慧 曹蕊 安同偉 楊慧杰 李平

摘? ? 要：為評(píng)價(jià)四種替米考星制劑在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)，試驗(yàn)采用高效液相分析法（HPLC），對(duì)32頭體重70 kg左右健康杜長(zhǎng)大豬（雌雄各半）進(jìn)行研究。結(jié)果表明，替米考星無(wú)論是內(nèi)服還是皮下注射給藥，吸收均極為迅速，達(dá)峰快，血液中藥物半衰期長(zhǎng)，藥物組織穿透力強(qiáng)，體內(nèi)分布容積大，在組織中藥物濃度高，維持時(shí)間長(zhǎng)，這些特殊的藥動(dòng)學(xué)特性尤其適合于家畜肺炎、乳房炎等感染性疾病的治療，可安全用于臨床。

關(guān)鍵詞：替米考星; 豬; 藥代動(dòng)力學(xué); 血藥濃度; 穩(wěn)定性試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào)：S859.79? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.08.008

Pharmacokinetics of? Four Tilmicosin Preparations in Swines

QIAN Kun1， ZHANG Hao1， LIU Xuehui1， CAO Rui2， AN Tongwei3， YANG Huijie4， LI Ping5

（1. Tianjin Agricultural Ecological Environment Monitoring and Agricultural Product Quality Testing Center， Tianjin 300402， China; 2. Tianjin Animal Disease Prevention and Control Center， Tianjin 300402， China; 3. Tianjin Heliente Biotechnology Limited Company，? Tianjin 301702， China; 4.Liaoning Inspection and Testing Certification Center， Liaoning 110016， China; 5. Tianjin Academy of Agricultural Sciences，? Tianjin 300381， China）

Abstract： In order to evaluate the pharmacokinetics of four tilmicosin preparations in swines， 32 healthy Duroc Landrace swines （half male and half female） weighing about 70 kg were studied by High Pertormance Liquid Chromatography（HPLC）. The results showed that： the absorption was very fast， the peak reached quickly， the half-life of drug in blood was long， the drug tissue penetration was strong， the distribution volume in vivo was large， the drug concentration in tissue was high， and the maintenance time was long. These special pharmacokinetic properties were especially suitable for the treatment of infectious diseases such as domestic animal pneumonia and mastitis， and could be safely used in clinical practice.

Key words： tilmicosin; swine; pharmacokinetics; plasma concentration; stability test

替米考星（Tilmicosin）是美國(guó)禮來(lái)公司（Lilly）于20世紀(jì)80年代開(kāi)發(fā)的半合成的具有16環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)畜禽專(zhuān)用抗生素。替米考星具有強(qiáng)抗菌性，耐藥性低，抗菌譜廣，對(duì)所有的革蘭氏陽(yáng)性菌和部分革蘭氏陰性菌、霉形體、螺旋體等均有抑制作用，抗菌活性?xún)?yōu)于泰樂(lè)菌素、單諾沙星、土霉素、氟苯尼考和壯觀霉素等多種抗生素[1]。替米考星的抗菌機(jī)理與其他大環(huán)內(nèi)醋類(lèi)相似，與細(xì)菌的核蛋白體的50S大亞基相結(jié)合，作用于P位結(jié)合點(diǎn)，抑制轉(zhuǎn)移酶[2-4]，主要通過(guò)抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成而起到殺菌作用[5]。

Ose[6]報(bào)道替米考星對(duì)無(wú)乳葡萄球菌、金黃色葡萄球菌和產(chǎn)膿葡萄球菌的MIC分別為3.12，0.78，0.02 μg·mL-1。Modric等[7]報(bào)道給綿羊和牛皮下注射10 mg·kg-1替米考星，血中峰濃度分別為0.822，0.873 μg·mL-1，達(dá)峰時(shí)間分別為3.9，0.5 h。同時(shí)，比較了牛和綿羊的藥代動(dòng)力學(xué)特征，結(jié)果沒(méi)有差異。Thomson等[8]測(cè)定了替米考星按200 mg·kg-1和400 mg·kg-1飼料拌料給藥在豬體內(nèi)組織的濃度。Blackall等[9]用瓊脂稀釋法測(cè)得替米考星對(duì)澳大利亞臨床分離的51株多殺性巴氏桿菌的MIC≤12.5 μg·mL-1，其中48株高度敏感，3株中度敏感。用同樣的方法測(cè)得藥物對(duì)在澳大利亞臨床分離的25株多殺性巴氏桿菌的MIC≤3.12 μg·mL-1[10]。Inamoto等[11]報(bào)道，對(duì)日本1985—1989年間豬肺炎損害部位分離出的61株多殺性巴氏桿菌和35株胸膜肺炎放線桿菌的抗菌作用，大多數(shù)菌株對(duì)替米考星、金霉素敏感。Ziv等[12]報(bào)道了替米考星在奶牛的藥動(dòng)學(xué)特征，給藥30 min內(nèi)乳中藥物高于血液濃度近50倍，乳中消除半衰期為21.6 h。Ramadan等[13]報(bào)道了替米考星在奶牛和山羊體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，乳中濃度遠(yuǎn)高于血清中的藥物濃度。Keles等[14]報(bào)道了給家禽口服50 mg·kg-1.替米考星藥動(dòng)學(xué)符合有吸收的二室開(kāi)放模型。Thomson等[15]測(cè)定了替米考星按200，400 mg·kg-1飼料拌料給藥在豬體內(nèi)組織的濃度，相當(dāng)于10.97和21.34 mg·kg-1·d-1連續(xù)給藥14 d后肺組織中藥物濃度分別為0.73～1.43 μg·mL-1和1.11～2.59 mg·kg-1·d-1。從而證實(shí)約70%～80%替米考星的細(xì)胞分布是定位于溶酶體中。由此可見(jiàn)，家畜肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)替米考星的高度積累為臨床上肺炎的有效防治提供了基礎(chǔ)，即使血液和肺組織中藥物水平低于致病菌的MIC值。

1 材 料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

健康杜長(zhǎng)大豬32頭，體重70 kg左右，4月齡，雌雄各半。給藥前在清潔、安靜的環(huán)境下飼養(yǎng)7 d，每日定量喂給不含任何藥物的基礎(chǔ)日糧，自由飲水。

1.2 主要藥品

標(biāo)準(zhǔn)品： 替米考星標(biāo)準(zhǔn)品，含量95.0%，批號(hào)101655，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

供試樣品： 替米考星腸溶顆粒，規(guī)格：20%，瑞普（天津）生物藥業(yè)有限公司。

替米考星預(yù)混劑1，規(guī)格：20%，以C46H80N2O13計(jì)，北京康牧生物科技有限公司。

磷酸替米考星可溶性粉，規(guī)格：20%，以C46H80N2O13計(jì)，保定冀中藥業(yè)有限公司。

對(duì)照藥品：替米考星預(yù)混劑2，規(guī)格：20%，以C46H80N2O13計(jì)，北京康牧生物科技有限公司。

試驗(yàn)試劑： 二正丁胺（分析級(jí)），購(gòu)自天津市元立化工有限公司;磷酸（分析級(jí)），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙腈（色譜級(jí)），Sigma-Aldrich;甲醇（色譜級(jí)），Sigma-Aldrich;四氫呋喃（色譜級(jí)），購(gòu)自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1.3 主要儀器

高效液相色譜儀：Waters e2695，紫外檢測(cè)器：Waters 2489，沃特世科技（上海）有限公司;C18色譜柱： Sagix Copsil? ?C18（4.6×250 mm，5 μm）;C18固相萃取柱：Aglient Bond Eliut C18（500 mg/6 mL）;高速冷凍離心機(jī)：H1850R型，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;酸度計(jì)：PHS-3C型，上海精密科學(xué)儀器有限公司;水浴氮吹儀：CM-24型，北京成萌偉業(yè)科技有限公司;電子天平：BT25S、BSA224S-CW型，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司;渦旋混合器：VORTEX-5型，Kylin-Bell;可調(diào)微量移液器：Thermo。

1.4 替米考星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱(chēng)取替米考星標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于100 mL棕色容量瓶中，用流動(dòng)相配制成濃度為200 μg·mL-1的儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱保存，待需要時(shí)用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋配成所需濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2 方 法

2.1 動(dòng)物給藥、血樣采集和血樣處理

2.1.1 試驗(yàn)分組及給藥劑量 將32頭試驗(yàn)豬隨機(jī)分為4組，每組6頭，雌雄各半。前3組為受試藥物組，第四組為對(duì)照藥物組，其中第1組給予替米考星腸溶顆粒，第2組給予磷酸替米考星可溶性粉，第3組給予替米考星預(yù)混劑1，第4組給予替米考星預(yù)混劑2，給藥劑量均為20 mg·kg-1，均以替米考星計(jì)。

2.1.2 給藥方式 單劑量口服一次性給予。

2.1.3 血樣采集 給藥前（0 min）、給藥后15，30，45 min及1，2，3，4，6，8，10，12，18，24，36，48，60，72 h在前腔靜脈竇采集血液，采血量為5 mL，肝素鈉抗凝。血樣4 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液于另一管中保存在-20 ℃待測(cè)。

2.1.4 樣品的處理 確取混勻后的血漿樣品1 mL，加入3 mL提取液（乙腈：甲醇為95∶5（v∶v）），渦旋混勻，超聲5 min，3 500 r·min-1，4 ℃離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入10 mL水，混勻，即為樣品提取液。將C18固相萃取柱置于固相萃取裝置上，依次用10 mL甲醇和10 mL水平衡，將樣品提取液過(guò)柱，自然流干，依次加入10 mL水和10 mL乙腈洗滌，抽真空干燥3 min，用2.5 mL洗脫液洗脫，收集洗脫液，30 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?。?50 μL流動(dòng)相溶解，渦旋混勻，靜置15 min，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，供高效液相色譜分析。

2.2 色譜條件

色譜柱：Sagix Copsil? ? C18（4.6×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-四氫呋喃-1 mol·L-1二丁胺磷酸緩沖液，130+55+25，v/v/v;流速：1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量：100 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)：290 nm;柱溫：30 ℃。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

取空白血漿，分別加入標(biāo)準(zhǔn)工作液，制備成替米考星含量分別為0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，2.5 μg·mL-1的空白添加樣品。在選定的色譜條件下，按濃度從低到高的順序分別進(jìn)樣100 μL作HPLC分析。以替米考星濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

2.4 定量限和檢測(cè)限的測(cè)定

取空白血漿，分別加入標(biāo)準(zhǔn)工作液，制備成替米考星含量分別為0.005，0.01，0.02，0.05 μg·mL-1空白添加樣品，按樣品的處理方法處理。每個(gè)濃度各5個(gè)平行，測(cè)得基線噪音值，按信噪比S/N≥3為檢測(cè)限，S/N≥10為定量限。

2.5 精密度及回收率的測(cè)定

取空白血漿，分別加入標(biāo)準(zhǔn)工作液，制備成替米考星含量分別為0.02，0.5，2.5 μg·mL-1空白添加樣品，按樣品的處理方法處理，分別取100 μL進(jìn)行HPLC檢測(cè)。每批每個(gè)濃度平行設(shè)5個(gè)重復(fù)樣品，共進(jìn)行3個(gè)平行批次分析。根據(jù)測(cè)定結(jié)果分別計(jì)算出提取回收率、精密度及批內(nèi)和批間變異系數(shù)。

2.6 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

取空白血漿，添加標(biāo)準(zhǔn)工作液，使血漿中藥物濃度為0.5 μg·mL-1，在室溫、4 ℃及-20 ℃條件下分別存放于0，6，12，24，36，48 h后，用HPLC測(cè)定響應(yīng)值。

2.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用WinNonLin 8.1藥代動(dòng)力學(xué)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)。

3 結(jié)果與分析

3.1 血藥濃度的測(cè)定方法

3.1.1 色譜分離 分別吸取替米考星對(duì)照品血漿溶液、空白血漿溶液進(jìn)行樣品處理，按上述色譜條件測(cè)定。由血漿色譜圖可知目標(biāo)化合物的兩個(gè)峰與雜質(zhì)完全分離，無(wú)相互干擾，替米考星順式和反式異構(gòu)體的保留時(shí)間分別為11.5，9.8 min。實(shí)測(cè)血漿樣品與標(biāo)準(zhǔn)品峰值和保留時(shí)間一致，確定為替米考星物質(zhì)。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 分別取900 μL空白血漿，各添加100 μL替米考星系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，使血漿中替米考星的濃度分別為0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，2.5 μg·mL-1，將逐級(jí)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣檢測(cè)，以替米考星峰面積（y）對(duì)血漿濃度（x）進(jìn)行線性回歸，相關(guān)系數(shù)良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表1。

3.1.3 定量限與檢測(cè)限 取空白血漿，分別加入標(biāo)準(zhǔn)工作液，制備成替米考星含量分別為0.005，0.01，0.02，0.05 μg·mL-1空白添加樣品，按樣品的處理方法操作。每個(gè)濃度各5個(gè)平行，測(cè)得基線噪音值，按信噪比S/N=3為檢測(cè)限（LOD），S/N=10為定量限（LOQ）。其中檢測(cè)限為0.01 μg·mL-1，定量限為0.02 μg·mL-1。

3.1.4 提取回收率、精密度與準(zhǔn)確度 將峰面積代入回收率計(jì)算公式：回收率=×100%

（式中，A為添加樣品中替米考星實(shí)測(cè)峰面積;As為對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)液中替米考星峰面積）。替米考星低、中、高（0.02，0.5，2.5 μg·mL-1）濃度的血漿樣品測(cè)定結(jié)果的回收率見(jiàn)表3，結(jié)果表明，在低、中、高（0.02，0.5，2.5 μg·mL-1）3個(gè)濃度下分析方法的平均回收率（%）分別是89.32±3.46，92.37±2.65，94.83±4.49，RSD均小于10%，能滿足后續(xù)藥代動(dòng)力學(xué)分析要求 。

3.2 血漿中藥物濃度

分別給豬灌服替米考星制劑，各時(shí)間點(diǎn)的血漿中替米考星濃度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)下表3-表6，藥時(shí)曲線圖見(jiàn)圖1。

3.3 藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)

采用WinNonlin 8.1藥動(dòng)學(xué)軟件處理，用實(shí)測(cè)血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，計(jì)算出替米考星藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)下表7-表10。

豬按20 mg·kg-1的劑量口服替米考星腸溶顆粒后，血藥濃度4 h達(dá)峰值，Cmax為1.04±0.14 μg·mL-1，藥物在體內(nèi)消除緩慢，消除半衰期為14.13±0.78 h。AUClast為12.27±1.43 μg·h·mL-1，AUC0～∞為13.04±1.17μg·h·mL-1，Vz_F_obs為33.62±6.46 L·kg-1，Cl_F_obs為1.54±0.14 L·h-1·kg-1，MRT為21.65±3.51 h，Tlag為0.59±0.19 h，與替米考星預(yù)混劑2相比，相對(duì)生物利用度F為133.93±12.03%。

豬按20 mg·kg-1的劑量口服替米考星預(yù)混劑1后，血藥濃度1.25±0.27 h達(dá)峰，Cmax為0.87±0.04 μg·mL-1，藥物在體內(nèi)消除緩慢，消除半衰期為9.94±1.00 h。AUClast為8.66±0.81 μg·h·mL-1，AUC0～∞為9.00±0.90 μg·h·mL-1，Vz_F_obs為31.95±2.46 L·kg-1，Cl_F_obs為2.24±0.23 L·h-1·kg-1，MRT為13.61±1.25 h，與替米考星預(yù)混劑2相比，相對(duì)生物利用度F為92.40±9.20%。

豬按20 mg·kg-1的劑量口服磷酸替米考星可溶性粉后，血藥濃度1.63±0.23 h達(dá)峰，Cmax為0.83±0.03 μg·mL-1，藥物在體內(nèi)消除緩慢，消除半衰期為1.22±0.44 h。AUClast為9.77±0.98 μg·h·mL-1，AUC0～∞為10.13±1.01 μg·h·mL-1，Vz_F_obs為29.33±2.71 L·kg-1，Cl_F_obs為1.99±0.18 L·h-1·kg-1，MRT為14.62±0.79 h，與替米考星預(yù)混劑2相比，相對(duì)生物利用度F為100.33±10.08%。

豬按20 mg·kg-1的劑量口服替米考星預(yù)混劑2后，血藥濃度1.81±0.26 h達(dá)峰，Cmax為0.86±0.04 μg·mL-1，藥物在體內(nèi)消除緩慢，消除半衰期為10.60±3.70 h。AUClast為9.33±0.47 μg·h·mL-1，AUC0～∞為9.74±0.39 μg·h·mL-1，Vz_F_obs為31.52±11.71 L·kg-1，Cl_F_obs為2.06±0.08 L·h-1·kg-1，MRT為13.35±1.45 h。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用高效液相分析法，四種替米考星制劑在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)，考慮到非房室模型不受經(jīng)典房室模型的影響，適用于任何房室，目前體內(nèi)數(shù)據(jù)解析中多采用此法，且各國(guó)藥品評(píng)審當(dāng)局也陸續(xù)采用推薦，固本試驗(yàn)所測(cè)血藥經(jīng)時(shí)數(shù)據(jù)均采用非房室模型進(jìn)行分析。結(jié)果表明，四種制劑血液中藥物半衰期長(zhǎng)，藥物組織穿透力強(qiáng)，體內(nèi)分布容積大，在組織中藥物濃度高，維持時(shí)間長(zhǎng)，具有一定的生物安全性。

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