泉州地區(qū)妊娠中期婦女血清學(xué)篩查胎兒染色體異常及拷貝數(shù)變異分析

許偉雄，張黎仙，林志華，江矞穎， 莊建龍*

我國(guó)是世界上新生兒出生缺陷發(fā)生率較高的國(guó)家之一，產(chǎn)前血清學(xué)篩查主要用于篩查21-三體綜合征(trisomy 21 syndrome,T21)、18-三體綜合征(trisomy 18 syndrome,T18)和神經(jīng)管畸形(neural tube defects,NTD)，是一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)性的篩查方法，能夠有效地減少出生缺陷[1-3]。因此，對(duì)孕中期婦女行產(chǎn)前血清學(xué)篩查是必要的。染色體核型分析技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛的細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)方法，但其分辨率較低，僅可檢測(cè)5～10 Mb的遺傳物質(zhì)改變[4]。染色體微陣列技術(shù)(chormosome microarray analysis,CMA)包括基于微陣列的比較基因組雜交技術(shù)和單核苷酸多態(tài)性微陣列(single nucleotide polymorphism array,SNP array)技術(shù)，分辨率高且敏感性強(qiáng)，同時(shí)能夠檢測(cè)基因組微小的拷貝數(shù)變異(copy number variants,CNVs)。并且，CMA技術(shù)已被推薦作為產(chǎn)前超聲胎兒結(jié)構(gòu)異常的一線檢測(cè)技術(shù)[5]。目前，孕中期婦女血清學(xué)產(chǎn)前篩查已有相關(guān)研究[6-8]，但泉州地區(qū)尚無(wú)大樣本的數(shù)據(jù)研究。另外，血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦染色體CNVs檢出情況研究較少[9-10]。本研究通過(guò)回顧性分析114 680例婦女孕中期血清學(xué)篩查結(jié)果，探討產(chǎn)前血清學(xué)篩查陽(yáng)性胎兒染色體異常檢出情況及染色體CNVs檢出情況。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析2015年1月至2018年12月于泉州市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心行產(chǎn)前血清學(xué)篩查的單胎妊娠孕婦114 680例，孕周15～20+6周，年齡15～48歲。所有孕婦及家屬均簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)泉州市婦幼保健院·兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019No.13)。

1.2 產(chǎn)前血清學(xué)篩查

采集孕婦外周血3 mL，靜置0.5 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃保存?zhèn)錂z。采用時(shí)間分辨免疫熒光法檢測(cè)孕婦血清中甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、游離人絨毛膜促性腺激素β亞基(free β-human chorionic gonadotrophin,free-β-hCG)和游離雌三醇(unconjugated estriol,uE3)的濃度。結(jié)合孕婦年齡、體質(zhì)量、孕周等信息應(yīng)用Lifecycle 4.0產(chǎn)前篩查風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算軟件計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)值，對(duì)月經(jīng)不規(guī)則的孕婦以超聲檢查胎齡為準(zhǔn)，T21高風(fēng)險(xiǎn)截?cái)嘀禐?/270；T18高風(fēng)險(xiǎn)截?cái)嘀禐?/350；NTD高風(fēng)險(xiǎn)截?cái)嘀禐锳FP單項(xiàng)中位數(shù)倍數(shù)(MoM)≥2.5。

1.3 羊水培養(yǎng)及染色體核型分析

對(duì)產(chǎn)前血清學(xué)篩查T(mén)21及T18高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，建議進(jìn)行羊膜腔穿刺，行胎兒染色體核型分析和/或CMA檢測(cè)。所有接受羊膜腔穿刺的孕婦及家屬簽署知情同意書(shū)后，于孕18～24周進(jìn)行羊膜腔穿刺術(shù)。將羊膜腔穿刺獲得的20 mL羊水離心后棄上清，接種于羊水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7～10 d。用胰酶消化法收獲羊水細(xì)胞，進(jìn)行染色體制備，經(jīng)吉姆薩染液染色后進(jìn)行核型分析。每例計(jì)數(shù)30個(gè)核型，分析5個(gè)核型。

1.4 DNA提取及SNP array檢測(cè)

使用QIAamp DNA Blood Kit(QIAGEN)試劑盒參照QIAamp DNA Blood Kit Handbook(www.qiagen.com)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行羊水DNA抽提。使用Affymetrix CytoScanTM 750K芯片檢測(cè)全基因組CNVs。結(jié)果判讀參照DGV(http://dgv.tcag.ca/dgv)，OMIM(http://omim.org/)，DECIPHER(http://decipher.sanger.ac.uk/)，Pumed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)等數(shù)據(jù)庫(kù)。CNVs致病性判讀：按照CNVs臨床意義界定的指南[11]對(duì)>100 kb的CNVs進(jìn)行分類(lèi)：致病性CNVs；良性CNVs；臨床意義不明CNVs。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)前血清學(xué)篩查結(jié)果

114 680例孕婦血清學(xué)篩查，共檢出高風(fēng)險(xiǎn)5 856例，篩查陽(yáng)性率為5.11%。檢出T21高風(fēng)險(xiǎn)5 108例，篩查陽(yáng)性率為4.45%；檢出T18高風(fēng)險(xiǎn)231例，篩查陽(yáng)性率為0.20%；檢出NTD高風(fēng)險(xiǎn)517例，篩查陽(yáng)性率為0.45%。

2.2 羊水染色體核型分析結(jié)果

2 677例產(chǎn)前血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦于我院行羊水細(xì)胞染色體核型分析，包括T21高風(fēng)險(xiǎn)2 479例，T18高風(fēng)險(xiǎn)198例。共檢出染色體異常88例，異常檢出率為3.29%，其中檢出53例T21，17例T18，性染色體異常5例，染色體結(jié)構(gòu)異常10例，染色體嵌合3例。染色體核型結(jié)果詳見(jiàn)表1。另外，共489例NTD高風(fēng)險(xiǎn)孕婦行超聲檢查，確診NTD 21例。因此，產(chǎn)前血清學(xué)篩查T(mén)21、T18和NTD陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為2.14%(53/2 479)、8.59%(17/198)和4.29%(21/489)。

表1 2 677例血清學(xué)篩查高危孕婦羊水染色體核型分析結(jié)果

2.3 妊娠結(jié)局隨訪

對(duì)所有產(chǎn)前血清學(xué)篩查陰性(低風(fēng)險(xiǎn)及中風(fēng)險(xiǎn))及未接受羊水穿刺的高風(fēng)險(xiǎn)孕婦進(jìn)行電話隨訪或門(mén)診隨訪。隨訪結(jié)果表明產(chǎn)前篩查T(mén)21低風(fēng)險(xiǎn)及中風(fēng)險(xiǎn)孕婦有21例確診為T(mén)21，有9例未接受產(chǎn)前診斷的T21高風(fēng)險(xiǎn)孕婦確認(rèn)為T(mén)21，血清學(xué)篩查T(mén)21敏感性為74.70%(62/83)；產(chǎn)前篩查T(mén)18低風(fēng)險(xiǎn)及中風(fēng)險(xiǎn)孕婦有4例確認(rèn)為T(mén)18，有2例未接受產(chǎn)前診斷的T18高風(fēng)險(xiǎn)孕婦確認(rèn)為T(mén)18，血清學(xué)篩查T(mén)18敏感性為82.61%(19/23)。

2.4 不同高危因素間異常染色體核型檢出情況

進(jìn)一步分析血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦合并不同高危因素時(shí)胎兒染色體核型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)合并超聲異?；蚋啐g因素時(shí)，胎兒染色體異常檢出率較高，明顯高于單純血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)胎兒染色體異常檢出率(χ2=11.849，P=0.001；χ2=106.333，P<0.001)。各高危因素間異常染色體核型檢出情況詳見(jiàn)表2。

2.5 染色體微陣列技術(shù)檢測(cè)結(jié)果

共366例血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦行染色體核型分析及SNP array檢測(cè)。結(jié)果顯示，SNP array技術(shù)檢出9例染色體非整倍體及1例X染色體長(zhǎng)臂部分缺失，染色體核型結(jié)果與之一致。另外，SNP array技術(shù)額外檢出24例染色體微缺失微重復(fù)，其中6例為致病性CNVs(圖1,見(jiàn)彩插2)，18例為臨床意義不明CNVs。因此，SNP array技術(shù)較染色體核型分析額外檢出1.79%(6/336)致病性CNVs。詳見(jiàn)下頁(yè)表3。

3 討論

目前，二聯(lián)(AFP和β-hCG)和三聯(lián)(AFP、β-hCG和uE3)是我國(guó)較為常用的孕中期篩查方案[12]。許多地方已將三聯(lián)血清學(xué)標(biāo)志物篩查作為常規(guī)的血清學(xué)篩查方法[13-14]。本研究采用三聯(lián)血清學(xué)標(biāo)志物對(duì)114 680例孕中期婦女進(jìn)行大規(guī)模產(chǎn)前血清學(xué)篩查，旨在分析本地區(qū)孕中期婦女血清學(xué)篩查胎兒染色體異常及CNVs結(jié)果，同時(shí)評(píng)估CMA在血清學(xué)篩查高危孕婦產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值。本研究共檢出高風(fēng)險(xiǎn)5 856 例，篩查陽(yáng)性率為5.11%，與國(guó)內(nèi)其他研究報(bào)道類(lèi)似[4,15]。

表2 各高危因素間異常染色體核型檢出情況(例)

表3 336例血清學(xué)篩查高危孕婦羊水SNP array檢測(cè)結(jié)果

本研究共檢出血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)5 856例，2 677例接受羊水穿刺進(jìn)行胎兒染色體核型分析，489例NTD高風(fēng)險(xiǎn)孕婦行超聲檢查確診。本研究中，血清學(xué)篩查T(mén)21、T18和NTD陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為2.14%、8.59%和4.29%。結(jié)果略高于許遵鵬等[16]報(bào)道的T21和T18陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(0.56%和5.10%)。本研究隨訪結(jié)果顯示，血清學(xué)篩查T(mén)21和T18敏感性分別為74.70%和82.61%，與其他相關(guān)研究報(bào)道類(lèi)似[16-17]。

本研究發(fā)現(xiàn)血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)合并超聲異?；蚋啐g因素時(shí)，具有較高染色體異常檢出率。有研究指出，僅用超聲進(jìn)行產(chǎn)前篩查，T21的檢出率為60%～79%，但是超聲聯(lián)合血清學(xué)指標(biāo)，其檢出率可達(dá)90%，因而血清學(xué)檢查聯(lián)合超聲檢測(cè)，能夠提高染色體異常兒的檢出率[18-19]。本研究結(jié)果顯示血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)合并超聲異常時(shí)，胎兒染色體異常檢出率最高(15.24%)，明顯高于單純血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)胎兒染色體異常檢出率，進(jìn)一步支持了該結(jié)論。本研究還發(fā)現(xiàn)血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)合并不良孕史時(shí)，胎兒染色體異常檢出率最低，未檢出染色體異常(0/39)，為臨床咨詢提供了數(shù)據(jù)參考。

本研究中，共366例血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦行染色體核型分析及SNP array檢測(cè)，結(jié)果顯示SNP array技術(shù)能夠有效檢測(cè)染色體非整倍體且能夠額外檢出染色體微缺失/微重復(fù)。SNP array技術(shù)較染色體核型分析額外檢出1.79%(6/336)致病性CNVs。另外，染色體核型分析檢出1例15號(hào)染色體羅伯遜易位，SNP array檢測(cè)結(jié)果提示胎兒疑似為低比例15號(hào)染色體三體嵌合，且兩條15號(hào)染色體均為來(lái)自于父母一方的單親二體性，內(nèi)含NDN、SNRPN和UBE3A等19個(gè)與遺傳印記相關(guān)的基因。已有研究報(bào)道母源性15號(hào)染色體單親二倍體(uniparental diploid,UPD)可導(dǎo)致Prader-Willi綜合征，臨床表型包括嬰兒期肌張力減退和喂養(yǎng)困難、肥胖、運(yùn)動(dòng)和語(yǔ)言發(fā)育遲緩、不同程度的認(rèn)知障礙和性腺機(jī)能減退等[20]；父源性15號(hào)染色體UPD可導(dǎo)致Angelman綜合征，臨床表型包括發(fā)育遲緩、智力障礙、步態(tài)共濟(jì)失調(diào)、小頭畸形、癲癇和面容異常等[21]。胎兒產(chǎn)前超聲提示鼻骨發(fā)育不良/缺失，腸道強(qiáng)回聲，膽囊未顯示，經(jīng)充分臨床咨詢，孕婦及家屬選擇終止妊娠。因此，SNP array技術(shù)不僅能夠提供CNVs信息，還能夠識(shí)別雜合性缺失、單親二倍體和三倍體等[22-24]，能夠?yàn)榕R床咨詢提供更加準(zhǔn)確完善的數(shù)據(jù)。

綜上所述，孕中期婦女產(chǎn)前血清學(xué)篩查和羊水穿刺產(chǎn)前診斷能夠有效地檢出胎兒染色體異常。聯(lián)合CMA檢測(cè)可提高血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦胎兒染色體異常檢出率，為臨床咨詢提供了數(shù)據(jù)支持。