熒光/MRI雙模態(tài)靶向成像診療試劑的制備

陳慶濤 石向東 梁娓娓 姜利英 方少明 陳鳳華＊,

(1鄭州輕工業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院，鄭州 450002)

(2鄭州輕工業(yè)大學(xué)電氣信息工程學(xué)院，鄭州 450002)

腫瘤的“診療一體化”是在腫瘤細(xì)胞的早期篩查和早期診斷的基礎(chǔ)上進(jìn)行同步治療，可以大幅度提高腫瘤患者的治愈率、生活質(zhì)量、生存期及生存率。因此，研發(fā)新型多功能診療制劑(theranostic agent)具有重要的意義[1]。納米技術(shù)的出現(xiàn)為癌癥診療一體化的實(shí)現(xiàn)帶來(lái)了新的希望。其中，分子成像技術(shù)是癌癥診療一體化的核心和重要基礎(chǔ)。

磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)作為一種先進(jìn)的分子影像技術(shù)，具有無(wú)損傷性、高分辨率等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛用于臨床疾病診斷，而30%以上的MRI診斷需要使用造影劑[2?3]。以鈉鹽或者葡甲胺鹽的離子形式用于臨床的Gd?DTPA(Magnevist，二乙三胺五乙酸釓)是應(yīng)用廣泛的小分子離子型T1造影劑，但它產(chǎn)生的滲透壓較高，并且易經(jīng)腎臟代謝后迅速排出，在體內(nèi)存留時(shí)間較短；同時(shí)不具有組織及器官的選擇性和靶向性[4?5]，往往需要對(duì)其進(jìn)行修飾。對(duì)于多胺多羧酸配合物而言，其弛豫效率主要由旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間決定[6]，所以增大配合物分子的體積一方面可以提高弛豫效率，另一方面由于大分子本身的特點(diǎn)，向大分子中引入特定的對(duì)人體某一組織器官具有親和性的基團(tuán)，還能增強(qiáng)選擇性或者靶向性。因此，對(duì)Gd?DTPA進(jìn)行的大分子修飾近年來(lái)研究得比較多，現(xiàn)在已報(bào)道的有將小分子Gd?DTPA造影劑共價(jià)或者非共價(jià)的與血紅細(xì)胞[7]、蛋白質(zhì)[8?9]、多糖[10?11]、聚氨基酸[12]、樹(shù)枝狀大分子[13]及人工合成的其他生物相容性高分子[14]相結(jié)合，用于提高弛豫效率，增強(qiáng)成像的對(duì)比度和清晰度。

石墨烯量子點(diǎn)(graphene quantum dots，GODs)因其顯著的量子限域和邊緣效應(yīng)呈現(xiàn)出多種獨(dú)特的物理化學(xué)性能，此外GODs表現(xiàn)出的低細(xì)胞毒性、良好溶解性、穩(wěn)定的光致發(fā)光等優(yōu)點(diǎn)，使其成為極好的生物成像探針，已被人們廣泛用于細(xì)胞及組織成像的研究[15?17]。若將 Gd?DTPA 修飾負(fù)載在 GODs上，一方面可以增大Gd?DTPA造影劑的分子體積，增強(qiáng)T1陽(yáng)性造影效果，提高腫瘤檢測(cè)的準(zhǔn)確性；另一方面利用GODs的熒光成像，可以改善MRI成像存在的靈敏度低和信號(hào)采集耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，同時(shí)還可利用GODs表面較好的接枝性能及大的比表面積，偶聯(lián)針對(duì)不同腫瘤的靶分子和通過(guò)π?π堆垛吸附具有芳環(huán)結(jié)構(gòu)的抗癌藥物，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的診療一體化。

故我們?cè)诰垡叶级?NH2?PEG?NH2)修飾的GODs表面以酰胺鍵偶聯(lián)二乙基三胺五乙酸(DTPA)分子，之后將Gd3+離子與其進(jìn)行配合，得到GODs?Gd(DTPA)復(fù)合納米粒子，然后再通過(guò)酰胺鍵在GODs?Gd(DTPA)的表面修飾葉酸(FA)靶分子，最后將阿霉素(DOX)進(jìn)一步通過(guò)π?π堆垛吸附在該造影劑的表面，制備GODs?Gd(DTPA)熒光/MRI雙模態(tài)靶向肺癌細(xì)胞成像診療試劑FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX，具體制備流程如圖1所示。

圖1 熒光/MRI雙模態(tài)成像診療試劑(FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX)的制備過(guò)程Fig.1 Preparation process of double?fluorescence/MRI dual targeted imaging diagnostic reagents(FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

1?乙基?(3?二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl，純度大于 98.5%)、DTPA、氯乙酸鈉購(gòu)于Sigma?Aldrich公司；天然石墨、氯化釓(Ⅲ)六水合物購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；(NH2?PEG?NH2，MW=10 000)購(gòu)于 Jenkem Techonology；濃硫酸、濃鹽酸、發(fā)煙硝酸、醋酸鈉、無(wú)水碳酸鈉、氫氧化鈉、三乙胺、二甲基亞砜、碳酸氫鈉等其他所用試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)和DOX購(gòu)于BBI公司；H460和HLF細(xì)胞為腫瘤醫(yī)院贈(zèng)送，細(xì)胞培養(yǎng)基、MTT購(gòu)于上海普飛生物科技公司；實(shí)驗(yàn)所用水均為三次水和電阻為18.2 MΩ以上的超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 GODs的制備及修飾

根據(jù)文獻(xiàn)制備GODs[18]，具體步驟如下：將0.2 g的天然石墨加入到15 mL濃硫酸和5 mL發(fā)煙硝酸的混合濃酸中，超聲10 min后于120℃攪拌反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，冷至室溫，加入100 mL去離子水稀釋反應(yīng)物，并用NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值為7～8，然后將反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移到透析袋(截留分子量為14 kDa)中透析48 h除去多余的鹽，最后得到濃度為1.47 mg·L-1的焦黃色的GODs分散液。向此40 mL的GODs分散液中依次加入2.9 g NaOH和6.16 g ClCH2COONa，超聲反應(yīng)2 h后用稀HCl調(diào)節(jié)pH值到中性，然后超濾去除未反應(yīng)的小分子，得到羧基化的GODs分散液(GODs?COOH，濃度為0.3 mg·mL-1)。

取30 mL GODs?COOH溶液，依次向內(nèi)加入1 mL NH2?PEG?NH2溶液(50 mg·mL-1)和 0.3 mL EDC·HCl水溶液(80 mg·mL-1)，用三乙胺調(diào)節(jié)pH值到8后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)移到截留分子量為14 kDa的透析袋中，透析2 d除去未反應(yīng)完的小分子和 NH2?PEG?NH2，得到末端帶有—NH2的聚乙二醇鏈修飾的GODs液(GODs?PEG?NH2)。

1.2.2 FA/GODs?Gd(DTPA)的制備

向含有0.1 g DTPA的5 mL DMSO溶液中加入5 mL所制備的GODs?PEG?NH2分散液、1 mL EDC的DMSO溶液(50 mg·mL-1)和50 μL的三乙胺，攪拌反應(yīng)24 h后將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到透析袋內(nèi)透析2～3 d，得到GODs?DTPA溶液，然后向此溶液中加入10 mL GdCl3溶液(20 mmol·L-1)，攪拌反應(yīng) 4 h，最后透析除去未反應(yīng)的GdCl3得到GODs?Gd(DTPA)納米粒子。

取10 mL GODs?Gd(DTPA)納米粒子的分散液，超聲30 min后用三乙胺調(diào)pH值為8左右，然后依次向內(nèi)加入10 mL FA溶液(0.1 mg·mL-1)和1 mL EDC·HCl水溶液(80 mg·mL-1)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)48 h。反應(yīng)結(jié)束后，超濾去除未反應(yīng)的FA，得到修飾有FA的GODs?Gd(DTPA)納 米 粒 子 (FA/GODs?Gd(DTPA))。ICP?MS測(cè)試結(jié)果表明樣品中Gd3+的濃度為12.3 μg·mL-1。FA/GODs?Gd(DTPA)中 FA 的負(fù)載率(loading efficiency，LEFA)通過(guò)下列公式進(jìn)行計(jì)算：LEFA=(mt,FA-md,FA)/mt,FA×100%，其中，mt,FA為實(shí)驗(yàn)投入的FA質(zhì)量(1 mg)；md,FA為未偶聯(lián)上的FA質(zhì)量(mg)，即收集的所有透析液中的FA含量，根據(jù)FA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)c/(μg·mL-1)=0.306+8.877A進(jìn)行計(jì)算(A為吸光度，R2=0.998 5)。由此可得出FA的負(fù)載率為79.8%。

1.2.3 FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX的制備

向 2 mL FA/GODs?Gd(DTPA)的分散液中加入0.5 mL DOX溶液(1 mg·mL-1)，在搖床中過(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后，超濾、水洗，將未吸附的DOX去除干凈(所有濾液收集于容量瓶中，便于根據(jù)紫外吸收光譜測(cè)得載藥量)，得到載有 DOX 的 FA/GODs?Gd(DTPA)納米診療試劑(FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX)。FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX的載藥率(LEDOX)，即π?π堆垛吸附在FA/GODs?Gd(DTPA)表面的DOX質(zhì)量占實(shí)驗(yàn)投入的DOX質(zhì)量(0.5 mg)的百分比含量，通過(guò)下列公式進(jìn)行計(jì)算：LEDOX=(mt,DOX-md,DOX)/mt,DOX×100%，其中，mt,DOX為實(shí)驗(yàn)投入的DOX質(zhì)量(0.5 mg)；md,DOX為未吸附在材料表面的DOX質(zhì)量，即收集的所有透析液中的DOX含量，根據(jù)DOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) c/(μg·mL-1)=0.500 5+0.061 1A進(jìn)行計(jì)算(A為吸光度，R2=0.999 3)。由此可算出FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX的載藥率為83.8%。

1.2.4 細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

熒光成像實(shí)驗(yàn)：在含有10%的胎牛血清和1%的青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，人肺纖維HLF細(xì)胞和肺癌細(xì)胞H460細(xì)胞分別接種在底部厚度為0.17 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)基，分別加入濃度為 50 μg·mL-1的 FA/GODs?Gd(DTPA)納米粒子的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，棄去培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿用PBS清洗細(xì)胞3次除去未進(jìn)入細(xì)胞的納米粒子，隨后用甲醇固定20 min，再次用PBS清洗細(xì)胞3次，最后加入1 mL PBS保持細(xì)胞形貌，然后置于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光。

MRI成像實(shí)驗(yàn)：將含有不同濃度Gd3+(15、30、45、60 和 75 μmol·L-1)的 FA/GODs?Gd(DTPA)納米粒子與H460細(xì)胞孵育24 h后，上清液用PBS清洗3遍，收集細(xì)胞加入核磁管，進(jìn)行細(xì)胞MRI成像。所用MRI成像設(shè)備為11.7 T Bruker micro?MRI system，測(cè)試參數(shù)：TR=300 ms，TE=5.9 ms，matrix=128×96，slicethickness=1mm，F(xiàn)OV=1.60cm×1.80cm，NEX=2。1.2.5 DOX體外釋放曲線(xiàn)的測(cè)定

分別取2 mL FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX的水分散液置于截留分子量為14 kDa的透析袋中，緊密封口，然后分別置于10 mL 37℃、pH為7.4和5.5的PBS中，定時(shí)取0.5 mL釋放介質(zhì)測(cè)定其紫外吸收光譜，同時(shí)補(bǔ)充等量的釋放液，根據(jù)DOX工作曲線(xiàn)計(jì)算其濃度，并繪制累計(jì)釋藥率-時(shí)間曲線(xiàn)。

1.2.6 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

采用 MTT法檢測(cè)了 FA/GODs?Gd(DTPA)納米粒子負(fù)載DOX前后對(duì)H460細(xì)胞的毒性。把100 μL密度為1×104的H460細(xì)胞接種在96孔板中，先在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后培養(yǎng)基分別被100 μL含有不同濃度的FA/GODs?Gd(DTPA)納米粒子和 FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX的培養(yǎng)基替換，細(xì)胞在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每個(gè)孔中加入15 μL的MTT溶液(5 mg·mL-1)，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的培養(yǎng)箱中再孵育4 h，小心倒出培養(yǎng)基后，每孔中加入150 μL的DMSO，震蕩10 min。用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定其光吸收值(OD值)，將沒(méi)有加入納米粒子孵育的細(xì)胞作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果由4組平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)求平均值得到：Cell viability=(ODexp/ODcon)×100%，其中ODexp為實(shí)驗(yàn)組OD值，ODcon為對(duì)照組OD值。

1.3 測(cè)試與表征

樣品的形貌采用日本JEOL公司JEM?2100型透射電子顯微鏡(TEM)進(jìn)行表征(在200 kV下操作)。采用德國(guó)Bruker TENSOR27紅外光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行FTIR光譜分析。采用LabRam HR 800型共聚焦顯微鏡拉曼光譜儀進(jìn)行拉曼光譜測(cè)試，激發(fā)光波長(zhǎng)為638 nm。在日本Hitachi U?3900H型紫外可見(jiàn)光譜儀和F?4600型熒光光譜儀進(jìn)行紫外光譜和熒光光譜的測(cè)試，采用硫酸奎寧在激發(fā)波長(zhǎng)360 nm的熒光量子產(chǎn)率0.54為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)量計(jì)算樣品的熒光量子產(chǎn)率。采用英國(guó)Malwen公司的Zetasizer Nano ZS型納米粒度及ζ電位分析儀測(cè)試納米粒子的表面電位。在美國(guó)Perkin Elmer Victor X4型酶標(biāo)儀上測(cè)定光吸收值。細(xì)胞成像在德國(guó)Leica TCS SP5Ⅱ型激光共聚焦掃描顯微鏡上測(cè)試。Gd2+的濃度利用ICP?AES(Perkin Elmer Optima 8000)進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 TEM表征

圖2為所制備的GODs和FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX分散液的照片及其對(duì)應(yīng)的TEM圖片。從圖2a中可以看出所制備的GODs溶液呈現(xiàn)焦黃色，分散性較好，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步修飾Gd(DTPA)、FA及DOX后，F(xiàn)A/GODs?Gd(DTPA)/DOX的分散液呈現(xiàn)紅色(圖2b)。GODs的TEM照片(圖2c)顯示所制備的GODs為粒徑為1～2 nm的小粒子，尺寸分布較均一，F(xiàn)A/GODs?Gd(DTPA)/DOX的形貌沒(méi)有發(fā)生變化(圖2d)，但是粒徑增大到了5～6 nm。

圖2 所制備的GODs和FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX分散液的照片(a、b)及其對(duì)應(yīng)的TEM圖片(c、d)Fig.2 Photographs(a,b)and corresponding TEM images(c,d)of as?prepared GODs and FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX dispersion

2.2 Raman光譜表征

圖3為所制備的GODs(a)和FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX分散液(b)的Raman光譜。圖3a中出現(xiàn)了GODs很明顯的D帶(A1g)和G帶(E2g)峰，分別位于1 348和1 602 cm-1處。當(dāng)GODs修飾上生物功能分子后，除了保留GODs的特征Raman峰外，在FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX的Raman光譜中(圖3b)還出現(xiàn)了明顯的DOX和FA分子的Raman特征峰，分別位于450 cm-1(δC=O)、991 cm-1(苯環(huán)的伸縮振動(dòng))、1 083 cm-1(苯環(huán)的伸縮振動(dòng))、1 244 cm-1(δO—H、δC—H和 δC—OH)、1 575 cm-1(苯環(huán)振動(dòng)和 νC=C)和 1 631 cm-1(νC=O)處。此外，在597 cm-1處可以明顯看到歸屬為Gd—O的Raman峰，以上分析均證明了FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX的成功制備。

圖3 制備的GODs(a)和FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX(b)的拉曼光譜Fig.3 Raman spectra of as?prepared GODs(a)and FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX(b)

2.3 紅外光譜和ζ電位分析

圖4為所制備的GODs、GODs?PEG?NH2、GODs?Gd(DTPA)和 FA/GODs?Gd(DTPA)的FT?IR譜圖。在GODs的紅外光譜中(圖 4a)，3 500～3 100 cm-1范圍內(nèi)的寬吸收峰是由于GODs和GODs吸附水中的羥基產(chǎn)生的O—H伸縮振動(dòng)，1 727 cm-1處的吸收峰是GODs表面的羰基伸縮振動(dòng)峰，1 583 cm-1處的吸收峰是GODs中C=C的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的，在1 005 cm-1處可以觀察到C—O的吸收峰。GODs表面共價(jià)修飾?PEG?NH2后，圖4b譜線(xiàn)中出現(xiàn)了明顯的N—H的振動(dòng)峰(3 440 cm-1)、C—N的振動(dòng)峰(1 238 cm-1)和比較強(qiáng)的—CH2—的C—H振動(dòng)峰(2 870 cm-1)，而且在1 632 cm-1處出現(xiàn)了—CONH—鍵的吸收峰，這均表明在GODs的表面成功地修飾上了含有氨基的PEG鏈，便于進(jìn)一步共價(jià)修飾DTPA分子。我們對(duì)該過(guò)程中的每步產(chǎn)物也進(jìn)行了ζ電位值的測(cè)定，GODs的ζ電位值為-18.3 mV，在其表面修飾羧基官能團(tuán)后，GODs?COOH的ζ電位值變?yōu)?23.4 mV，經(jīng)進(jìn)一步與NH2?PEG?NH2反應(yīng)后，GODs?PEG?NH2的ζ電位值升高到了-10.3 mV，充分說(shuō)明了氨基被成功地修飾在了GODs表面。

圖4c為GODs?Gd(DTPA)的紅外譜圖，其峰位基本與圖4b相同，但是位于1 632 cm-1處的—CONH—鍵的吸收峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，同時(shí)在1 400 cm-1處出現(xiàn)了明顯的羧酸鹽的特征峰，間接證明了在GODs?PEG?NH2納米粒子表面成功地通過(guò)酰胺鍵接枝上了DTPA分子，并且Gd與配體形成了配合物。由于譜峰重疊，F(xiàn)A/GODs?Gd(DTPA)的紅外譜圖(圖 4d)與GODs?Gd(DTPA)的譜峰差別不大，但是可以通過(guò)紫外吸收光譜證實(shí)FA分子的成功偶聯(lián)(見(jiàn)后文)。

圖4 制備的GODs(a)、GODs?PEG?NH2(b)、GODs?Gd(DTPA)(c)和 FA/GODs?Gd(DTPA)(d)的紅外譜圖Fig.4 FT?IR spectra of as?prepared GODs(a),GODs?PEG?NH2(b),GODs?Gd(DTPA)(c)and FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX(d)

2.4 熒光光譜和紫外吸收光譜分析

GODs的熒光譜圖如圖5a所示。結(jié)果表明所制備的GQDs的熒光光譜呈現(xiàn)明顯的激發(fā)波長(zhǎng)依賴(lài)型的熒光特性[19]，當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)分別為300、400和500 nm時(shí)，分別在432、512和610 nm處出現(xiàn)了GQDs的熒光發(fā)射峰。當(dāng)GQDs表面修飾Gd(DTPA)和FA后，雖然 FA/GODs?Gd(DTPA)的熒光光譜(圖 5b)強(qiáng)度下降，同時(shí)發(fā)生了藍(lán)移[20]，但是仍然呈現(xiàn)激發(fā)波長(zhǎng)依賴(lài)型的熒光特性，很好地保留了GODs的熒光性能，有利于對(duì)細(xì)胞的熒光成像檢測(cè)。根據(jù)0.1 mol·L-1稀硫酸溶解的硫酸奎寧溶液和樣品稀溶液在360 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光積分強(qiáng)度比值和吸光度比值，以硫酸奎寧在激發(fā)波長(zhǎng)360 nm的熒光量子產(chǎn)率0.54為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算可得GODs及FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX的熒光量子產(chǎn)率分別為0.028和0.017。

圖5 制備的(a)GODs和(b)FA/GODs?Gd(DTPA)的熒光光譜圖Fig.5 Fluorescence spectra of as?prepared(a)GODs and(b)FA/GODs?Gd(DTPA)

圖6是GODs、FA、DOX、FA/GODs?Gd(DTPA)和FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX的UV?Vis吸收光譜。在GODs的光譜圖中，由于GODs中碳碳共軛雙鍵π→π*的躍遷而在231 nm處出現(xiàn)了GODs的特征紫外吸收峰[21]；FA在254、284和365 nm處有明顯的紫外吸收峰，當(dāng)FA通過(guò)成鍵偶聯(lián)到GODs?Gd(DTPA)的表面后，在 FA/GODs?Gd(DTPA)的 UV?Vis譜圖中同時(shí)出現(xiàn)了FA位于250～280 nm范圍處的紫外吸收峰和GODs在231 nm處的紫外吸收，證明FA分子成功地通過(guò)酰胺鍵修飾到了GODs?Gd(DTPA)的表面，制備了具有靶向功能的熒光成像納米制劑。當(dāng)FA/GODs?Gd(DTPA)進(jìn)一步通過(guò)π?π堆垛作用吸附DOX后，F(xiàn)A/GODs?Gd(DTPA)/DOX的UV?Vis譜圖中又出現(xiàn)了DOX位于233和480 nm處的明顯特征吸收峰，表明DOX成功地?fù)?dān)載在所制備的具有靶向功能的石墨烯量子點(diǎn)上，可實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的診療一體化。

圖6 GODs、FA、DOX、FA/GODs?Gd(DTPA)和FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX的UV?Vis譜圖Fig.6 UV?Vis spectra of GODs,FA,DOX,FA/GODs?Gd(DTPA)and FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX

2.5 細(xì)胞的熒光成像

圖7是所制備的FA/GODs?Gd(DTPA)納米試劑分別與肺癌細(xì)胞H460(a)和人肺纖維HLF正常細(xì)胞(b)共孵育1 h后的激光共聚焦顯微照片。從圖7a可以看出，在H460細(xì)胞中能夠檢測(cè)到GODs的綠色熒光，而在對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，HLF正常細(xì)胞中的綠色熒光非常弱(圖 7b),說(shuō)明 HLF 對(duì) FA/GODs?Gd(DTPA)的吞噬很少。這是因?yàn)镠LF為FA受體低表達(dá)的正常細(xì)胞，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)綠色熒光較弱，而H460為FA受體高表達(dá)的實(shí)體腫瘤細(xì)胞，通過(guò)FA受體的介導(dǎo)作用，修飾有FA分子的納米粒子優(yōu)先被H460所吞噬，顯示了FA/GODs?Gd(DTPA)在腫瘤早期的熒光成像檢測(cè)中的應(yīng)用前景。

圖7 FA/GODs?Gd(DTPA)分別與肺癌細(xì)胞H460(a)和人肺纖維HLF正常細(xì)胞(b)共孵育1 h后的激光共聚焦顯微鏡明場(chǎng)、暗場(chǎng)和重疊照片F(xiàn)ig.7 Bright field,dark field and overlap laser confocal microscopy images of H460 lung cancer cells(a)and HLF human lung fiber normal cells(b)incubated with FA/GODs?Gd(DTPA)for 1 h,respectively

2.6 MRI成像實(shí)驗(yàn)

ICP?AES檢測(cè)所制備的FA/GODs?Gd(DTPA)樣品 中 Gd3+的 濃 度 為 12.3 μg·mL-1。 FA/GODs?Gd(DTPA)的體外MRI的T1增強(qiáng)性能見(jiàn)圖8a。隨著FA/GODs?Gd(DTPA)分散液中 Gd3+濃度的增大，T1加權(quán)像依次變亮,對(duì)比增強(qiáng)效果逐漸顯著,證明FA/GODs?Gd(DTPA)可實(shí)現(xiàn) MRI的 T1造影成像檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的目的。圖8b是FA/GODs?Gd(DTPA)樣品的弛豫率(r1)擬合圖，從縱向弛豫時(shí)間T1的倒數(shù)隨Gd3+的濃度變化圖斜率可計(jì)算出FA/GODs?Gd(DTPA)的r1值為9.92 L·mmol-1·s-1。

圖8 (a)含有不同Gd3+濃度的FA/GODs?Gd(DTPA)與H460細(xì)胞孵育24 h后T1加權(quán)的MRI;(b)FA/GODs?Gd(DTPA)樣品的1/T1vscGd3+線(xiàn)性擬合圖Fig.8 (a)T1weighted MRI of FA/GODs?Gd(DTPA)incubated with H460 cells for 24 h with different concentrations of Gd3+;(b)Linear fitting for plot of 1/T1vscGd3+of FA/GODs?Gd(DTPA)sample

2.7 DOX的載藥量及釋放曲線(xiàn)

根據(jù)DOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算，1 mL FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX診療試劑的分散液中含有209 μg DOX。圖9為該診療試劑分別在pH值為5.5和7.5條件下的DOX釋放曲線(xiàn)。從圖中可以看出，在pH=5.5時(shí)的DOX釋放速率明顯高于pH=7.5條件下的釋放速率，這是由于DOX分子與GODs之間的π?π堆垛作用在酸性質(zhì)子化的環(huán)境下降低，有利于藥物分子的脫附[22]。以上結(jié)果說(shuō)明在接近中性的血液中(pH=7.4)，F(xiàn)A/GODs?Gd(DTPA)/DOX診療試劑的傳輸相對(duì)比較穩(wěn)定，而在弱酸性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)能夠很好地釋放，從而進(jìn)一步增強(qiáng)了診療試劑的靶向性。

圖9 在PBS中、37℃下FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX在pH值分別為7.5和5.5條件下DOX的釋放曲線(xiàn)Fig.9 Release profiles of DOX from FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX at pH=7.5 and 5.5,respectively,in PBS at 37 ℃

2.8 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

采用 MTT法檢測(cè)了 FA/GODs?Gd(DTPA)納米粒子負(fù)載DOX前后對(duì)H460細(xì)胞的毒性。圖10為同濃度的 FA/GODs?Gd(DTPA)納米顆粒(50～200 μg·mL-1)與肺癌細(xì)胞H460在37℃孵育48 h后的細(xì)胞活性，與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率稍微低了一些，但沒(méi)有明顯的差異。結(jié)果說(shuō)明FA/GODs?Gd(DTPA)納米顆粒對(duì)H460細(xì)胞的毒性非常低，可以作為潛在的探針用于腫瘤靶向檢測(cè)。負(fù)載DOX后，F(xiàn)A/GODs?Gd(DTPA)/DOX對(duì)H460細(xì)胞的殺傷力明顯增強(qiáng)，并且與單獨(dú)的DOX(按照DOX的質(zhì)量濃度進(jìn)行計(jì)算，分別為40、80、120、160 μg·mL-1)相比，更好地提高了DOX的抗腫瘤活性。

圖10 H460細(xì)胞與不同濃度的FA/GODs?Gd(DTPA)、DOX和FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX孵育48 h后的細(xì)胞存活率Fig.10 Cell viability of H460 cells incubated with different concentrations of FA/GODs?Gd(DTPA),DOX and FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX for 48 h,respectively

3 結(jié) 論

通過(guò)化學(xué)鍵作用依次將MRI造影劑Gd(DTPA)和葉酸(FA)分子修飾在了石墨烯熒光量子點(diǎn)(GOGs)的表面，并將阿霉素(DOX)進(jìn)一步通過(guò)π?π堆垛作用吸附在其表面，成功制備了FA/GODs?Gd(DTPA)/DOX熒光/MRI雙模態(tài)靶向肺癌細(xì)胞成像診療試劑。MRI和共聚焦激光掃描顯微鏡結(jié)果表明，相對(duì)于正常的HLF細(xì)胞，所制備的納米試劑可以有效地靶向檢測(cè)FA受體高表達(dá)的肺癌H460細(xì)胞，在接近中性的血液中，F(xiàn)A/GODs?Gd(DTPA)/DOX診療試劑的傳輸相對(duì)比較穩(wěn)定，而在弱酸性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)能夠很好地釋放，顯示了其在腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)和治療中潛在的應(yīng)用前景。