離子液體[Bmim]Cl對HepG2細(xì)胞糖代謝的影響

周磊，薛永來，崔雯，何錦，高璐，杜道林

江蘇大學(xué)環(huán)境生態(tài)研究所，鎮(zhèn)江 212013

離子液體是指由有機(jī)陽離子和無機(jī)或有機(jī)陰離子組成的一類液體，相較于傳統(tǒng)易揮發(fā)的的有毒溶劑，離子液體具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、非揮發(fā)性、不可燃性、幾乎沒有蒸氣壓等優(yōu)點(diǎn)[1]，是被人們廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成、生物催化和電化學(xué)等領(lǐng)域的“綠色溶劑”[2-4]。然而近年來研究人員用細(xì)菌、真菌、小鼠、魚類和哺乳動物細(xì)胞系等實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯堪l(fā)現(xiàn)，離子液體存在生物毒性。

研究表明，咪唑類的離子液體會抑制魚卵巢細(xì)胞(CCO)和人體宮頸癌細(xì)胞(HeLa)的增殖且具有明顯的劑量依賴性[5-6]。值得注意的是，Ranke等[7]以白血病細(xì)胞(IPC-81)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，選取幾種不同鏈長的咪唑類離子液體和傳統(tǒng)的溶劑(丙酮、乙腈、甲醇和甲基叔丁基醚)一起進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)烷基鏈越長其毒性越強(qiáng)，最長鏈的咪唑類離子液體，其毒性甚至超過同等濃度下的傳統(tǒng)溶劑。除了體外實(shí)驗(yàn)，也有研究人員以斑馬魚、小鼠和蚯蚓等動物，以個體作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[8-10]。Dong等[11]研究發(fā)現(xiàn)，咪唑類的離子液體會誘導(dǎo)斑馬魚肝臟活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)過量產(chǎn)生損傷肝臟，并且會導(dǎo)致斑馬魚的DNA損傷。離子液體生殖毒性也在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證，經(jīng)離子液體暴露后的CD-1小鼠的生殖能力會受到影響[12]。離子液體的毒性也在植物中被驗(yàn)證，Liu等[13]發(fā)現(xiàn)[C8mim]Br暴露下小麥的光合作用被明顯抑制并發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

研究者也對離子液體毒性作用的機(jī)制進(jìn)行了研究。Cornmell等[14]通過傅里葉紅外檢測發(fā)現(xiàn)離子液體會進(jìn)入細(xì)胞并在生物膜上大量累積，在細(xì)胞質(zhì)中卻并未檢出離子液體。Hartmann等[15]研究發(fā)現(xiàn)，咪唑類的離子液體會與生物膜相互作用滲透進(jìn)入細(xì)胞的磷脂雙分子層中破壞其完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，側(cè)鏈烷基長度的變化會顯著影響離子液體的親脂性，從而導(dǎo)致受試細(xì)胞生物膜的通透性發(fā)生變化，因此側(cè)鏈長度越長的同類離子液體表現(xiàn)出的細(xì)胞毒性越大?？傊x子液體對細(xì)胞的影響主要表現(xiàn)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、增加膜的通透性和降低膜電位進(jìn)而誘導(dǎo)ROS過量，產(chǎn)生細(xì)胞破裂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。膜電位的改變可能會引起胞內(nèi)線粒體的滲透壓發(fā)生變化，從而對能量代謝造成影響。糖代謝作為生物體能量代謝的重要組成部分，一直以來都是研究熱點(diǎn)。此外，也有研究表明，咪唑類的離子液體會損害模式生物的肝臟[10]，誘導(dǎo)HepG2凋亡[17]。而肝臟作為代謝的中心，離子液體是否會對其糖代謝造成影響，這是我們想要探究的問題。

選用在工業(yè)上應(yīng)用最為廣泛的咪唑類離子液體中鏈長較短、毒性相對較小的1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽([Bmim]Cl)[8,18]，以人體肝癌細(xì)胞HepG2為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，旨在探究離子液體對糖代謝的影響及其機(jī)制，進(jìn)一步明確咪唑類離子液體存在環(huán)境毒性，為水生生態(tài)環(huán)境污染物標(biāo)準(zhǔn)的確定提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 化學(xué)藥品和試劑

離子液體[Bmim]Cl購自上海成捷化工有限公司(中國上海)，純度99%，實(shí)驗(yàn)前稱取所需劑量的離子液體加入培養(yǎng)基配制成母液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將母液逐級稀釋成所需濃度進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中所用試劑盒均購于南京建成生物工程研究所(中國南京)。SYBR綠色熒光染料購自Bio-Rad公司，總RNA提取Trizol試劑和cDNA第一鏈?zhǔn)胶铣稍噭┖芯徲贐eyotime Biotechnology公司，細(xì)胞培養(yǎng)中所用的高糖DMEM培養(yǎng)基購于Thermofisher Scientific公司，胎牛血清(FBS)購于杭州天杭生物科技有限公司(中國杭州)，其他化學(xué)品和試劑均購于國藥化學(xué)試劑有限公司(中國北京)或北京索萊寶科技有限公司(中國北京)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人體肝癌細(xì)胞由江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院環(huán)境生態(tài)研究所提供，細(xì)胞加入配制好的培養(yǎng)基后放置于37 ℃、含有5% CO2的潮濕環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基配比為10%的FBS、1%的鏈霉素和青霉素以及88%的DMEM高糖培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)時為了排除FBS對實(shí)驗(yàn)的影響，用0.2%的牛血清白蛋白(BSA)將其替換。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本次實(shí)驗(yàn)分為2個部分：預(yù)實(shí)驗(yàn)探索合適的暴露濃度，正式實(shí)驗(yàn)探索合適濃度下[Bmim]Cl對細(xì)胞糖代謝的影響。預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置1個空白組、1個純培養(yǎng)基組(無細(xì)胞)和7個[Bmim]Cl處理組，其暴露濃度分別為1、2、4、8、16和32 mmol·L-1。將處于對數(shù)增長期的細(xì)胞鋪入96孔培養(yǎng)板(每孔細(xì)胞量1×104個)中培養(yǎng)24 h使其貼壁生長，將原培養(yǎng)基吸出，用磷酸鹽緩沖液(PBS)潤洗3遍。加入含BSA和不同濃度[Bmim]Cl的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后測定培養(yǎng)基中消耗的葡萄糖和細(xì)胞活性，通過比較選定合適的暴露濃度。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選定濃度為1、2、4和8 mmol·L-1，在保持細(xì)胞密度不變的情況下擴(kuò)大樣本數(shù)量放入6孔板中(每孔細(xì)胞量3×105個)進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)，具體操作與預(yù)實(shí)驗(yàn)保持一致，暴露結(jié)束后對各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測定。

1.4 細(xì)胞存活率測定

使用MTT法測定暴露后的細(xì)胞存活率，具體操作如下：在暴露24 h后吸出原培養(yǎng)基(用于測定葡萄糖)，用PBS溶液清洗3遍，加入配好的培養(yǎng)基100 μL和10 μL 5%的MTT溶液，在37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄上清，加入DMSO溶液150 μL溶解甲瓚，用酶標(biāo)儀測定其在570 nm波長下的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率%=(暴露孔OD/對照孔OD)×100。

1.5 培養(yǎng)基內(nèi)消耗葡萄糖含量測定

培養(yǎng)基內(nèi)消耗葡萄糖含量測定參照Yan等[19]的方法對培養(yǎng)基內(nèi)葡萄糖消耗量進(jìn)行測定，從側(cè)面反映實(shí)驗(yàn)過程中細(xì)胞吸收葡萄糖的量。培養(yǎng)基內(nèi)的葡萄糖含量通過商業(yè)化的葡萄糖測定試劑盒采用葡萄糖氧化酶法測得。消耗的葡萄糖含量(mmol·L-1)=純培養(yǎng)基組葡萄糖含量(mmol·L-1)-實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基葡萄糖含量(mmol·L-1)。

1.6 細(xì)胞內(nèi)糖原含量測定

細(xì)胞內(nèi)糖原含量使用商業(yè)化的糖原測定試劑盒(蒽酮比色法)和總蛋白測定試劑盒(BCA法)測得。具體操作如下：用胰蛋白酶消解暴露后的細(xì)胞，加入培養(yǎng)基后1 000 r·s-1離心3 min后得到細(xì)胞沉淀，加入0.5 mL PBS緩沖液，用超聲細(xì)胞破碎儀冰水浴破碎。取破碎后的溶液測定糖原含量，并測定其蛋白濃度。將糖原含量進(jìn)行蛋白水平標(biāo)準(zhǔn)化。

1.7 RT-qPCR

用Trizol方法提取經(jīng)[Bmim]Cl暴露24 h的HepG2細(xì)胞RNA進(jìn)行相關(guān)基因的表達(dá)分析。提取后的RNA用瓊脂糖電泳和超微量紫外分光光度計(jì)確定其未被DNA和蛋白污染，并使用cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Beyotime)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄完成后，將SYBR Green I(BIO-RAD)用作DNA結(jié)合染料，并將β-肌動蛋白(β-actin)用作內(nèi)部參考基因。使用primer5設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)完成后對其擴(kuò)增效率進(jìn)行驗(yàn)證以確保實(shí)驗(yàn)的可靠性。擴(kuò)增程序設(shè)定為：預(yù)變性95 ℃、30 s，變性95 ℃、5 s，在52～57 ℃退火10 s，40個循環(huán)，最后繪制熔解曲線以測試是否存在非特異性產(chǎn)物。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

通過單向方差分析評估對照組和[Bmim]Cl暴露組之間的差異，并使用IBM SPSS Statistic 19(IBM Corp.，美國)對數(shù)據(jù)進(jìn)行多次比較測試。所有分析均在P<0.05水平下確定統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 細(xì)胞存活率及葡萄糖消耗量

如圖1所示，在不同濃度的[Bmim]Cl作用24 h后，隨著[Bmim]Cl濃度的升高，其細(xì)胞存活率呈下降趨勢。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，[Bmim]Cl濃度為16 mmol·L-1和32 mmol·L-1的處理組與空白對照組之間的細(xì)胞存活率存在顯著差異。

圖1 離子液體[Bmim]Cl暴露后HepG2細(xì)胞的存活率注：暴露時間為24 h；所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)值表示，n=6； 與對照組相比，有顯著性差異，*P<0.05、**P<0.01；下同。Fig. 1 Survival rate of HepG2 cells after exposure to ionic liquid [Bmim]ClNote: The exposure time was 24 h; all data are expressed by average± standard deviation (SD) value, n=6; compared with the control group, there was significant difference, *P<0.05, **P<0.01; the same below.

為探究非致死濃度下[Bmim]Cl對細(xì)胞糖代謝的影響，選取1、2、4和8 mmol·L-1作為處理組的濃度。以暴露后細(xì)胞消耗培養(yǎng)基中的葡萄糖作為指標(biāo)，分析HepG2細(xì)胞糖代謝的變化，結(jié)果如圖2所示。與空白對照組相比，[Bmim]Cl暴露后消耗葡萄糖的量發(fā)生了不同程度的變化，在暴露濃度為2 mmol·L-1的情況下培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗最少，由此可知該組細(xì)胞的糖代謝可能受到了較為嚴(yán)重的影響。結(jié)合圖1分析，在[Bmim]Cl暴露濃度為1、2、4和8 mmol·L-1時，細(xì)胞活性并未受到特別明顯的抑制，但是其消耗葡萄糖的量卻發(fā)生了明顯的改變。

圖2 離子液體[Bmim]Cl暴露后HepG2細(xì)胞 培養(yǎng)基中葡萄糖的消耗量Fig. 2 Consumption of glucose in HepG2 cell culture medium after exposure to ionic liquid [Bmim]Cl

2.2 細(xì)胞內(nèi)糖原含量

為探究不同濃度的[Bmim]Cl對HepG2細(xì)胞糖代謝的影響，測定了糖代謝中重要的生化指標(biāo)糖原含量。如圖3所示，暴露于不同濃度的[Bmim]Cl中24 h后，其糖原的含量相較于空白對照組均有顯著降低。

圖3 離子液體[Bmim]Cl暴露后HepG2細(xì)胞內(nèi)糖原含量Fig. 3 Glycogen content in HepG2 cells after exposure to ionic liquid [Bmim]Cl

2.3 對細(xì)胞糖代謝相關(guān)基因的影響

為研究[Bmim]Cl對HepG2細(xì)胞糖代謝影響的機(jī)制，考察了糖代謝中重要步驟的相關(guān)限速酶的基因表達(dá)情況。測定的基因及其作用如表1所示。

表1 糖代謝相關(guān)基因的名稱及作用Table 1 Names and roles of genes related to glucose metabolism

結(jié)果表明，細(xì)胞的GLUT1在暴露后表達(dá)有顯著下調(diào)，這與葡萄糖消耗量的變化對應(yīng)。糖酵解作為糖代謝的重要階段，其關(guān)鍵的限速酶PKM和PFKL的表達(dá)有相同趨勢的變化，基因的表達(dá)隨暴露濃度的增加而上升，與糖酵解相對應(yīng)的糖異生途徑的相關(guān)基因G6PC的表達(dá)出現(xiàn)了下調(diào)。糖酵解之后的另一重要階段檸檬酸循環(huán)階段的限速酶IDH2也出現(xiàn)了明顯的變化，該基因在暴露濃度為8 mmol·L-1時出現(xiàn)了特別顯著的上調(diào)。此外還檢測了與糖原合成與分解相關(guān)的基因PYGL、GYS2的表達(dá)情況，PYGL的表達(dá)出現(xiàn)劑量依賴式上升，而GYS2基因在中、低劑量暴露時其表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)(圖4)。

圖4 離子液體[Bmim]Cl暴露后HepG2中細(xì)胞中 糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況Fig. 4 Expression of glucose metabolism-related genes in HepG2 cells after exposure to ionic liquid [Bmim]Cl

3 討論(Discussion)

咪唑類離子液體作為被廣泛使用的有機(jī)溶劑，研究者選取了不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ桶唏R魚、小鼠、小麥和人體肝癌細(xì)胞HepG2等，研究了咪唑類離子液體引起的致死效應(yīng)、氧化應(yīng)激以及遺傳毒性[20-22]，而其在低劑量非致死濃度下對細(xì)胞代謝的影響卻并未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，[Bmim]Cl顯著減少培養(yǎng)基內(nèi)葡萄糖的消耗量，[Bmim]Cl暴露后細(xì)胞糖原含量顯著下降。肝細(xì)胞通過糖原分解、糖原合成和糖異生等作用消耗或產(chǎn)生葡萄糖，使體內(nèi)的葡萄糖達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)[17]。HepG2細(xì)胞中糖原分解生成的葡萄糖增加而從胞外吸收的葡萄糖減少。經(jīng)[Bmim]Cl暴露后測定了HepG2糖代謝中關(guān)鍵基因的表達(dá)情況。在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中，GLUT1蛋白是最早發(fā)現(xiàn)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是一種腫瘤標(biāo)志物，其在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)遠(yuǎn)高于在普通細(xì)胞中的表達(dá)[23]。故其在HepG2細(xì)胞中表達(dá)情況在很大程度上能表征細(xì)胞對胞外葡萄糖的吸收情況，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)[Bmim]Cl暴露后GLUT1的表達(dá)出現(xiàn)明顯的下調(diào)，其結(jié)果與胞外葡萄糖消耗的結(jié)果相對應(yīng)。RT-qPCR和葡萄糖消耗的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一致性，兩者都表明[Bmim]Cl確實(shí)會影響HepG2細(xì)胞對葡萄糖的吸收，進(jìn)而影響細(xì)胞的糖代謝。

糖原是葡萄糖在動物體內(nèi)的儲存形式，糖原的合成和分解代謝是生物體調(diào)節(jié)自身血糖和糖代謝的重要途徑[24-25]。本實(shí)驗(yàn)測定了糖原分解代謝的關(guān)鍵基因PYGL和合成代謝的關(guān)鍵基因GYS2，發(fā)現(xiàn)相較于對照組，暴露濃度為1、2和4 mmol·L-1的處理組，PYGL的表達(dá)上升而GYS2的表達(dá)下降，即基因的表達(dá)促進(jìn)糖原分解酶的生成而抑制了糖原合成酶的生成，這導(dǎo)致了糖原分解加快而糖原生成減弱。結(jié)合葡萄糖消耗的研究，推斷這是由于細(xì)胞從胞外吸收的葡萄糖量減少，開始分解自身的糖原以此來維持機(jī)體的穩(wěn)定。而8 mmol·L-1的暴露組由于濃度過高已經(jīng)出現(xiàn)了代謝紊亂的現(xiàn)象，故其糖原的吸收和分解無規(guī)律。GSK3β是另一種參與糖原合成的關(guān)鍵基因，它編碼的酶通過磷酸化糖原合成酶(GS)來降低糖原的合成，該基因表達(dá)的上升也從另一個方面解釋了胞內(nèi)糖原減少的情況[26-27]。

糖酵解作為生物細(xì)胞共同的葡萄糖分解代謝途徑，是糖原分解形成的葡萄糖和胞外吸收葡萄糖分解代謝的必經(jīng)階段，而糖異生途徑恰好與之相反，是機(jī)體生成葡萄糖的重要途徑[25]。本實(shí)驗(yàn)測定了糖酵解途徑的關(guān)鍵酶PFKL的表達(dá)情況，該酶催化果糖-6-磷酸向果糖-2,6-二磷酸轉(zhuǎn)化，有研究表明，PFKL的增加會促進(jìn)糖酵解，同時抑制糖異生[28]，而本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)糖異生途徑的關(guān)鍵酶葡萄糖6磷酸酶(G6PC)隨著濃度增加表達(dá)下降。由此可知，[Bmim]Cl暴露會在一定程度上促進(jìn)HepG2細(xì)胞的糖酵解抑制糖異生，而且這種影響會隨濃度的升高而增加。

檸檬酸循環(huán)又稱為三羧酸循環(huán)，是糖類、脂質(zhì)和氨基酸的最終代謝通路。葡萄糖經(jīng)過糖酵解后生成丙酮酸，丙酮酸在有氧的情況下經(jīng)PDK1的催化后生成乙酰CoA然后進(jìn)入檸檬酸循環(huán)[25]。探究了PDK1基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)隨暴露濃度的升高逐步上升。該反應(yīng)作為有氧糖酵解的下游反應(yīng)，出現(xiàn)這種變化恰好與前文PFK2的表達(dá)增加相呼應(yīng)。而TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶IDH2的表達(dá)并沒有出現(xiàn)相同趨勢的增長，這可能與TCA循環(huán)受多個代謝反應(yīng)影響有關(guān)，但可以肯定的是在最高濃度的[Bmim]Cl暴露下TCA循環(huán)受到了更加明顯的影響。

綜上所述，[Bmim]Cl暴露會影響HepG2細(xì)胞的糖代謝，具體表現(xiàn)為減少細(xì)胞對胞外葡萄糖的吸收，影響細(xì)胞內(nèi)糖酵解、糖原合成與分解、糖異生等相關(guān)代謝途徑，高濃度時甚至?xí)鸢麅?nèi)的糖代謝紊亂。