液液萃取—超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測(cè)原料乳中18種喹諾酮藥物殘留

周艷華 李 濤 潘小紅 向 俊

(1. 長(zhǎng)沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410111；2. 湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410111；3. 湖南省藥品檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410001)

牛奶中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是一種優(yōu)質(zhì)食品來(lái)源。隨著生活水平的提高，乳制品受到人們青睞，乳品安全也受到社會(huì)廣泛關(guān)注，而原料乳安全直接影響乳制品安全。喹諾酮藥物是一種人工合成抗菌藥物，具有抗菌譜廣和價(jià)格低廉等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療[1-2]。藥物濫用，會(huì)出現(xiàn)動(dòng)物的毒性反應(yīng)，且此類(lèi)藥物半衰期長(zhǎng)，殘留的喹諾酮藥物會(huì)造成過(guò)敏，可能對(duì)人體造成肝腎功能損傷和神經(jīng)中毒等不良反應(yīng)[3-4]。歐美發(fā)達(dá)國(guó)家制定了多種喹諾酮類(lèi)藥物在動(dòng)物組織中的最高殘留量[5]。為加強(qiáng)獸藥殘留監(jiān)控工作，保證動(dòng)物性食品衛(wèi)生安全，中國(guó)也修訂了《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》[6]。

目前，喹諾酮藥物殘留的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[7-8]、酶聯(lián)免疫法[9]、液相串聯(lián)質(zhì)譜法[10-11]等。液相色譜法靈敏度低，檢測(cè)項(xiàng)目少，選擇性差；ELISA法儀器化程度低、前處理簡(jiǎn)單，適用于現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品快速篩查，但靈敏度和準(zhǔn)確度有待提高。液質(zhì)聯(lián)用法具有靈敏度高、選擇好、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，是藥物殘留定量定性分析的首選方法。國(guó)家現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中檢測(cè)動(dòng)物源性食品中喹諾酮類(lèi)化合物的標(biāo)準(zhǔn)有GB/T 20366—2006和GB/T 21312—2007。GB/T 21312—2007采用緩沖溶液提取和HLB固相萃取柱凈化，前處理步驟繁雜，而GB/T 20366—2006未對(duì)牛奶基質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證研究，不適用于原料奶檢測(cè)。目前報(bào)道的原料乳中多種喹諾酮藥物殘留凈化方法包括HLB固相萃取柱法[12]、免疫固相萃取柱法[13]、QuEChERS法[14]等，其均通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)。

試驗(yàn)擬采用液液萃取凈化法進(jìn)行前處理，并將該前處理技術(shù)與超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合，用于大批量原料乳中18種喹諾酮類(lèi)藥物殘留的快速檢測(cè)，旨在為有效監(jiān)控原料乳中喹諾酮藥物提供依據(jù)，從而保證乳制品安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳：市售；

C18色譜柱：150 mm×2.1 mm，3 μm，美國(guó)賽默飛世爾公司；

乙腈、甲醇、乙酸乙酯：色譜純，德國(guó)默克公司；

甲酸：優(yōu)級(jí)純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

恩諾沙星(CAS 93106-60-6，≥98%)、環(huán)丙沙星(CAS 85721-33-1，≥99.4%)、氧氟沙星(CAS 82419-36-1，≥99.7%)、諾氟沙星(CAS 70458-96-7，≥98%)、培氟沙星(CAS 70458-92-3，≥99.8%)、洛美沙星(CAS 98079-52-8，≥98%)、達(dá)氟沙星(CAS 112398-08-0，99.9%)、依諾沙星(CAS 74011-58-8，99.9%)、沙拉沙星(CAS 91296-87-6，97.7%)、雙氟沙星(CAS 91296-86-5，96.2%)、司帕沙星(CAS 110871-86-8，99.9%)、吡哌酸(CAS 51940-44-4，98.0%)、西諾沙星(CAS 28657-80-9，98.0%)、萘啶酸(CAS 389-08-2，99.9%)、氟甲喹(CAS 42835-25-6，99.6%)、氟羅沙星(CAS 79660-72-3，99.2%)、奧比沙星(CAS 113617-63-3，97.1%)、麻保沙星(CAS 115550-35-1，99.9%)標(biāo)準(zhǔn)品：北京壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜：TSQ Quantis型，美國(guó)賽默飛世爾公司；

電子分析天平：BSA224s型，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；

高速離心機(jī)：TG16-WS型，長(zhǎng)沙市湘儀儀器有限公司；

超聲波清洗器：2050T型，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

高速振蕩器：CM-1000型，東京理化器械株式會(huì)社。

1.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在HESI離子源下，采用Full掃描和SRM掃描，毛細(xì)管電壓3 500 V；汽化溫度350 ℃；鞘氣壓0.24 kPa；輔助氣壓0.091 kPa；取標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)質(zhì)譜，通過(guò)Full掃描，確定電離模式和母離子m/z，通過(guò)SRM掃描，確認(rèn)最優(yōu)質(zhì)譜條件。

1.4 液相色譜條件優(yōu)化

在相同其他色譜條件下，優(yōu)化流動(dòng)相種類(lèi)，優(yōu)化的無(wú)機(jī)流動(dòng)相為：5 mmol/L乙酸銨溶液、體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液、體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸—5 mmol/L乙酸銨溶液，優(yōu)化的有機(jī)流動(dòng)相為：甲醇和乙腈，考察樣品的分離效果與響應(yīng)度。設(shè)定無(wú)機(jī)流動(dòng)相為A相，有機(jī)流動(dòng)相為B相；流速0.3 mL/min；色譜柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積5 μL。梯度洗脫程序：0.0～0.5 min，90% A；0.5～3.0 min，90%～70% A；3.0～7.5 min，70%～10% A；7.5～9.5 min，10% A；9.5～9.6 min，10%～90% A；9.6～12.5 min，90% A。

1.5 樣品前處理工藝優(yōu)化

精密稱(chēng)取混合均勻的原料乳2.0 g于50 mL離心管中(n=6)，加入3 mL 1#提取劑(分別為水、0.1%甲酸及0.2%甲酸)，振搖5 min，超聲10 min，加入15 mL 2#提取劑(分別為甲醇、乙腈和乙酸乙酯)，振蕩15 min，離心，取5.0 mL上清液氮吹至近干，15%甲醇水溶液定容至1.0 mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，測(cè)定并計(jì)算喹諾酮類(lèi)化合物的回收率，確定最優(yōu)提取溶劑。

1.6 方法學(xué)驗(yàn)證

取空白原料乳，配制質(zhì)量濃度為2.0～100.0 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)線性系列溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在空白原料乳中添加低濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按最優(yōu)的前處理工藝處理后測(cè)定，S/N≥3的濃度為檢出限(LOD)，S/N≥10的濃度為定量限(LOQ)。分別在原料乳中加入18種喹諾酮類(lèi)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)后樣品濃度分別為2.0，4.0，20.0 μg/kg(n=6)。測(cè)定18種喹諾酮藥物殘留含量，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值。

1.7 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

取空白原料乳基質(zhì)，配制空白基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，同時(shí)配制相同濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定后得基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)基質(zhì)效應(yīng)(ME)可由基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率百分比表示的方法反映每個(gè)喹諾酮化合物的基質(zhì)效應(yīng)[15-16]。

1.8 樣品檢測(cè)

取20批次原料乳，用所建立的檢測(cè)方法檢測(cè)樣品中18種喹諾酮類(lèi)化合物，判定樣品中是否有喹諾酮藥物殘留。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，分析準(zhǔn)確度、精密度、檢出限、定量限及回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

經(jīng)Full掃描得知，18種喹諾酮類(lèi)化合物在正離子模式下響應(yīng)值最高，通過(guò)SRM掃描，得到喹諾酮化合物母離子、子離子及相應(yīng)最佳碰撞電壓、RF-lens電壓，選擇信號(hào)強(qiáng)度最高的子離子為定量離子。18種喹諾酮類(lèi)化合物質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 18種喹諾酮類(lèi)化合物的質(zhì)譜參數(shù)表?

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

在最優(yōu)質(zhì)譜、色譜條件下，18種喹諾酮化合物的定量離子提取色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，18種喹諾酮在12.5 min 內(nèi)得到了有效分離。當(dāng)無(wú)機(jī)流動(dòng)相分別為5 mmol/L 乙酸銨溶液、體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液、體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸—5 mmol/L乙酸銨溶液時(shí)，有機(jī)流動(dòng)相為甲醇、乙腈、體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸—乙腈均能分離出18種喹諾酮類(lèi)化合物，但存在峰形、分離度及響應(yīng)度的差異。當(dāng)無(wú)機(jī)流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸—5 mmol/L乙酸銨溶液時(shí)，喹諾酮化合物的分離度及峰形較好，有機(jī)流動(dòng)相為乙腈時(shí)，化合物分離效果及響應(yīng)值最高。由于所測(cè)喹諾酮化合物種類(lèi)較多，低濃度的乙酸銨溶液可改善喹諾酮化合物的峰形，使峰型更尖銳，分離度更好，低濃度甲酸可為喹諾酮化合物電離時(shí)提供質(zhì)子。有機(jī)流動(dòng)相為甲醇時(shí)，組分色譜峰形易變寬，組分分離度低，而乙腈作為有機(jī)流動(dòng)相時(shí)可明顯改善酸喹諾酮化合物的峰形，因此最佳的色譜條件為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸—5 mmol/L乙酸銨—乙腈。

圖1 18種喹諾酮類(lèi)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子色譜圖

2.3 1#提取劑優(yōu)化結(jié)果

由圖2可知，3種1#提取劑中，15種喹諾酮化合物的回收率存在差異，萘啶酸、吡哌酸、氟甲喹3種化合物的回收率無(wú)顯著差異，其他化合物經(jīng)水提取后回收率最高，為75%～110%，0.2%甲酸水溶液的最低。1#提取劑主要將待測(cè)物中目標(biāo)化合物溶解分散，通過(guò)超聲波輔助提取，利用超聲波的空化作用提高樣品中的喹諾酮化合物的運(yùn)動(dòng)速率和穿透力，從而提高回收率。加入甲酸后，降低了提取溶液的pH值，使原料乳中蛋白質(zhì)凝聚，吸附了喹諾酮，從而影響了回收率。試驗(yàn)不采用常用的獸藥殘留緩沖液提取液如Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液和磷酸鹽緩沖溶液，因液液萃取凈化法會(huì)將難揮發(fā)的鈉鹽帶入質(zhì)譜，影響質(zhì)譜的靈敏度，因此選擇最優(yōu)的1#提取劑為水。

圖2 1#提取劑對(duì)喹諾酮回收率的影響

2.4 2#提取劑優(yōu)化結(jié)果

由圖3可知，選擇水作為1#提取劑，3種2#提取劑中，乙腈提取后喹諾酮化合物回收率最高，乙酸乙酯提取后目標(biāo)化合物回收率最低，2#提取劑對(duì)吡哌酸、萘啶酸、氟甲喹3種化合物的回收率影響不顯著。獸藥殘留最常用的提取劑包括甲醇、乙腈和乙酸乙酯，三者中乙腈極性最大，乙酸乙酯極性最小，喹諾酮化合物為酸堿兩性化合物，易溶于水，經(jīng)1#超聲提取后，喹諾酮化合物已分散在水性介質(zhì)中，因此乙酸乙酯提取回收率低，甲醇提取時(shí)水溶性蛋白進(jìn)入提取液中，影響了目標(biāo)化合物的電離，回收率不高。乙腈具有沉淀蛋白作用，經(jīng)乙腈提取后溶液中的蛋白質(zhì)、脂肪含量大大降低，基質(zhì)干擾減少，從而提高了回收率。

圖3 2#吸附劑對(duì)喹諾酮回收率的影響

2.5 線性關(guān)系、檢出限和定量限結(jié)果

由表2可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為2.0～100.0 ng/mL時(shí)，18種喹諾酮化合物的線性關(guān)系良好(R2≥0.992)，檢出限(LOD)為0.02～0.50 μg/kg，定量限(LOQ)為0.06～1.50 μg/kg，此方法所得大部分喹諾酮化合物的檢出限和定量限優(yōu)于GB/T 20366—2006和 GB/T 21312—2007的。不同喹諾酮化合物的分子量和結(jié)構(gòu)不同，在同一條件下的響應(yīng)度和信噪比不同，因此檢出限和定量限也不同。

表2 喹諾酮化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.6 準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果

由表3可知，當(dāng)喹諾酮加標(biāo)濃度為2.0 μg/kg時(shí)，回收率為74.0%～100.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.0%～12.5%；當(dāng)喹諾酮加標(biāo)濃度為4.0 μg/kg時(shí)，回收率為76.7%～100.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.8%～13.0%；當(dāng)喹諾酮加標(biāo)濃度為20.0 μg/kg時(shí)，回收率為80.0%～106.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.1%～10.2%。3個(gè)梯度加標(biāo)回收率和精密度良好，回收率符合GB/T 27404—2008中當(dāng)加標(biāo)濃度<0.1 mg/kg時(shí)，回收率為60%～120%的要求。因18種喹諾酮化合物的定量限不同，為使準(zhǔn)確度試驗(yàn)覆蓋所有喹諾酮化合物，采用濃度較高的依諾沙星的定量限為最低加標(biāo)濃度，分別以定量限、2倍定量限和10倍定量限濃度進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，結(jié)果表明試驗(yàn)建立的方法滿(mǎn)足原料乳中18種喹諾酮化合物的測(cè)定。

表3 喹諾酮化合物的回收率和精密度

2.7 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

由圖4可知，吡哌酸和西諾沙星表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，其他喹諾酮化合物的基質(zhì)效應(yīng)均在80%～120%，表現(xiàn)為基質(zhì)效應(yīng)不明顯。該方法中有兩種化合物的基質(zhì)效應(yīng)明顯，為保證所有化合物檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，仍采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，非測(cè)定吡哌酸和西諾沙星，可以選用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線。因液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀的離子源結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，不可避免地會(huì)出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)，并對(duì)目標(biāo)化合物的靈敏度、準(zhǔn)確度和方法的重現(xiàn)性等產(chǎn)生影響。通常采用不同凈化工藝、同位素內(nèi)標(biāo)及基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)減少基質(zhì)效應(yīng)，試驗(yàn)采用液液萃取法凈化了原料乳中的蛋白質(zhì)、脂肪基質(zhì)，且結(jié)果表明此研究方法中大部分喹諾酮類(lèi)化合物基質(zhì)效應(yīng)不明顯，說(shuō)明前處理工藝能夠最大限度地凈化基質(zhì)，保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖4 18種喹諾酮化合物的基質(zhì)效應(yīng)

2.8 方法運(yùn)用

為驗(yàn)證方法的有效性，采用所建立的方法對(duì)市售的20批原料乳進(jìn)行檢測(cè)，樣品中均未檢出上述18種喹諾酮類(lèi)化合物，且質(zhì)控樣品加標(biāo)回收率符合GB/T 27404—2008要求，表明結(jié)果準(zhǔn)確可靠。說(shuō)明原料乳中喹諾酮化合物殘留風(fēng)險(xiǎn)較小，后續(xù)將選擇不同來(lái)源的原料奶進(jìn)行檢測(cè)。

3 結(jié)論

建立了同時(shí)快速檢測(cè)原料乳中18種喹諾酮類(lèi)藥物殘留的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。采用液液萃取法提取凈化樣品，并對(duì)線性方程、檢出限、定量限、回收率等方法學(xué)指標(biāo)進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相比，此研究驗(yàn)證了原料乳中喹諾酮化合物的檢測(cè)方法，增加了所檢測(cè)目標(biāo)化合物的數(shù)量，定量限優(yōu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，在不影響準(zhǔn)確度的情況下采用液液萃取工藝，大大縮短了檢驗(yàn)時(shí)間，提高了檢驗(yàn)效率，降低了成本，提高了檢測(cè)通量，且基質(zhì)效應(yīng)不明顯。該方法作為批量快速檢測(cè)原料乳中18種喹諾酮類(lèi)化合物定量檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)單高效、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。