大將逐瘀湯治療胸腰椎骨折早期腸麻痹作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

吳思賢，鐘遠(yuǎn)鳴，李智斐，吳卓檀，何炳坤，萬(wàn) 通，鐘錫鋒

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530001)

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腸麻痹的發(fā)生是由于脊椎骨骼遭受外力，骨斷筋離，血溢脈外，敗血留滯腸道，腑氣升降失常，發(fā)為本病[1]。大將逐瘀湯是洛陽(yáng)郭氏正骨流派的經(jīng)典名方，原方由大黃、生姜、檳榔三味藥物組成，具有攻下散瘀、行氣止痛的功效。方中大黃善入血分，蕩滌凝滯敗血；檳榔善行腸胃之氣，消積導(dǎo)滯，兼能緩瀉通便；配以生姜防止大黃寒涼傷脾胃，諸藥合用共奏攻下祛瘀、通利大便之功[2]。我院骨科繼承和發(fā)展了平樂正骨流派的精髓，已開展相關(guān)的臨床研究證實(shí)大將逐瘀湯治療脊柱骨折療效較好[3-5]。然而，并未對(duì)其具體的作用機(jī)制深入研究，究其原因主要是其治療機(jī)制復(fù)雜，單一成分或者靶點(diǎn)的研究，往往不能充分體現(xiàn)出中藥復(fù)方治療疾病的潛在作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)為中藥微觀研究提供了新契機(jī)，它利用生物信息科學(xué)、藥理學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)等多學(xué)科知識(shí)體系構(gòu)建了藥物成分疾病靶點(diǎn)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)[6]。本研究旨在揭示大將逐瘀湯改善胸腰椎骨折初期腸麻痹癥狀的潛在作用機(jī)制，為臨床用藥及進(jìn)一步藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)來(lái)源與分析平臺(tái) 中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)(Traditional Chinese medicine systems pharmacology,TCMSP)、Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian inheritance man,OMIM) 數(shù)據(jù)庫(kù)、Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)、Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)、RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)、R軟件、Strawberry Perl軟件、Cytoscape軟件、String平臺(tái)、Auto Dock Tools軟件。

1.2 研究方法

1.2.1 藥物活性成分及靶點(diǎn)蛋白篩選：利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)搜索大將逐瘀湯中大黃、生姜、檳榔所含有的活性化合物，以生物口服利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，收集大黃、生姜、檳榔的活性成分[7]。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)化合物靶點(diǎn)識(shí)別功能，篩選出所有藥物潛在活性成分的作用靶點(diǎn)，最后通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)及Strawberry Perl軟件為篩選出來(lái)的靶點(diǎn)添加官方簡(jiǎn)化名稱。

1.2.2 收集大將逐瘀湯活性成分與胸腰椎骨折早期腸麻痹疾病共同靶點(diǎn)信息：基于OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)和Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Intestinal obstruction”“ileus” 為檢索關(guān)鍵詞，檢索時(shí)間截止于2020年7月，合并各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索結(jié)果，去除重復(fù)的疾病靶點(diǎn)后，利用R軟件將數(shù)據(jù)整合，與藥物靶點(diǎn)取交集構(gòu)建韋恩圖。

1.2.3 構(gòu)建藥物-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖：將上述獲得的大將逐瘀湯活性成分、藥物與疾病交集的靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行一一映射，將結(jié)果可視化獲得藥物-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，再通過Cytoscape軟件中Cyto NCA工具對(duì)復(fù)方活性成分的Degree值進(jìn)行計(jì)算，Degree值越高，說(shuō)明該活性成分在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的作用越明顯。

1.2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI網(wǎng)絡(luò))構(gòu)建：將藥物作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集后獲得的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入蛋白質(zhì)相互作用String平臺(tái)，物種選擇人類(Homo sapiens)，最低互作分值設(shè)置為0.70，并去除邊緣游離的靶點(diǎn)，下載tsv文件，將構(gòu)建好的網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件，根據(jù)插件Cyto NCA對(duì)疾病的靶點(diǎn)打分，取得分高者作為核心靶點(diǎn)。

1.2.5 GO功能分析和KEGG通路富集分析：將獲得的藥物-疾病交集靶點(diǎn)通過R語(yǔ)言軟件進(jìn)行GO功能分析和KEGG 通路分析。

1.2.6 分子對(duì)接：將上述過程獲得的Degree值排名前三的復(fù)方潛在活性化合物作為核心配體蛋白，于Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)下載其相應(yīng)的3D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Chem Bio3D Ultra 14.0軟件中輸出格式為pdb的文件。將PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree值前三的靶點(diǎn)作為此次分子對(duì)接的核心受體蛋白，通過RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索并下載其3D結(jié)構(gòu)，利用PyMOL軟件去除受體蛋白中原有小分子配體及水分子，最后將文件保存為pdb格式。將上述處理完畢的核心配體蛋白與核心受體蛋白pdb文件導(dǎo)入Auto Dock Tools軟件工具進(jìn)行活性口袋分析，最后選擇Auto Dock Vina對(duì)接工作軟件進(jìn)行配體與受體的對(duì)接，將本次核心配體蛋白對(duì)接至去除小分子配體的核心受體蛋白中。分子對(duì)接穩(wěn)定性的判定標(biāo)準(zhǔn)為當(dāng)二者對(duì)接結(jié)合能<0 kcal/mol時(shí)，表明受體與配體對(duì)接具有良好的親和力，提示結(jié)合越穩(wěn)定。

2 結(jié) 果

2.1 藥物活性成分及靶點(diǎn)蛋白信息 依據(jù)篩選條件收集后發(fā)現(xiàn)大將逐瘀湯共有29種潛在活性成分，其中檳榔8種、大黃16種、生姜5種，見表1。據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)化合物靶點(diǎn)識(shí)別功能，篩選出所有藥物潛在的作用靶點(diǎn)蛋白，并利用Strawberry Perl軟件對(duì)藥物活性成分相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行整合，共獲得靶點(diǎn)226個(gè)。最后通過下載Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)的基因蛋白，過濾條件為“Reviewed”“Homo sapiens”，采用Perl軟件為篩選出來(lái)的靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為官方基因名稱，剔重后獲取靶點(diǎn)基因71個(gè)。

表1 大將逐瘀湯部分潛在活性成分信息

2.2 大將逐瘀湯活性成分與胸腰椎骨折早期腸麻痹疾病共同靶點(diǎn)信息 通過Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)共獲取的疾病靶點(diǎn)數(shù)目為6647個(gè)，將這些靶點(diǎn)與大將逐瘀湯潛在活性成分作用靶點(diǎn)通過R語(yǔ)言軟件進(jìn)行一一映射，排除重復(fù)項(xiàng)的疾病靶點(diǎn)，得到交集靶點(diǎn)共60個(gè)，并構(gòu)建藥物-疾病靶點(diǎn)韋恩圖。其中綠色代表藥物(Drug)靶點(diǎn)、粉色代表疾病(Disease)靶點(diǎn)，相交部分為交集靶點(diǎn)(圖1)。

圖1 大將逐瘀湯活性成分與胸腰椎骨折早期腸麻痹疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 藥物-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建信息 將上述篩選獲得的137個(gè)藥物-疾病交集靶點(diǎn)與復(fù)方藥物潛在活性成分通過Strawberry Perl軟件進(jìn)行整合，生成相應(yīng)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)和相關(guān)屬性文件，并導(dǎo)入Cytoscape軟件，進(jìn)行可視化分析得到藥物-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。圖中黃色代表大黃活性成分，紅色代表檳榔活性成分，綠色代表生姜活性成分，黃色和綠色重合提示有兩種及以上藥物共同構(gòu)成的活性成分。右側(cè)紫色代表交集靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)間連線越多，代表該成分或靶點(diǎn)作用越大。利用Cytoscape軟件中插件“CytoNCA”計(jì)算藥物潛在活性成分對(duì)應(yīng)的Degree值，該值越大，表明活性成分在治療腸麻痹過程中發(fā)揮的作用越明顯。通過計(jì)算Degree值排名前三的活性成分分別為β-谷甾醇 (β-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、蘆薈大黃素(Aloe-emodin)，對(duì)應(yīng)的Degree值分別為25、23、19，提示以上化合物在該網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位。

2.4 活性成分-疾病共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖 通過String蛋白互作平臺(tái)得到大將逐瘀湯活性成分與胸腰椎骨折早期腸麻痹疾病共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。該網(wǎng)絡(luò)圖共計(jì)有60個(gè)節(jié)點(diǎn)，相互作用關(guān)系由145條接觸線構(gòu)成，PPI富集P<1.0×10-16，平均局部聚類系數(shù)為0.46，平均節(jié)點(diǎn)度值4.83。圖中每個(gè)節(jié)點(diǎn)表示一個(gè)蛋白，節(jié)點(diǎn)上標(biāo)記的字母為對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的gene symbol，節(jié)點(diǎn)之間的連線表示兩個(gè)蛋白具有相互作用。若某一靶點(diǎn)Degree值超過平均節(jié)點(diǎn)度值，則該靶點(diǎn)在此網(wǎng)絡(luò)處于核心地位，在治療上發(fā)揮主要作用。本次計(jì)算結(jié)果中，超過平均節(jié)點(diǎn)度值的靶點(diǎn)共有52個(gè)，其中排名前五的靶點(diǎn)為TP53、JUN、CASP3、ESR1、MYC，對(duì)應(yīng)的Degree值分別為：20、14、13、12、12。

2.5 共同靶點(diǎn)GO功能富集分析結(jié)果 共同靶點(diǎn)經(jīng)過GO功能分析得到1490種生物學(xué)過程(Biological process，BP)、39種細(xì)胞組分(Cellular component，CC)、138項(xiàng)分子功能(Molecular function，MF)。圖4列出了排名前10的條目，顏色越紅，圓圈越大，說(shuō)明該基因富集程度越高。由圖可知，大將逐瘀湯活性成分與胸腰椎骨折早期腸麻痹疾病共同靶點(diǎn)主要分布于脂筏、細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)、膜區(qū)等組分中；主要通過類固醇激素受體活性、G蛋白偶聯(lián)受體活性、核受體活性等方式參與藥物反應(yīng)、糖皮質(zhì)激素反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)水平反應(yīng)、氧化反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控DNA模板等生物過程。

圖4 共同靶點(diǎn)GO富集分析氣泡圖

2.6 共同靶點(diǎn)KEGG通路富集分析結(jié)果 通過R語(yǔ)言軟件包對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，進(jìn)行可視化分析得到氣泡圖(圖5)。圖中氣泡形狀和大小代表該通路富集的靶點(diǎn)基因數(shù)目，通路上富集的基因越多，則形狀越大，顏色代表P值，P值越小，顏色越鮮紅，P值越大，顏色越藍(lán)。結(jié)果顯示，神經(jīng)活性配體-受體相互作用、乙型肝炎通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、P53信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路等160條信號(hào)通路與大將逐瘀湯治療胸腰椎骨折后早期腸麻痹關(guān)系密切。

圖5 共同靶點(diǎn)KEGG通路富集分析氣泡圖

2.7 分子對(duì)接結(jié)果 將藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中獲取的Degree值排名前三的藥物潛在活性成分β-谷甾醇、豆甾醇、蘆薈大黃素作為本次分子對(duì)接的核心配體。對(duì)應(yīng)PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中Degree值前三位的核心靶點(diǎn)TP53、JUN、CASP3作為核心受體。受體與配體對(duì)接結(jié)果見表2，表內(nèi)的CID為該有效化合物在Pub Chem數(shù)據(jù)庫(kù)的編碼，結(jié)合能越低，說(shuō)明配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定。將部分配體受體對(duì)接情況近一步可視化得到圖6。

表2 受體與配體對(duì)接結(jié)果

A：aloe-emodin與JUN；B：aloe-emodin與T53；C：stigmasterol與T53

3 討 論

脊柱骨折是常見的骨骼肌肉系統(tǒng)損傷，其中大部分發(fā)生在胸椎和腰椎，近75%～90%累及胸腰段[8]。骨折發(fā)生后由于局部血腫的形成和炎癥反應(yīng)，對(duì)腹膜后的交感神經(jīng)造成壓迫與刺激，致使胃腸蠕動(dòng)、推進(jìn)功能減退，臨床上表現(xiàn)為腹部脹滿、腹痛、大便不通、惡心欲吐，稱之為腸麻痹[9]。一旦處理不及時(shí)，腸道嚴(yán)重脹氣可壓迫膈肌出現(xiàn)呼吸困難，下腔靜脈回流受阻引起深靜脈血栓，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后，因此早期干預(yù)改善癥狀尤為重要[10-11]。治療上大多采用直腸灌注開塞露或利用甘露醇的高滲作用增加腸道水分，刺激消化道，促進(jìn)排便，但甘露醇在消化道內(nèi)會(huì)釋放氣體，導(dǎo)致腹壓增高，進(jìn)一步加重腹痛、腹脹等癥狀，有造成腸損傷的風(fēng)險(xiǎn)，使患者難以接受[12]。

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，探討了大將逐瘀湯防治胸腰椎骨折早期腸麻痹的分子作用機(jī)制。胸腰椎骨折合并腸麻痹時(shí)，腸黏膜所發(fā)生的一系列病理變化過程及臨床癥狀與中醫(yī)學(xué)理論上“瘀”及“不通則痛”的理論不謀而合。大將逐瘀湯以大黃為君藥，直降下行，蕩滌凝滯敗血；配以檳榔，辛散苦泄，善行腸腑之氣，消積導(dǎo)滯；佐以生姜防大黃寒涼傷脾胃[13]。β-谷甾醇主要獲取途徑是通過胃腸道吸收，該物質(zhì)通過調(diào)控下丘腦-垂體-腎上腺激素軸以達(dá)到類激素樣抗炎作用[14]。肖志彬等[15]發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇具備強(qiáng)大的氧自由基清除能力，能提高血清中一氧化氮水平，抑制病灶周圍腫瘤壞死因子的聚集與釋放，達(dá)到抗炎、鎮(zhèn)痛的作用。ERK1/2通路是參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)(如細(xì)胞凋亡和癌變)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，當(dāng)機(jī)體組織處于缺血、缺氧狀態(tài)時(shí)，ERK1/2途徑顯著增加[16]。嚴(yán)寧等[17]認(rèn)為β-谷甾醇能下調(diào)ERK1/2，有效抑制細(xì)胞的凋亡，從而減輕組織的缺血再灌注損傷。蘆薈大黃素能刺激腸壁的蠕動(dòng)，同時(shí)由于滲透壓的變化，利于推進(jìn)腸內(nèi)糞便，從而達(dá)到刺激性腹瀉的目的[18]。大黃的蒽醌衍生物大黃酚-8-葡萄糖苷能抑制膠原和凝血酶，從而拮抗血小板聚集，在體外動(dòng)物試驗(yàn)中可抑制血小板聚集并拮抗血栓素α2的形成[19]。大將逐瘀湯方中的主要成分豆甾醇、兒茶素同樣具備抗氧化、清除自由基、抗炎等作用[20]。大將逐瘀湯充分體現(xiàn)了“以通為用”的治法，不但逐瘀瀉下，有效緩解因局部血腫壓迫和炎癥刺激引起的腸道黏膜瘀血，又能行氣通滯，促進(jìn)腸蠕動(dòng)，建立保護(hù)屏障，形成良性循環(huán)，改善胃腸癥狀。

大將逐瘀湯中的各種活性成分存在緊密的協(xié)同關(guān)系，PPI網(wǎng)絡(luò)圖包含了60個(gè)作用節(jié)點(diǎn)及145條相互聯(lián)系線。核心靶點(diǎn)基因包括TP53、JUN、CASP3、ESR1、MYC，其中TP53、CASP3是調(diào)控細(xì)胞凋亡過程中重要的相關(guān)基因，可引起蛋白解酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，主要介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。椎體骨折后出血和腹脹會(huì)引起腹內(nèi)壓的增高，對(duì)竇椎神經(jīng)或背根神經(jīng)形成機(jī)械壓迫，造成神經(jīng)節(jié)水腫、變性，引起腹痛，JUN是一種核內(nèi)原癌基因，對(duì)神經(jīng)修復(fù)和再生具有積極作用。體外動(dòng)物研究表明，由JUN和轉(zhuǎn)錄-3激活劑組成的二聚體刺激了模型神經(jīng)元和背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)[22]。ESR1靶點(diǎn)可調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子信號(hào)、5-羥色胺和一氧化氮代謝等通路發(fā)揮抗缺氧作用[23]。GO功能富集分析顯示，大將逐瘀湯治療腸麻痹與藥物反應(yīng)、糖皮質(zhì)激素反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)水平反應(yīng)、氧化反應(yīng)等生物過程關(guān)系密切。中樞神經(jīng)和脊髓的調(diào)控失能、炎癥協(xié)調(diào)機(jī)制、藥理相互作用均可對(duì)胃腸道平滑肌的收縮造成影響，大將逐瘀湯可通過以上生物過程發(fā)揮抗炎、抗氧化、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、促進(jìn)胃腸平滑肌蠕動(dòng)的功能。KEGG富集分析涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用、PI3K-Akt信號(hào)通路、P53信號(hào)通路、乙型肝炎通路、鈣離子信號(hào)通路等。鈣離子信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)有氧代謝，引起小腸腸道平滑肌細(xì)胞和Cajal間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞膜去極化,促進(jìn)Ca2+內(nèi)流,改善平滑肌舒縮功能,從而促進(jìn)腸道蠕動(dòng)和排空，以達(dá)到緩解腸麻痹癥狀的目的[24]。這為防治胸腰椎創(chuàng)傷后腸麻痹提供了新的研究靶點(diǎn)與思路。本次選擇活性成分β-谷甾醇、豆甾醇、蘆薈大黃素作為配體，核心靶點(diǎn)TP53、JUN、CASP3作為受體進(jìn)行分子對(duì)接。3個(gè)核心配體與3個(gè)核心受體兩兩對(duì)接后結(jié)合能均<0 KJ/mol，表明配體與受體對(duì)接后結(jié)合穩(wěn)定，具有良好的親和力，這為大將逐瘀湯防治胸腰椎性骨折早期腸麻痹奠定分子理論基礎(chǔ)。

綜上，本次研究表明大將逐瘀湯可通過29個(gè)活性成分作用于71個(gè)防治靶點(diǎn)調(diào)控160條信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛、改善微循環(huán)、恢復(fù)胃腸道蠕動(dòng)的作用。體現(xiàn)了中藥復(fù)方在配伍上具備優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)、協(xié)同增效的特點(diǎn)，同時(shí)也揭示了中藥復(fù)方多成分-多靶點(diǎn)-多通路治療疾病的本質(zhì)，為臨床防治胸腰椎性骨折早期腸麻痹及進(jìn)一步分子實(shí)驗(yàn)研究提供參考。受篩選條件限制，本研究具有一定局限性，因只選擇了方中的關(guān)鍵活性成分、治療靶點(diǎn)及相關(guān)通路進(jìn)行研究，未來(lái)仍需進(jìn)行相關(guān)藥理學(xué)研究進(jìn)一步補(bǔ)充說(shuō)明。