腫瘤浸潤淋巴細胞在不同分子亞型乳腺癌新輔助化療中的作用

謝芳 馬驂 吳玲玲 單宏杰 馬強 黃贊

安徽醫(yī)科大學附屬宿州醫(yī)院，宿州市立醫(yī)院1腫瘤外科，2病理科（安徽宿州234000）

乳腺癌的發(fā)病率正在逐年升高，且發(fā)病人群逐漸年輕化，成為威脅女性生命健康的罪魁禍首［1-3］。它的發(fā)生、發(fā)展與環(huán)境、遺傳以及腫瘤所處的微環(huán)境等一些復雜分子生物學因素密切相關，免疫系統在此過程中也起著重要調控作用［4-5］。腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）是以淋巴細胞為主的存在于腫瘤癌巢內及間質中的異質性淋巴細胞群體。TILs 的出現，是宿主免疫系統對腫瘤抗原免疫應答的標志，反映了腫瘤局部發(fā)生的免疫反應，腫瘤原發(fā)灶中TILs的水平反映了機體的抗腫瘤能力，其數量也預示著腫瘤的治療效果［6］。乳腺癌的新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）可以使腫瘤降期降級，提高保乳率及手術R0 切除率，是乳腺癌綜合治療的重要組成部分。選取敏感適宜可量化的分子標志物，準確評估個體NAC 的療效，以避免無效治療延誤患者病情，是當今研究的熱點。本研究通過計算不同亞型乳腺癌患者NAC 前粗針穿刺標本中的TILs 比例、術后病理學評估大體標本的化療反應并進行統計學分析，來探討TILs 比例能否作為NAC 療效預測的一個可靠的生物學指標，從而輔助決策乳腺癌病患NAC 方案，以期實現精準個體化治療。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2019年7月至2020年7月期間我院腫瘤外科56 例乳腺癌患者的臨床病理資料，入院均予粗針穿刺活檢確診后行NAC 后完成手術?；颊呔鶠榕?，年齡31 ～69 歲，中位年齡47 歲，腫瘤最大徑1.8 ～6.0 cm，中位直徑3.4 cm，臨床分期Ⅱ期24 例，Ⅲ期32 例，分子亞型Luminal型17 例，HER-2 陽性20 例（包括HR 陽性及HR陰性），三陰性16 例，3 例患者因免疫組化HER-2（2+）未行cerbB2 基因檢測，故未分型。所有患者均簽署知情同意書，予含蒽環(huán)類和/或紫杉類藥物方案的NAC，15 例HER-2 陽性患者NAC 聯合靶向治療，中位化療次數4 次。

1.2 TILs 比例計算TILs 可分為腫瘤內浸潤性淋巴細胞（iTILs）和腫瘤間質浸潤性淋巴細胞（sTILs），以及少量侵犯腫瘤邊界的浸潤性淋巴細胞（imTILs）［7］。國際TILs 評價工作組目前推薦以sTILs 應用于臨床研究工作［8］。利用HE 染色方法對新輔助化療前穿刺的癌組織標本進行染色，200 高倍鏡視野下計算出腫瘤癌巢內及間質中含TILs 的面積與腫瘤總面積的百分比，取其均值定義為TILs 比例。并根據比例大小分為低、中、高三組，TILs 比例≤5%為低比例組，TILs 比例在6%～49%為中比例組，TILs 比例≥50%為高比例組。

1.3 新輔助化療療效評價標準根據日本乳腺癌協會分類評估系統（2007年）評估術后大體標本的新輔助化療療效。根據組織學改變將化療反應分為0 級、Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級共4 個等級。0 級：無效應，癌細胞在治療后幾乎無變化；Ⅰ級：輕微反應，癌組織有變化但占總面積的2/3 以下；Ⅱ級：明顯反應，癌組織有明顯變化達到或超過總面積的2/3，但仍有明確癌細胞殘留；Ⅲ級：完全反應，所有癌組織壞死或消失、被肉芽組織或纖維組織替代，或僅殘留少量導管內癌成分。病理療效評估由兩位高年資病理醫(yī)師共同閱片完成。

1.4 統計學方法應用SPSS 23.0 軟件進行統計學分析。計數資料采用χ2檢驗或Fisher′s 確切概率法。多因素分析采用有序多分類logistic 回歸。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 新輔助治療的療效56 例乳腺癌患者中有15例患者NAC同時聯合曲妥珠單抗靶向治療，NAC方案均含蒽環(huán)類和/或紫杉類藥物，所有患者在完成2 ～6 個療程治療后行手術治療。術后根據大體標本中腫瘤組織的化療反應進行療效評價，結果顯示NAC 的總體有效率為76.8%（43/56），有13 例患者化療反應為0 級，提示NAC 無效；24 例患者化療反應為Ⅰ級，占比42.9%；12 例患者化療反應為Ⅱ級，占比21.4%；7 例患者化療反應為Ⅲ級，占比12.5%。

2.2 各臨床病理因素與乳腺癌新輔助化療療效的相關性本研究顯示，患者行新輔助治療前的臨床分期、腋窩淋巴結以及ER、PR、HER-2 狀態(tài)、Ki-67 指數與化療反應無明顯相關性（P＞0.05）。術后病理學評估顯示TILs 高比例組的癌組織化療反應達到Ⅱ級或Ⅲ級的比例要高于TILs 低比例組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。提示較高的TILs 比例與乳腺癌NAC 的療效相關，可以預測乳腺癌新輔助化療療效，這與既往研究［9-12］一致。圖1 為HE 染色方法檢測的癌組織中具有代表性的化療反應為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級和TILs 低、中、高比例的圖片。

圖1 HE 染色方法檢測的腫瘤組織中TILs 低、中、高比例及化療反應Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級鏡下表現（×200）Fig.1 Ⅰ，Ⅱ，and Ⅲgrades of responses to chemotherapy and Low-，intermediate-，and high-fraction of TILs were detected in breast tumors by using hematoxylin and eosin staining（×200）

表1 56 例乳腺癌患者的臨床病理因素與新輔助化療療效的關系Tab.1 Relationship between clinicopathological factors and response to chemotherapy in 56 patients with breast cancer

2.3 乳腺癌的分子亞型與TILs 比例的關系本研究入組了56 例患者，3 例患者免疫組化HER-2（2+）未行cerbB2 基因FISH 檢測，未行分子分型也未行靶向治療。53 例患者中分子亞型為Luminal型17 例，HER-2 陽性20 例，三陰性16 例。結果發(fā)現，13 例新輔助化療無效的患者以Luminal 型和HER-2 陽性為主，TNBC 患者腫瘤組織中的TILs 比例明顯高于Luminal 型及HER-2 陽性乳腺癌（P＜0.05），見表2。故推測無論何種類型乳腺癌，TILs比例與NAC 療效相關，在TNBC 中更為明顯，TILs有可能成為TNBC 免疫治療的一個潛在靶點，這也與研究［13］一致。

表2 53例乳腺癌分子亞型與穿刺標本中TILs比例的關系Tab.2 Relationship between TILs levels and molecular subtypes in 53 patients with breast cancer

2.4 新輔助化療療效的多因素分析Logistic 回歸分析結果顯示，年齡、ER、PR 及HER-2 狀態(tài)、Ki-67 指數與化療反應無明顯相關性。相較于低比例組，TILs 高比例為化療反應一個獨立的預測因子（OR= 0.04，95%CI：0.007 ～0.230；P＜0.05），見表3。

表3 各臨床病理因素與新輔助化療療效的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis of predictive factors for the response to chemotherapy

3 討論

NAC 在乳腺癌綜合治療中占重要地位，現已廣泛應用于臨床，其不僅能使局部晚期患者達到可手術標準、使初診不能保乳患者獲得保乳的機會，還能預知腫瘤對化療藥物的敏感性，指導臨床化療藥物的選擇。盡管現有證據顯示NAC 總體上并不改善患者的預后［14］，但患者治療后如能達到病理學完全緩解（pCR），提示預后可能改善［15］。目前臨床尚缺乏合適的分子標志物來準確評估個體NAC 的療效。TILs 作為可以量化測量的敏感生物標志物，可行性和再現性高，可較好地應用于NAC 中。

1992年，AALTOMAA 等［16］發(fā)現乳腺癌原發(fā)病灶內淋巴細胞的浸潤預示著較好的預后。隨著腫瘤免疫學的發(fā)展，BIG2-98、ECOG2197 試驗等多項研究［17-19］均論證了TILs 在早期乳腺癌中的預后價值。2016年圣安東尼奧乳腺癌大會上的一項針對3 771 例乳腺癌NAC 患者的Meta 分析顯示，對于乳腺癌所有的分子亞型，TILs 都是pCR 強有力的預測標志，TILs 比例越高，pCR 率越高，在TNBC中這種高pCR 率可以延長患者DFS，轉為生存獲益。隨著對TILs 研究［10-12，20］的深入，專家們認為，在Her-2 陽性和TNBC 乳腺癌NAC 中TILs 能提高pCR 率，且與預后（EFS、DFS、OS）密切相關。而在ER 陽性和HER-2 陰性乳腺癌中，TILs 的預后和預測作用仍有爭議［21-22］。目前國內相關研究仍不多，且多為回顧性，也少有研究對所有患者的分子分型進一步亞組分析。本研究為前瞻性研究，研究結果發(fā)現較高的TILs 比例可以預測乳腺癌新輔助化療的療效，基于分子分型的亞組分析顯示TNBC患者腫瘤組織中的TILs 比例明顯高于Luminal 型及HER-2 陽性乳腺癌患者。TNBC 相較于其他亞型缺乏明確的分子靶標，且其惡性程度高、侵襲性強、復發(fā)率高，治療效果常常不理想，臨床實踐中治療選擇甚少［23］。據本研究推測，TILs 有望成為TNBC 免疫治療的一個潛在靶點。多因素分析結果顯示，患者的化療反應與較高的TILs 比例明確相關，而與年齡、ER、PR 及HER-2 狀態(tài)、Ki-67 指數無相關，提示TILs 比例是乳腺癌NAC 療效的獨立預測因子。由于研究條件及隨訪時間有限，納入的病例數較少，且不同患者NAC 藥物及療程有所差異，也會導致結果存在一定的偏倚。另外，相關研究［24-25］表明，TILs 分布的異質性、TILs 在腫瘤中的空間結構、以及不同的TILs 亞群都會影響TILs在抗腫瘤免疫中的作用。本研究未能篩選出TILs亞群進一步分析，也會影響研究結果。

今后將會擴大樣本量，延長隨訪時間，完善TILs 的評估機制，引用最新數字病理學技術來代替人工量化，使TILs的評估方法更準確、更客觀；進一步細化研究工作，希望通過對針對不同TILs 亞群分層研究進一步深入了解，將其納入風險預測模型，以期在不久的將來應用于常規(guī)臨床實踐，指導輔助化療決策，更準確地預測在新輔助環(huán)境中實現pCR 的機會，指導臨床為患者實施精準個體化治療，改善患者遠期預后。