結直腸腺癌差分化細胞群中EZH2、β-catenin蛋白的表達及其臨床意義

張 果，楊迷玲，徐憲偉，徐小艷，楊金花

結直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[1]，差分化細胞群(pooly differentied cluster, PDC)是指腫瘤內或腫瘤浸潤前沿間質中由5個或5個以上腫瘤細胞組成，且無腺腔形成的細胞群[2]。楊璐璐等[3]研究發(fā)現識別和評估結直腸腺癌中PDC分級，可以更好地預測結直腸腺癌的生物學行為，從而更加準確地指導結直腸癌的治療和預后評估。Zeste增強子同源物2(enhancer of Zeste homllog 2, EZH2)參與細胞增殖、侵襲和轉移[4]。β-catenin是一種跨膜性多功能蛋白，其表達異常與腫瘤的侵襲轉移相關[5]。研究表明[6]敲除β-catenin，可以降低EZH2的蛋白水平。PDC是一種預測結直腸腺癌侵襲性行為的組織學形態(tài)[3]。目前，尚未見EZH2和β-catenin在結直腸腺癌PDC中表達的相關報道。本文采用免疫組化法檢測β-catenin和EZH2在結直腸腺癌PDC中的表達，分析兩者在結直腸腺癌PDC中的臨床病理學特征及其相關性，為結直腸癌發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉移提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2014年1月～2019年5月河南中醫(yī)藥大學人民醫(yī)院(鄭州人民醫(yī)院)行根治性結直腸腺癌切除術標本，其中105例具有PDC的結直腸腺癌，患者年齡30～81歲，中位年齡55歲，所有患者術前均未接受任何抗腫瘤治療及靶向治療。另取癌旁正常組織(距腫瘤約5 cm的正常結直腸組織)作為對照組，并由兩位高年資病理醫(yī)師查閱HE切片，評估PDC和相關病理學特征。根據WHO(2010)消化系統(tǒng)腫瘤分類標準明確診斷及復核，所有病例臨床病理資料均完整。

1.2 試劑與方法標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，行常規(guī)HE染色和免疫組化染色。鼠抗人單克隆抗體β-catenin(MXO43)購自福州邁新公司，EZH2購自北京中杉金橋公司。免疫組化通用型EnVision兩步法試劑盒及DAB顯色劑，均購自福州邁新公司，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。用已知β-catenin和EZH2陽性的結直腸腺癌和PBS分別代替一抗作為陽性和陰性對照。

1.3 結果判定β-catenin可定位于細胞膜、細胞質及細胞核，在正常結直腸黏膜組織中呈細胞膜表達，在結直腸腺癌非PDC中為細胞膜及細胞質表達，在PDC中為細胞質及細胞核的易位表達。本實驗主要觀察結直腸腺癌PDC中β-catenin的核易位表達，參考金雯等[7]的判讀標準；若β-catenin≤50%細胞核陽性判定為低表達，>50%細胞核陽性判定為高表達。

EZH2以細胞核出現彌漫均質的淡黃色至棕褐色顆粒為陽性，每張切片隨機選取5個高倍視野觀察，采用半定量評分標準判斷[8]。(1)按細胞染色強度計分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按陽性細胞百分比計分：無陽性細胞為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項得分結果相乘：0～4分為低表達組，6～12分為高表達組。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，分類數據的比較采用χ2檢驗，相關性分析應用Spearman等級相關檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同結直腸組織中EZH2、β-catenin蛋白的表達105例結直腸腺癌PDC中，EZH2蛋白低表達25例(圖1)，高表達80例(圖2)，高表達率為76%，顯著高于癌旁正常組織及結直腸腺癌非PDC，三者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但EZH2在結直腸腺癌PDC及非PDC中表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。β-catenin蛋白核低表達65例(圖3)，核高表達40例(圖4)，核陽性率為38%，顯著高于結直腸腺癌非PDC及癌旁正常組織，三者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)，結直腸腺癌非PDC中β-catenin表達模式為細胞膜及細胞質陽性(圖5、6)。

圖1 EZH2在結直腸腺癌PDC中呈核低表達，EnVision兩步法 圖2 EZH2在結直腸腺癌PDC中呈核高表達，EnVision兩步法 圖3 β-catenin在結直腸腺癌PDC中呈核低表達，EnVision兩步法 圖4 β-catenin在結直腸腺癌PDC中呈核高表達，EnVision兩步法 圖5 β-catenin在結直腸腺癌非PDC中呈胞膜表達，EnVision兩步法 圖6 β-catenin在結直腸腺癌非PDC中呈胞質表達，EnVision兩步法

表1 結直腸腺癌PDC、非PDC及正常黏膜組織中β-catenin和EZH2蛋白的表達

2.2 結直腸腺癌PDC中EZH2、β-catenin表達與臨床病理特征的關系EZH2、β-catenin蛋白核表達與結直腸腺癌PDC中淋巴結轉移、pTNM及脈管侵犯相關(P<0.05)；兩者與患者年齡、性別、腫瘤直徑、病變部位、分化程度及浸潤深度均無關(P>0.05，表2)。

表2 結直腸腺癌PDC中EZH2、β-catenin表達與臨床病理特征的關系

2.3 結直腸腺癌PDC中EZH2及β-catenin蛋白表達的相關性結直腸腺癌PDC中，β-catenin和EZH2同時高表達44例，同時低表達21例。經Spearman等級相關檢驗，β-catenin和EZH2在結直腸腺癌PDC中的表達呈正相關(rs=0.254，P<0.05，表3)。

表3 結直腸腺癌PDC中EZH2、β-catenin蛋白表達的相關性

3 討論

PDC是結直腸腺癌具有侵襲性的組織學特征，同時也是表觀遺傳學和多條信號通路相互作用的結果。EZH2是表觀遺傳調控因子，在細胞增殖、周期調節(jié)及胚胎發(fā)育中起重要作用。Roh等[9]研究發(fā)現EZH2過表達與子宮內膜癌患者的生存率有關，EZH2沉默降低腫瘤細胞的壽命、侵襲力并促進腫瘤細胞凋亡。Luo等[10]報道EZH2通過H3K27met3抑制E-cadherin在喉鱗狀細胞癌中的表達，并參與調控上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)程序，在腫瘤侵襲和轉移過程中發(fā)揮重要作用。本組105例結直腸腺癌PDC中EZH2蛋白的高表達率明顯高于癌旁正常組織及結直腸腺癌非PDC(P<0.05)，EZH2蛋白的上調表達與淋巴結轉移、pTNM分期相關，EZH2蛋白在淋巴結轉移組陽性率明顯高于無淋巴結轉移組，提示EZH2蛋白參與結直腸腺癌PDC的侵襲轉移；臨床研究證實EZH2蛋白在多種腫瘤中高表達，且與腫瘤的侵襲性和不良預后密切相關[9]。

β-catenin是經典Wnt/β-catenin信號通路的核心因子，作為細胞骨架蛋白，在細胞中具有重要作用。β-catenin可以結合到細胞-細胞黏附受體的胞內結構區(qū)，如E-cadherin，鄰近細胞的E-cadherin分子可以互相連接形成黏附，有助于保障上皮層完整、阻止癌細胞轉移的細胞間接觸。細胞膜中E-cadherin的缺失釋放β-catenin分子，進而使其在胞質中積累。在Wnt信號的作用下，β-catenin從胞質轉位到胞核，并與TCF/LEF和其他轉錄因子結合，從而誘導EMT和相關基因的表達[11]。Kim等[12]研究發(fā)現β-catenin激活通過改變細胞-細胞連接誘導EMT進展，從而促進結腸癌的侵襲及轉移。在胃癌的發(fā)生過程中，β-catenin起重要作用，其不同表達定位與胃癌的進展有關[13]。本組β-catenin在癌旁正常結直腸黏膜中呈連續(xù)的膜表達，而在結直腸腺癌非PDC及PDC中的表達模式不同，在非PDC中β-catenin陽性主要定位于胞膜并彌散分布于胞質，而腫瘤侵襲前沿的細胞及PDC表現為胞核強陽性。β-catenin的核表達與結直腸腺癌的淋巴結轉移、pTNM分期相關，提示β-catenin參與結直腸腺癌EMT的形成，從而促進PDC的侵襲、轉移。

相關性分析結果顯示，結直腸腺癌PDC中EZH2蛋白表達和β-catenin蛋白核表達之間存在相關性，Sen等[6]研究發(fā)現β-catenin蛋白的敲除可以降低成骨位點EZH2蛋白水平。Ma等[14]研究發(fā)現在腫瘤發(fā)生過程中，β-catenin信號途徑在穩(wěn)定EZH2并控制EZH2介導基因表達方面發(fā)揮關鍵作用，與本實驗結果一致。

目前，國內外尚未對EZH2和β-catenin在結腸腺癌PDC中相關性的報道，本組發(fā)現EZH2高表達與β-catenin蛋白核表達呈正相關，兩者均與腫瘤淋巴結轉移、pTNM分期相關，提示β-catenin和EZH2蛋白在結直腸腺癌PDC淋巴結轉移中可能存在某種聯(lián)系，我們推測EZH2可能激活Wnt/β-catenin信號，導致β-catenin移位核表達，促進EMT的形成，達到浸潤轉移的目的。本組結果顯示，結直腸腺癌PDC中β-catenin蛋白核的高表達，更能促進結直腸腺癌的浸潤、轉移，提示EZH2和β-catenin可作為結直腸腺癌患者不良預后的標志物。