食管鱗狀細(xì)胞癌腫瘤間質(zhì)成熟度的臨床病理學(xué)意義及與PD-L1表達(dá)的相關(guān)性

李志文，鄭 重，張 前，陳潔宇，余慧萍，吳鴻雁，樊祥山，黃文斌

中國是食管癌高發(fā)地區(qū)，以鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell cancer, ESCC)為主要類型[1]。晚期ESCC患者對(duì)放、化療不敏感，其療效不佳，5年總生存率(overall survival, OS)僅為15%～20%。因此，闡明食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找潛在的治療靶點(diǎn)有助于提高患者的生存期。新近研究顯示腫瘤微環(huán)境中的間質(zhì)細(xì)胞在上皮性腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后中具有重要作用[2-4]。腫瘤間質(zhì)成熟度(tumor stromal maturity, TSM)是根據(jù)腫瘤間質(zhì)中膠原纖維的形態(tài)與排列及黏液樣改變?yōu)榛A(chǔ)的評(píng)價(jià)體系，其在結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌中與腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān)[5-8]，但在ESCC中TSM與臨床病理學(xué)特征和預(yù)后的相關(guān)性尚未見報(bào)道。免疫治療是當(dāng)前惡性腫瘤研究的熱點(diǎn)，晚期ESCC中PD-L1表達(dá)已經(jīng)作為預(yù)測性生物學(xué)標(biāo)志物用于臨床實(shí)踐[9]，但PD-L1在ESCC中表達(dá)的臨床意義尚存爭議。本文通過分析ESCC中TSM與臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系以及與PD-L1表達(dá)的相關(guān)性，探討ESCC中TSM的臨床病理學(xué)意義及其作為免疫治療療效預(yù)測組織學(xué)特征的潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年9月～2019年8月南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院(南京鼓樓醫(yī)院)病理科診斷為ESCC的手術(shù)切除標(biāo)本合計(jì)140例，通過電話及門診/住院電子病歷系統(tǒng)收集病理資料，剔除資料不全及術(shù)前行輔助治療等患者，最終收集129例ESCC。由兩名高年資病理醫(yī)師對(duì)HE切片進(jìn)行重新評(píng)估，判斷其分化程度、浸潤深度、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等指標(biāo)。根據(jù)AJCC(第8版)指南，將病例分為Ⅰ～Ⅳ期，其他臨床資料來自臨床病歷系統(tǒng)。OS和無進(jìn)展生存率(progression free survival, PFS)是患者接受手術(shù)日至隨訪截止時(shí)間(2020年12月1日)或患者死亡時(shí)間。

129例ESCC中，男性105例，女性24例，平均年齡65歲(48～86歲)；腫瘤最大徑平均3.5 cm(1.3～10.5 cm)。組織學(xué)分化：高分化44例，中分化38例，低分化47例。脈管侵犯者42例，神經(jīng)侵犯者61例。浸潤深度：pT1+pT2者57例，pT3+pT4者72例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者59例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者70例。AJCC TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期69例，Ⅲ+Ⅳ期60例。隨訪：死亡31例，生存98例，OS為75.9%，PFS為62.7%。

1.2 TSM結(jié)果判讀TSM分類標(biāo)準(zhǔn)參考相關(guān)文獻(xiàn)分為成熟型、中間型和未成熟型[5-7]。由兩名高年資病理醫(yī)師對(duì)所有腫瘤切片進(jìn)行TSM評(píng)估，判讀結(jié)果不一致者則在多頭顯微鏡下進(jìn)行會(huì)診，得出判讀結(jié)果。

1.3 免疫組化染色及結(jié)果判讀復(fù)習(xí)所有病例的HE切片，挑選具有腫瘤代表性區(qū)域的蠟塊行免疫組化EnVision法染色。一抗PD-L1單克隆鼠抗人(克隆號(hào)22C3)及二抗均購自Dako公司，并在Dako全自動(dòng)免疫組化儀Link48上進(jìn)行染色，所有切片均設(shè)陰、陽性對(duì)照，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。染色結(jié)果采用聯(lián)合陽性評(píng)分(combined positive score, CPS)，即任意強(qiáng)度膜染色的腫瘤細(xì)胞和與腫瘤細(xì)胞直接關(guān)聯(lián)的膜/胞質(zhì)染色的淋巴/巨噬細(xì)胞，與存活腫瘤細(xì)胞的比例乘以100。以CPS≥10定義為PD-L1陽性，CPS< 10為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，TSM分型與ESCC臨床病理學(xué)特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，ESCC中TSM及PD-L1表達(dá)的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析，TSM、PD-L1表達(dá)與ESCC患者預(yù)后的相關(guān)性采用Kaplan-Meier法分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSM與ESCC臨床病理學(xué)特征的關(guān)系成熟型間質(zhì)表現(xiàn)為纖細(xì)的膠原纖維呈分層狀、規(guī)則性排列，不含任何黏液基質(zhì)或瘢痕疙瘩樣膠原纖維；中間型間質(zhì)表現(xiàn)為當(dāng)瘢痕疙瘩樣膠原混雜在成熟間質(zhì)中時(shí)，通常與成熟膠原纖維方向平行；未成熟型間質(zhì)有兩種形態(tài)學(xué)：(1)厚的少細(xì)胞的膠原束混雜排列伴有較多的“瘢痕疙瘩”樣間質(zhì)，(2)肥胖型的纖維母細(xì)胞散亂排列伴明顯的黏液樣基質(zhì)(圖1～4)。129例ESCC中，腫瘤間質(zhì)成熟型33例，中間型36例，未成熟型60例。TSM類型與ESCC患者性別(P=0.020)、腫瘤浸潤深度(P=0.008)、神經(jīng)侵犯(P=0.005)、脈管侵犯(P<0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.014)和TNM分期(P=0.008)均有相關(guān)性。腫瘤間質(zhì)未成熟型患者，更易出現(xiàn)神經(jīng)及脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，pTNM分期更高；TSM與ESCC患者年齡、腫瘤大小和分化程度無明顯相關(guān)性(P>0.05，表1)。

圖1 成熟型間質(zhì)：腫瘤間質(zhì)由多層狀排列纖細(xì)的纖維細(xì)胞組成 圖2 中間型間質(zhì)：腫瘤間質(zhì)由“瘢痕疙瘩”樣膠原纖維與成熟型間質(zhì)混合組成 圖3 未成熟型間質(zhì)：肥胖型纖維母細(xì)胞散亂排列伴明顯黏液樣基質(zhì) 圖4 未成熟型間質(zhì)：腫瘤間質(zhì)完全由“瘢痕疙瘩”樣膠原纖維組成 圖5 PD-L1在腫瘤細(xì)胞胞膜中呈陽性，EnVision法 圖6 PD-L1在腫瘤細(xì)胞胞膜和腫瘤周圍免疫細(xì)胞胞膜/胞質(zhì)中呈陽性，EnVision法

2.2 ESCC中PD-L1表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系PD-L1陽性定位于腫瘤細(xì)胞胞膜或其周圍免疫細(xì)胞的胞膜或胞質(zhì)(圖5、6)。129例ESCC中，PD-L1陽性者52例，陰性者77例，ESCC中PD-L1在pTNM分期Ⅲ+Ⅳ期中的陽性率高于Ⅰ+Ⅱ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)；PD-L1表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均無相關(guān)性(P>0.05，表1)。

表1 食管鱗狀細(xì)胞癌中TSM、PD-L1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 ESCC中TSM與PD-L1表達(dá)的相關(guān)性TSM成熟型ESCC中，PD-L1陽性率為48.5%(16/33)，中間型PD-L1陽性率為52.8%(19/36)，而未成熟型PD-L1的陽性率僅為28.3%(17/60)。相關(guān)性分析顯示，隨著ESCC中TSM由未成熟到成熟轉(zhuǎn)變，PD-L1表達(dá)也逐漸增高，ESCC中TSM與PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.200，P=0.024，表2)。

表2 食管鱗狀細(xì)胞癌中TSM與PD-L1表達(dá)的相關(guān)性

2.4 TSM、PD-L1表達(dá)與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存分析顯示TSM未成熟型患者平均OS為(20.86±0.83)個(gè)月，略低于中間型患者(22.39±1.26)個(gè)月和成熟型患者(22.87±0.97)個(gè)月，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.096，圖7A)。但TSM未成熟型患者平均PFS為(16.21±1.09)個(gè)月，明顯低于中間型患者(19.97±1.57)個(gè)月和成熟型患者(21.09±1.16)個(gè)月(P=0.019，圖7B)。同時(shí)Kaplan-Meier生存分析顯示PD-L1表達(dá)與患者OS及PFS均無相關(guān)性(P>0.05，圖8)。

圖7 食管鱗狀細(xì)胞癌中TSM與患者總生存率(A)及無進(jìn)展生存率(B)的關(guān)系

圖8 PD-L1表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌患者總生存率(A)及無進(jìn)展生存率(B)的關(guān)系

3 討論

食管癌是我國消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率均較高。近年隨著治療手段的不斷發(fā)展，我國食管癌的5年生存率從20.9%升高到30.3%，但OS仍然較低[10]。因此，探討食管癌預(yù)后相關(guān)的因素及其潛在的治療手段具有重要意義。目前，ESCC患者治療方案的選擇和臨床預(yù)后的評(píng)價(jià)主要依據(jù)腫瘤細(xì)胞本身的特點(diǎn)，如腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)狀態(tài)、病理分期等，但分期相似的ESCC患者對(duì)治療的反應(yīng)及預(yù)后可能有較大差異。近年腫瘤生物學(xué)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，癌癥相關(guān)性纖維母細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境內(nèi)促纖維腫瘤間質(zhì)的一個(gè)重要功能，其能夠分泌一些信號(hào)分子直接促進(jìn)腫瘤生長，分泌蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，提高腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[11]。此外，癌癥相關(guān)性纖維母細(xì)胞也能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[12]。

TSM最早由Ueno等[13]提出，根據(jù)“瘢痕疙瘩樣”膠原纖維和黏液樣基質(zhì)將癌性間質(zhì)分為成熟型、中間型和未成熟型3類，結(jié)果顯示成熟型間質(zhì)隨著Dukes分期增高而降低。相反，未成熟型間質(zhì)則升高，間質(zhì)類型與直腸癌患者的5年OS明顯相關(guān)[14]。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，間質(zhì)未成熟型直腸癌患者的5年OS不僅低于間質(zhì)成熟型，而且間質(zhì)未成熟型直腸癌患者的腫瘤細(xì)胞出芽評(píng)分、神經(jīng)及脈管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率均高于成熟型患者，提示未成熟型間質(zhì)與直腸癌不良的生物學(xué)行為和預(yù)后密切相關(guān)。在結(jié)直腸癌研究中，Uneo等研究結(jié)果顯示促纖維間質(zhì)的類型明顯與腫瘤部位、pT和pN分期、腫瘤分化、靜脈侵犯、腫瘤出芽和克隆樣淋巴結(jié)反應(yīng)相關(guān)，未成熟型間質(zhì)與肝、肺、淋巴結(jié)、腹膜和局部區(qū)域高復(fù)發(fā)率有關(guān)，5年P(guān)FS在成熟型間質(zhì)組高于未成熟型間質(zhì)組[15]。Ueno等[16]對(duì)412例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶行肝臟切除術(shù)的患者分析發(fā)現(xiàn)，未成熟型間質(zhì)與較高的T和N分期、較高的原發(fā)腫瘤分級(jí)、較大的肝轉(zhuǎn)移灶和肝外疾病有關(guān)，肝切除后5年OS在成熟型間質(zhì)組最高，其次為中間型間質(zhì)組，未成熟型間質(zhì)組最低。Ao等[17]對(duì)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的促纖維間質(zhì)反應(yīng)進(jìn)行分類，分析顯示肝切除后的5年OS和PFS在成熟/中間型間質(zhì)組的生存率均顯著高于未成熟間質(zhì)組。TSM在胃癌、乳腺癌和胰腺癌中的研究也與之相似[6-8]。這表明腫瘤間質(zhì)內(nèi)促纖維間質(zhì)不僅影響腫瘤細(xì)胞的臨床生物學(xué)行為，而且間質(zhì)成熟程度對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為具有不同影響，TSM對(duì)腫瘤預(yù)后評(píng)估具有較好的預(yù)測作用。

本文分析ESCC中TSM與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示TSM類型與ESCC患者性別、浸潤深度、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期均有相關(guān)性。腫瘤間質(zhì)未成熟型ESCC表現(xiàn)出更高的神經(jīng)及脈管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤分期也更高。生存分析顯示：腫瘤間質(zhì)未成熟型患者的平均OS略低于中間型和成熟型患者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；未成熟型患者的平均PFS明顯低于中間型和成熟型患者。這些結(jié)果提示TSM可以影響ESCC的臨床生物學(xué)行為和患者預(yù)后，因此評(píng)估ESCC中TSM可進(jìn)一步預(yù)測ESCC的臨床生物學(xué)行為和患者預(yù)后，有助于臨床選擇治療方案。本實(shí)驗(yàn)尚存在局限和不足，如納入病例數(shù)較少、患者隨訪時(shí)間較短、TSM判讀可能具有一定的主觀性等，這些可能會(huì)導(dǎo)致分析結(jié)果發(fā)生偏倚。本組將在后續(xù)的研究中增加病例數(shù)和延長患者隨訪時(shí)間，進(jìn)一步探討ESCC中TSM的臨床意義。

PD-1及其配體PD-L1的信號(hào)通路在腫瘤免疫逃逸機(jī)制中起重要作用，也是PD-1/PD-L1通路的免疫治療研究熱點(diǎn)[18]。目前，針對(duì)PD-1的免疫檢查點(diǎn)抑制劑在晚期食管癌中已見初步療效[7]，并且FDA已批準(zhǔn)其作為PD-L1陽性(CPS≥10)局部晚期食管癌的二線或多線治療方案。PD-L1在食管癌中的表達(dá)與患者臨床預(yù)后的關(guān)系還存在爭議[19]，可能與PD-L1抗體克隆號(hào)的不同以及結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)的差異有關(guān)。本組采用FDA推薦的PD-L1(22C3)抗體，并按CPS評(píng)分對(duì)ESCC進(jìn)行PD-L1結(jié)果判讀，結(jié)果顯示PD-L1表達(dá)與患者TNM分期具有相關(guān)性，PD-L1陽性患者分期相對(duì)較高；與腫瘤浸潤深度、神經(jīng)及脈管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無明顯相關(guān)性。同時(shí)，PD-L1表達(dá)與患者的預(yù)后無明顯相關(guān)性。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，腫瘤微環(huán)境中各成分相互作用有重要意義[20]。腫瘤間質(zhì)是否影響PD-L1表達(dá)尚不清楚。Mu等[21]發(fā)現(xiàn)在胃癌中間質(zhì)成纖維細(xì)胞密度與腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)。Zhai等[7]發(fā)現(xiàn)乳腺癌中PD-L1在成熟型纖維性間質(zhì)陽性率最高。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腫瘤間質(zhì)越成熟，PD-L1陽性率越高，與乳腺癌的研究類似，表明腫瘤間質(zhì)可能對(duì)ESCC中PD-L1表達(dá)具有一定的影響，但其作用機(jī)制還需深入探討。

總之，TSM與ESCC的臨床病理學(xué)特征及預(yù)后密切相關(guān)，間質(zhì)未成熟型患者具有更差的生物學(xué)行為和臨床預(yù)后。ESCC中TSM與PD-L1的表達(dá)呈正相關(guān)，腫瘤內(nèi)間質(zhì)越成熟，PD-L1陽性率越高，提示評(píng)估ESCC中TSM可能預(yù)測患者的免疫治療療效。目前，對(duì)于TSM的研究僅停留在常規(guī)分類上，不同成熟類型的細(xì)胞組成及相關(guān)機(jī)制和潛在的治療手段尚不清楚，有待進(jìn)一步分析。