5種藥劑對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)孵化及2齡幼蟲(chóng)室內(nèi)毒力的影響

姜偉，張海英，李金鴻，連蕓蕓，吳錦 ，劉永剛 ，李惠霞

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，甘肅省無(wú)公害農(nóng)藥工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

大豆孢囊線蟲(chóng)病(soybean cyst nematode，SCN)是由大豆孢囊線蟲(chóng)(HeteroderaglycinesIchinohe)引起的植物內(nèi)寄生性線蟲(chóng)病害，具有分布廣、寄主范圍寬、孢囊存活時(shí)間長(zhǎng)及危害嚴(yán)重等特點(diǎn)[1].該線蟲(chóng)病害在世界各國(guó)大豆主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，每年可造成高達(dá)30億美元的經(jīng)濟(jì)損失[2].在我國(guó)，黑龍江、內(nèi)蒙古、北京、江蘇、安徽、山西、山東、甘肅等20多個(gè)省相繼報(bào)道了該病害的發(fā)生和危害[3-4]，在東北和黃淮海大豆產(chǎn)區(qū)發(fā)生尤為嚴(yán)重，一般可造成30%以上減產(chǎn)，嚴(yán)重地塊甚至絕收[5].甘肅省大豆年播種面積約為11.5萬(wàn)hm2，產(chǎn)區(qū)主要分布在隴東南.羅寧等[6]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，甘肅省大豆孢囊線蟲(chóng)發(fā)生比較普遍，主產(chǎn)區(qū)孢囊檢出率為63.7%～87.2%，且線蟲(chóng)基數(shù)較高，平均孢囊數(shù)為1.2～11.4個(gè)/100 g土，對(duì)甘肅省大豆產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅.

植物寄生線蟲(chóng)，尤其是孢囊線蟲(chóng)具有很強(qiáng)的繁殖能力與環(huán)境適應(yīng)性，而生產(chǎn)中對(duì)于孢囊線蟲(chóng)的防治主要以抗病育種為主，在缺乏有效抗源材料的背景下，化學(xué)藥劑仍然是目前防治大豆孢囊線蟲(chóng)的重要手段.傳統(tǒng)的廣譜性殺線劑如涕滅威、克百威、滅線磷和甲基異柳磷等因?yàn)楦叨?、高殘留，造成?yán)重的“3R”問(wèn)題，已被禁用或限用[7-8].當(dāng)前市場(chǎng)上非常缺乏防治大豆孢囊線蟲(chóng)的專用殺線劑.因此，研制和篩選高效、安全、低毒的殺線劑防控大豆孢囊線蟲(chóng)，顯得尤為迫切.二硫氰基甲烷是一種具有強(qiáng)烈殺菌殺線蟲(chóng)活性的有機(jī)硫氰化合物，對(duì)多種病原真菌、細(xì)菌具有很好的生物學(xué)活性，但對(duì)于其殺線活性研究較少.本研究以大豆孢囊線蟲(chóng)為試驗(yàn)材料，測(cè)定了二硫氰基甲烷和4種常用藥劑對(duì)孵化、2齡幼蟲(chóng)的毒力、運(yùn)動(dòng)行為和形態(tài)的影響，以期為新型殺線劑的開(kāi)發(fā)和利用提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試蟲(chóng)源 供試線蟲(chóng)采自甘肅省平?jīng)鍪袥艽h大豆孢囊線蟲(chóng)發(fā)生較嚴(yán)重地塊.將采集的病土帶回實(shí)驗(yàn)室，采用漂浮法分離孢囊，并在體視顯微鏡下挑取飽滿的新鮮孢囊，于4 ℃保存?zhèn)溆?

1.1.2 供試藥劑 1.8%阿維菌素乳油，河北全德倫生化科技有限公司生產(chǎn)；20%噻蟲(chóng)胺懸浮劑，江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；20%噻唑膦水乳劑，山東大農(nóng)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；40%辛硫磷乳油，山東埃森化學(xué)有限公司生產(chǎn)；98%二硫氰基甲烷原藥，甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)懸浮液制備 2齡幼蟲(chóng)懸浮液制備：將消毒的孢囊置于滅菌的孵化池中孵化，以滅菌水為孵化液，使水稍漫過(guò)孢囊為宜.在25 ℃培養(yǎng)箱黑暗條件下進(jìn)行孵化，4 d后開(kāi)始收集2齡幼蟲(chóng)，根據(jù)試驗(yàn)需要調(diào)整2齡幼蟲(chóng)懸浮液濃度.

1.2.2 藥劑配制方法 將98%二硫氰基甲烷原藥溶于甲醇，1.8%阿維菌素乳油、20%噻蟲(chóng)胺懸浮劑、20%噻唑膦水乳劑、40%辛硫磷乳油4種藥劑溶于無(wú)菌水，然后均配制成10 000 mg/L的母液，測(cè)定時(shí)用無(wú)菌水稀釋至所需系列濃度.各藥劑質(zhì)量濃度設(shè)置依據(jù)試驗(yàn)前期藥劑質(zhì)量濃度篩選及推薦劑量.

1.2.3 5種藥劑處理對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)孵化的影響 將新鮮飽滿的孢囊消毒后，置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行藥液浸漬處理(每孔10個(gè)孢囊)，每孔藥液吸入1.5 mL，重復(fù)3次，以無(wú)菌水作為對(duì)照，并每天更換新的藥液，置于25 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵化.每3 d檢查1次，記錄2齡幼蟲(chóng)數(shù)量；7 d后用無(wú)菌水清洗3～5次，將藥液更換為無(wú)菌水，每隔3 d在顯微鏡下觀察2齡幼蟲(chóng)的孵化情況，統(tǒng)計(jì)數(shù)量，并更換新鮮孵化液.30 d后統(tǒng)計(jì)處理2齡幼蟲(chóng)孵化數(shù)量，計(jì)算孵化抑制率.

1.2.4 5種藥劑對(duì)2齡幼蟲(chóng)的毒力 在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中藥液浸漬處理線蟲(chóng)，每孔加入1 mL大豆孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)懸浮液(約100條)，然后加入1 mL不同質(zhì)量濃度的藥液.以無(wú)菌水作為對(duì)照，每質(zhì)量濃度重復(fù)3次，于25 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng).處理后24 h、48 h在體視顯微鏡下統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)存活情況，計(jì)算死亡率和校正死亡率，并計(jì)算各藥劑的LC50和LC90.

1.2.5 二硫氰基甲烷與阿維菌素對(duì)2齡幼蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)行為的影響 根據(jù)毒力測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果，吸取5 mg/L二硫氰基甲烷與阿維菌素藥液各1 mL，將新鮮活躍的50條二齡幼蟲(chóng)放入培養(yǎng)板中，分別處理1、6、12、24 h后，隨機(jī)選擇10條線蟲(chóng)在體視顯微鏡下觀察1 min內(nèi)線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)情況.試驗(yàn)以無(wú)菌水作為對(duì)照，每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù).

運(yùn)動(dòng)行為測(cè)定參照Tsalik和Hobert的方法[9].線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)頻率：在1 min內(nèi)，線蟲(chóng)頭部從一側(cè)擺向另一側(cè)后再擺動(dòng)回來(lái)；線蟲(chóng)身體彎曲頻率：在1 min內(nèi)，線蟲(chóng)的部分身體相對(duì)于身體長(zhǎng)軸的改變次數(shù).

1.2.6 二硫氰基甲烷與阿維菌素對(duì)2齡幼蟲(chóng)形態(tài)的影響 分別吸取5 mg/L二硫氰基甲烷與阿維菌素藥液各1 mL于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入50條線蟲(chóng)藥液浸漬處理24 h后，各個(gè)處理隨機(jī)挑取10條線蟲(chóng)置于載玻片上，熱殺死后于顯微鏡下拍照并測(cè)量線蟲(chóng)體長(zhǎng)、體寬、口針和尾部透明區(qū)長(zhǎng)度.試驗(yàn)以無(wú)菌水作為對(duì)照，每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù).

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理及分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 5種藥劑處理對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)孵化的影響

不同質(zhì)量濃度處理后，5種藥劑均對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)的孵化表現(xiàn)出抑制作用.其中，二硫氰基甲烷對(duì)孢囊線蟲(chóng)的孵化抑制作用最強(qiáng)，且隨著藥劑質(zhì)量濃度的增大，孵化抑制作用逐漸增強(qiáng)，在2.5～10 mg/L范圍內(nèi)，孵化抑制率顯著高于其他藥劑，孵化抑制率為81.15%～96.86%.其次是阿維菌素，在高濃度下對(duì)孢囊線蟲(chóng)的抑制率與二硫氰基甲烷相當(dāng).不同質(zhì)量濃度噻唑膦對(duì)孵化的影響稍低，孵化抑制率為65.49%～79.58%.辛硫磷在低質(zhì)量濃度下抑制作用較弱，但在高質(zhì)量濃度下對(duì)孢囊內(nèi)卵孵化的抑制作用與二硫氰基甲烷和阿維菌素?zé)o顯著差異.

表1 5種藥劑處理對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)孵化的影響

2.2 5種藥劑對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的毒力

試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同藥劑處理后，大豆孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)死亡率顯著高于對(duì)照，且隨著處理時(shí)間及藥劑質(zhì)量濃度的增加，2齡幼蟲(chóng)的校正死亡率逐漸增大.其中2.5 mg/L二硫氰基甲烷藥液作用于2齡幼蟲(chóng)48 h時(shí)，校正死亡率為64.26%.阿維菌素處理48 h時(shí)，2齡幼蟲(chóng)校正死亡率為68.16%.隨著噻蟲(chóng)胺和噻唑膦處理時(shí)間延長(zhǎng)，線蟲(chóng)校正死亡率呈直線上升，但二者差異不顯著.辛硫磷處理48 h后，80 mg/L時(shí)的校正死亡率為48.97%，效果顯著低于噻蟲(chóng)胺和噻唑膦(表2).

以供試藥劑折百后的質(zhì)量濃度為自變量，處理48 h線蟲(chóng)校正死亡率為因變量，建立農(nóng)藥毒力回歸方程.結(jié)果表明，5種藥劑對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的毒力差異較大，其中阿維菌素和二硫氰基甲烷對(duì)2齡幼蟲(chóng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺線活性，顯著高于噻蟲(chóng)胺、噻唑膦及辛硫磷.阿維菌素和二硫氰基甲烷的LC50值分別為1.072 7、1.135 5 mg/L，LC90值分別為15.638 7、11.662 7 mg/L(表3).

表2 5種藥劑對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)致死作用

2.3 二硫氰基甲烷與阿維菌素對(duì)2齡幼蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)行為的影響

由圖1～2可以看出，二硫氰基甲烷和阿維菌素均對(duì)2齡幼蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)行為有顯著的影響.隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，身體彎曲與頭部擺動(dòng)頻率呈下降趨勢(shì).與對(duì)照相比，5 mg/L的二硫氰基甲烷與阿維菌素處理12 h之后，2齡幼蟲(chóng)身體彎曲頻率和頭部擺動(dòng)次數(shù)顯著下降，表明二硫氰基甲烷和阿維菌素可影響2齡幼蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)行為，從而影響其移動(dòng)和尋找寄主的能力.

表3 5種藥劑對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的毒力

圖1 二硫氰基甲烷和阿維菌素對(duì)2齡幼蟲(chóng)身體彎曲頻率的影響Figure 1 The effect of methylene bisthiocyanate and abamectin on the body bend frequency of the second-stage juveniles

2.4 二硫氰基甲烷與阿維菌素對(duì)2齡幼蟲(chóng)形態(tài)的影響

結(jié)果顯示，二硫氰基甲烷與阿維菌素處理后，與對(duì)照相比，線蟲(chóng)部分形態(tài)測(cè)量值差異顯著.表現(xiàn)為2種藥劑處理后，線蟲(chóng)體長(zhǎng)顯著縮短，體寬顯著變大，尾部透明區(qū)顯著縮短，但口針無(wú)顯著性差異.說(shuō)明二硫氰基甲烷和阿維菌素處理后，線蟲(chóng)在形態(tài)上發(fā)生了改變.

圖2 二硫氰基甲烷和阿維菌素對(duì)2齡幼蟲(chóng)頭部擺動(dòng)頻率的影響Figure 2 The effect of methylene bisthiocyanate and abamectin on the head swing frequency of the second-stage juveniles

表4 二硫氰基甲烷和阿維菌素對(duì)2齡幼蟲(chóng)形態(tài)的影響

3 討論

化學(xué)防治仍是當(dāng)前防治大豆孢囊線蟲(chóng)病的重要手段.本試驗(yàn)測(cè)試了5種藥劑對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)孵化及2齡幼蟲(chóng)的抑制作用，結(jié)果表明各藥劑均對(duì)孵化有抑制作用，對(duì)2齡幼蟲(chóng)有致死作用，其中二硫氰基甲烷和阿維菌素對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)孵化的抑制作用顯著，說(shuō)明二硫氰基甲烷和阿維菌素較其他藥劑更容易穿透孢囊殼與卵殼，這與李秀花等[10]小麥孢囊線蟲(chóng)的研究結(jié)果相似.

2齡幼蟲(chóng)是侵染寄主植物的主要蟲(chóng)態(tài)，低毒、高效的殺線劑能夠抑制2齡幼蟲(chóng)，使其中毒死亡.本試驗(yàn)中，5種藥劑對(duì)2齡幼蟲(chóng)毒力研究結(jié)果表明，二硫氰基甲烷和阿維菌素對(duì)2齡幼蟲(chóng)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的殺線活性，其中5 μg/mL二硫氰基甲烷處理48 h時(shí)，2齡幼蟲(chóng)死亡率可達(dá)80%.祁之秋等[11-12]報(bào)道了二硫氰基甲烷對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的LC50為0.72 mg/L，當(dāng)5 μg/mL的藥劑處理幼蟲(chóng)36 h，死亡率可達(dá)100%，其效果優(yōu)于本試驗(yàn)，這可能與線蟲(chóng)種類不同有關(guān).已有研究表明，二硫氰基甲烷作為種衣劑，對(duì)水稻干尖線蟲(chóng)和小麥孢囊線蟲(chóng)病的田間防效顯著，且增產(chǎn)效果明顯[13-14].本試驗(yàn)只測(cè)定了該藥劑對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)的室內(nèi)毒力，而田間防治效果還需進(jìn)一步試驗(yàn)和研究.

運(yùn)動(dòng)行為是反應(yīng)線蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)基本功能的指標(biāo)，已被廣泛應(yīng)用于一些重金屬神經(jīng)毒性的分析[15].本試驗(yàn)中，通過(guò)身體彎曲和頭部擺動(dòng)頻率，觀察二硫氰基甲烷和阿維菌素對(duì)2齡幼蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)行為的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)暴露藥劑處理24 h時(shí)，部分蟲(chóng)體雖未死亡，但與對(duì)照相比，線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)行為明顯減緩.頭部擺動(dòng)與身體彎曲頻率隨藥劑質(zhì)量濃度的增加呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明在藥劑作用下，可能損害運(yùn)動(dòng)相關(guān)神經(jīng)元，從而抑制了線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力，對(duì)其移動(dòng)和尋找寄主的能力也產(chǎn)生影響.與阿維菌素相比，二硫氰基甲烷處理后，線蟲(chóng)反應(yīng)遲鈍，運(yùn)動(dòng)功能受損嚴(yán)重，質(zhì)量濃度越高，對(duì)線蟲(chóng)毒害作用越強(qiáng).

線蟲(chóng)的體長(zhǎng)、體寬等形態(tài)測(cè)量值的變化可直接反應(yīng)其發(fā)育速度和生理狀況，是衡量線蟲(chóng)發(fā)育情況的常用指標(biāo)[16].本試驗(yàn)測(cè)試了二硫氰基甲烷和阿維菌素急性暴露條件下對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)形態(tài)測(cè)量值的變化，結(jié)果顯示，和對(duì)照相比，藥劑處理后的線蟲(chóng)體長(zhǎng)顯著減小，尾部透明區(qū)顯著變短.說(shuō)明2種藥劑可使線蟲(chóng)形態(tài)發(fā)生改變.

本試驗(yàn)所選藥劑中阿維菌素、噻唑膦已成功登記用于根結(jié)線蟲(chóng)的防治.阿維菌素作為一種神經(jīng)毒劑抗生素類農(nóng)藥，除對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)有較好的防治效果外，亦對(duì)孢囊線蟲(chóng)有作用.在本研究中，噻蟲(chóng)胺作為新煙堿類中的一種殺蟲(chóng)劑，對(duì)孢囊孵化和2齡幼蟲(chóng)毒殺均有一定影響，可與其他藥劑復(fù)配使用來(lái)防控大豆孢囊線蟲(chóng)及其他地下害蟲(chóng).噻唑膦對(duì)孢囊線蟲(chóng)殺線活性較低，這是否與線蟲(chóng)種類、藥劑劑型及當(dāng)?shù)赜盟帤v史有關(guān)需要進(jìn)一步研究.傳統(tǒng)的殺蟲(chóng)劑辛硫磷雖然對(duì)孢囊線蟲(chóng)也有一定防效，但由于殘留期太長(zhǎng)，且防效易產(chǎn)生抗藥性[17]，所以不推薦應(yīng)用于孢囊線蟲(chóng)的防治.二硫氰基甲烷作為一種揮發(fā)性、具有強(qiáng)烈殺菌、殺線蟲(chóng)活性的有機(jī)硫氰化合物，長(zhǎng)時(shí)間作用線蟲(chóng)后，能夠使蟲(chóng)體溶解和死亡.研究表明，二硫氰基甲烷作為一種新型殺線劑，對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)(MeloidogyneincongnitaChitwood)殺線活性強(qiáng)[18]，但目前對(duì)于該藥劑防治孢囊線蟲(chóng)的研究還較少，對(duì)于其分解產(chǎn)物中的活性成分及作用機(jī)理有待后續(xù)深入研究.

4 結(jié)論

本試驗(yàn)所選藥劑對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)孵化有抑制作用，對(duì)2齡幼蟲(chóng)有致死作用.其中二硫氰基甲烷作用效果最好，在質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)，孢囊內(nèi)卵孵化抑制率達(dá)90.31%，顯著高于其他藥劑.毒力試驗(yàn)結(jié)果顯示，10 mg/L的二硫氰基甲烷浸漬處理線蟲(chóng)48 h，校正死亡率為88.55%，LC50為1.135 5 mg/L，殺線活性強(qiáng)，且該藥劑影響線蟲(chóng)活動(dòng)行為，2齡幼蟲(chóng)形態(tài)發(fā)生了改變.因此，二硫氰基甲烷是一種具有防治作用的新型藥劑，有望進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用.