超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中10-羥基-2-癸烯酸

胡麗俐 黎 瑛 汪 輝 皮露露 陳先桂 蔣 莉

(長沙市食品藥品檢驗所國家酒類產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，湖南 長沙 410006)

蜂蜜是一種營養(yǎng)豐富的天然食品，其中60%～80%是人體容易吸收的葡萄糖和果糖，還含有豐富的礦物質(zhì)、維生素、氨基酸、酶等生物活性成分，具有抗菌消炎、抗氧化防衰老、抗癌增強免疫等生物功能，對骨質(zhì)疏松癥、胃腸道問題以及肝臟、心血管疾病有治療作用[1]。隨著消費者對蜂蜜需求量的增加，蜂蜜市場造假現(xiàn)象日趨嚴重，假蜂蜜不僅對人體的滋補效果較小，還容易引發(fā)肥胖、糖尿病、高血壓、脂肪肝、急慢性腎損傷等疾病，嚴重危害消費者的身體健康[2]。同時，這種不正當?shù)母偁帗p害了正規(guī)商戶的利益，擾亂了正常的市場秩序。蜂蜜造假手段多樣，常見的造假模式是以葡萄糖、果糖糖漿等為原料，添加色素、蜂蜜香精進行勾兌[3-4]。目前已建立了多種蜂蜜的鑒別檢測方法，但大多數(shù)是基于蜂蜜外源性摻假物質(zhì)成分的分析[5]，而有關(guān)其內(nèi)源性成分的分析方法較少。

10-羥基-2-癸烯酸(10-HDA)是由Butenandt從蜂王漿中分離出來，并且通過紅外光譜確定了其結(jié)構(gòu)[6]。10-HDA主要分泌于工蜂的上顎腺[7]。潘建國等[8-9]先后從蜂膠和蜂王胎中成功分離出10-HDA，平均含量分別為0.22%和0.15%?，F(xiàn)有10-HDA的檢測方法主要有高效液相色譜法[10-11]、氣相色譜法[12]、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法[13]、薄層色譜法[14]、毛細管電泳法[15-16]、分光光度法[17]和紅外光譜法[18]等。氣相色譜法需進行甲基化衍生，操作繁瑣；薄層色譜法易受試驗環(huán)境等多因素影響，方法重現(xiàn)性差。以上方法僅適用于蜂王漿及其制劑中高含量10-HDA的測定，對于含量較低的蜂蜜難以達到檢測要求。試驗擬建立10-HDA的超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜方法，并結(jié)合固相萃取技術(shù)實現(xiàn)蜂蜜中10-HDA的測定，以期為蜂蜜的真假鑒別提供一種內(nèi)源性成分分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10-羥基-2-癸烯酸(10-HDA)標準品：純度>97.5%，中國食品藥品鑒定研究院；

乙酸銨：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純，德國Merck公司；

試驗用水：超純水，美國Millipore超純水儀制備；

固相萃取柱：ProElut PLS 200 mg/6 mL，北京迪馬科技有限公司；

蜂蜜：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀：1290 Infinity Ⅱ型，美國安捷倫科技有限公司；

三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：6470型，美國安捷倫科技有限公司；

電子天平：XS205DU型，梅特勒—托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；

超聲波清洗儀：KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

固相萃取裝置：HSE-24B型，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；

氮吹儀：N-ECAP45型，美國Organomation 公司；

渦旋混合器：SK-1型，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

(1) 標準儲備液：準確稱取10-HDA標準品10.56 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 μg/mL的標準儲備液，于-20 ℃避光保存。

(2) 標準中間液：準確吸取標準儲備液1.00 mL，用甲醇稀釋并定容至100 mL，配制成1.00 μg/mL的標準中間液，于-20 ℃避光保存。

(3) 溶劑標準工作液配制：準確吸取一定體積的1.00 μg/mL的標準中間液至10 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度分別為0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80 μg/mL的標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

(4) 基質(zhì)匹配標準工作液配制：將1.3.2凈化處理后的基質(zhì)溶液氮氣吹干，分別準確吸取1.00 mL相應(yīng)濃度的標準溶液復溶，配制成質(zhì)量濃度分別為0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80 μg/mL的基質(zhì)匹配標準工作液，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品前處理

(1)提取：準確稱取1.00 g試樣置于10 mL螺旋蓋聚丙烯離心管中，加入8 mL甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=4∶6)，渦旋溶解，超聲提取10 min，用甲醇—水溶液定容至10 mL，待凈化。

(2) 凈化：準確吸取5 mL提取液，加入到預先用5 mL甲醇和5 mL水平衡的ProElut PLS 200 mg/6 mL固相萃取柱中，用5 mL水進行淋洗，棄去所有流出液，抽干固相萃取柱，再用5 mL甲醇進行洗脫，收集洗脫液，于40 ℃水浴下氮氣吹至近干，加入甲醇溶解并定容至1 mL，渦旋混勻1 min，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾，供超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3.3 前處理條件優(yōu)化 按1.3.2的方法對樣品前處理過程中的提取溶劑(V甲醇∶V水=2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2)進行優(yōu)化。

1.3.4 液相色譜條件優(yōu)化 采用Agilent ZORBAX SB C18色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm)對目標物進行分離，優(yōu)化有機相和水相溶液，通過比較峰形和響應(yīng)，選擇合適的流動相(乙腈—水、甲醇—水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨、甲醇-5 mmol/L乙酸銨)。優(yōu)化梯度洗脫程序，確定液相色譜條件。

1.3.5 質(zhì)譜條件優(yōu)化 分別在電噴霧正離子(ESI+)和電噴霧負離子(ESI-)模式下進行Scan掃描，得到對應(yīng)的質(zhì)譜總離子流圖，確定化合物的母離子。對選定的母離子進行Product ion掃描，得到二級質(zhì)譜圖，選取豐度最強的碎片離子作為定量離子，次強的碎片離子作為定性離子，分別對子離子的碰撞能進行優(yōu)化。在多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)下，優(yōu)化干燥氣溫度、干燥氣流量、霧化氣壓力、鞘氣溫度、鞘氣流量、毛細管電壓、噴嘴電壓等參數(shù)。

1.3.6 方法學驗證

(1) 基質(zhì)效應(yīng)：分別用甲醇和1.3.2凈化處理后的基質(zhì)溶液制備相同濃度的低、中、高3個水平的標準工作溶液，評價基質(zhì)效應(yīng)。

(2) 線性范圍、檢出限和定量限：配制質(zhì)量濃度分別為 0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80 μg/mL的基質(zhì)匹配標準工作液，繪制基質(zhì)匹配標準曲線。取代表樣品，逐步定量地添加標準溶液，按1.3.2的方法進行處理，信噪比>3時的添加量為檢出限，信噪比>10時的添加量為定量限。

(3) 準確度和精密度：取代表樣品進行低、中、高3個濃度水平添加，每個添加水平平行測定6次，計算回收率。同時對等分樣品進行6次平行測定，評估目標物的日內(nèi)精密度。連續(xù)3 d內(nèi)，對等分樣品進行6次平行測定，評估目標物的日間精密度。

(4) 干擾試驗：在代表樣品提取液中加入喹諾酮類、四環(huán)素類、氯霉素類藥物，配成最終質(zhì)量濃度均為0.10 μg/mL的溶液，用試驗方法進行分析，考察其他物質(zhì)對目標物是否存在干擾。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 測量數(shù)據(jù)由Data Acquisition 進行采集，定量軟件Quantitative Analysis 10.0 分析，使用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件的確定

試驗發(fā)現(xiàn)，當樣品提取液經(jīng)過固相萃取小柱時，強極性物質(zhì)如果糖和葡萄糖等直接流出，目標物10-HDA被吸附在小柱上，先用水淋洗將樣品中殘留的強極性雜質(zhì)去除，再用甲醇將10-HDA 洗脫下來。當提取溶劑中甲醇體積分數(shù)≤40%時，提取液經(jīng)ProElut PLS固相萃取小柱的流出液和水淋洗液中均未檢測到10-HDA；當V甲醇∶V水=5∶5時，流出液中檢出10-HDA。故采用甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=4∶6)作為提取溶液。

2.2 液相色譜條件的確定

結(jié)果表明，采用乙腈—水為流動相體系時，10-HDA的響應(yīng)值最高，但峰形不佳；采用甲醇—水為流動相體系時，10-HDA的響應(yīng)一般，且峰形較差；采用乙腈-0.1%甲酸水和甲醇-0.1%甲酸水為流動相體系時，10-HDA離子化受到抑制，響應(yīng)明顯降低；采用乙腈-5 mmol/L乙酸銨、甲醇-5 mmol/L乙酸銨為流動相體系時，均能得到良好的峰形、最佳的分離效果和穩(wěn)定的響應(yīng)值(見圖1)。由于甲醇毒性較小且成本較低，因此選擇5 mmol/L乙酸銨(A)—甲醇(B)作為流動相，優(yōu)化梯度洗脫程序見表1，色譜柱溫度為35 ℃，進樣量為5 μL。

1. 10-HDA a. 乙腈-0.1%甲酸 b. 乙腈-5 mmol/L乙酸銨 c. 甲醇-5 mmol/L乙酸銨 d. 乙腈-水 e. 甲醇-0.1%甲酸 f. 甲醇—水

表1 梯度洗脫程序

2.3 質(zhì)譜條件的確定

10-HDA的分子式為C10H18O3，相對分子質(zhì)量為186.2。試驗過程中， ESI+、ESI-模式下準分子離子峰[M+H]+和[M-H]-的m/z分別為187.2，184.9，ESI-模式下的響應(yīng)值高于ESI+的，故采用ESI-模式。在ESI-模式下，選擇m/z為184.9的離子作為母離子，進行Product ion掃描，得到10-HDA的二級質(zhì)譜圖。10-HDA在碰撞室中主要碎裂成m/z為138.8，110.8的碎片，推測其可能的裂解途徑為圖2。選擇184.9/138.8、184.9/110.8離子對作為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)的離子對，其中184.9/138.8的響應(yīng)值更高，故將其作為定量離子對，184.9/110.8作為定性離子對。在多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)下優(yōu)化各項參數(shù)，得干燥氣溫度為325 ℃、干燥氣流量為8 L/min、霧化氣壓力為0.31 MPa、鞘氣溫度為400 ℃、鞘氣流量為11 L/min、毛細管電壓為-3 500 V、噴嘴電壓為500 V，目標物的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見表2。

圖2 10-HDA可能的裂解途徑

表2 10-HDA的質(zhì)譜參數(shù)

2.4 方法學驗證

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)評價 樣品基質(zhì)中的干擾物質(zhì)對目標物電離效率的影響用基質(zhì)效應(yīng)(ME)來評價。當|ME|≤20%時，基質(zhì)效應(yīng)對結(jié)果的準確性影響不大，可以忽略不計；當|ME|>20%時，基質(zhì)效應(yīng)較強，對定量結(jié)果會產(chǎn)生較大干擾。由表3可知，蜂蜜中10-HDA在低、中、高3個濃度水平的ME為-29.9%～-45.5%，存在明顯基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此，采用基質(zhì)匹配標準曲線來定量，以獲得更加準確的結(jié)果。

表3 蜂蜜中10-HDA的基質(zhì)效應(yīng)

2.4.2 線性范圍、檢出限和定量限 10-HDA的基質(zhì)匹配標準溶液在0.05～0.80 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=12.4X-283.7，相關(guān)系數(shù)為0.995。方法的檢出限為 0.03 mg/kg，定量限為 0.10 mg/kg。

2.4.3 準確度和精密度 在0.10，0.20，1.00 mg/kg添加濃度水平下，10-HDA的平均回收率為96.9%～108.3%，相對標準偏差為4.5%～10.7%。由表4可知，日內(nèi)精密度和日間精密度分別為5.9%～9.2%和3.5%～14.3%。

表4 方法的回收率與精密度

2.4.4 干擾試驗 文獻[19-20]報道，蜂蜜中可能有喹諾酮類、四環(huán)素類、氯霉素類、硝基呋喃類藥物殘留。采用試驗方法分析含有以上藥物的溶液，在目標物保留時間區(qū)域未發(fā)現(xiàn)干擾，將以上藥物加入到代表性樣品中，目標物濃度未發(fā)生改變[21]。因此，試驗方法有良好的抗干擾能力。

2.5 實際樣品分析

應(yīng)用試驗方法對12個蜂蜜樣品進行檢測，由圖3可知，除1個假蜂蜜樣品未檢出10-HDA外，其余11個蜂蜜樣品中均有檢出10-HDA，最高含量為0.96 mg/kg，最低含量為0.22 mg/kg，說明10-HDA作為內(nèi)源性成分在蜂蜜中普遍存在的。

圖3 基質(zhì)標準溶液和典型樣品溶液MRM色譜圖

3 結(jié)論

建立了蜂蜜中10-羥基-2-癸烯酸的超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。該方法操作簡便，無需進行氣相色譜法繁瑣的衍生化處理；靈敏度高，檢出限和線性范圍等參數(shù)均優(yōu)于高效液相色譜法；且重現(xiàn)性好，抗干擾能力強于薄層色譜法。試驗方法能夠滿足蜂蜜中10-羥基-2-癸烯酸的定性定量分析。由于蜂蜜中10-羥基-2-癸烯酸的含量受蜜源種類、地理環(huán)境等因素影響，后續(xù)將加大對不同種類和產(chǎn)地的蜂蜜監(jiān)測，完善蜂蜜中10-羥基-2-癸烯酸含量的數(shù)據(jù)。