植物單寧分離提純及功能活性研究進(jìn)展

黃達(dá)榮 張雅甄 鄭百濤 杜 冰 黎 攀

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642)

植物單寧是一種天然多酚類化合物，多存在于陸地與海洋的大部分植物之中。其可以與唾液蛋白質(zhì)結(jié)合，也可以聯(lián)合動(dòng)物膠原多肽鏈從而增強(qiáng)皮的韌性，前者是澀味的來源，后者是鞣革的原理，因此單寧也被稱作“鞣質(zhì)”。單寧作為植物的次生代謝產(chǎn)物，是豐富度僅次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的生物質(zhì)資源[1]，主要分布在植物的根[2]、莖[3]、葉[4]及皮[2-3]中，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等活性[5-7]，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及制革[8]等領(lǐng)域。目前，常用的單寧提取方法主要為浸提法與萃取法，并輔以超聲波、微波、加壓等[9]，而提取液多為甲醇、乙醇與丙酮等有機(jī)溶劑[10]，但不同植物來源的單寧需要優(yōu)化其提取與純化工藝。

文章擬綜述單寧的分類與應(yīng)用，以及近年來植物單寧的提取與純化方法的發(fā)展現(xiàn)狀，并提供一個(gè)通用于大部分植物單寧提取與純化的方法，同時(shí)歸納單寧功能活性及其機(jī)制，以期為單寧的高效獲取與高值化應(yīng)用提供依據(jù)。

1 植物單寧的分類及應(yīng)用

1.1 植物單寧的分類

植物單寧可根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)、來源品種和化學(xué)特性進(jìn)行分類，目前普遍按照單寧的結(jié)構(gòu)差異將其分為水解單寧和縮合單寧兩大類(見圖1)，其相對(duì)分子量約為500～20 000 Da。此外，還有復(fù)合單寧和褐藻單寧，但兩者罕見于陸生植物中，復(fù)合單寧由黃烷-3-醇與水解單寧結(jié)合而成，褐藻單寧是間苯三酚的聚合產(chǎn)物，可占海藻干重的30%，其已被證明具有抗菌、抗氧化等活性[11]。植物單寧的常見類型可由表1的方法[12]進(jìn)行鑒別。

圖1 水解單寧與縮合單寧的典型結(jié)構(gòu)

表1 水解單寧與縮合單寧的鑒別反應(yīng)

水解單寧即可水解的單寧，是一種以多元醇為中心，如葡萄糖，通過酯鍵連接數(shù)個(gè)酚酸及其衍生物的化合物[13]，其中多元酚酸是決定單寧性質(zhì)的關(guān)鍵部分。水解單寧遇酸、堿或酶時(shí)容易水解生成小分子量的化合物，根據(jù)水解生成的多元酚羧酸不同，將水解單寧分為鞣花酸單寧和沒食子酸單寧。此外，沒食子酸衍生物也是水解單寧的一類，其一般含有6個(gè)及以上的沒食子?；鶈卧?。

縮合單寧又稱原花色素，以不含糖核的類黃酮、黃烷-3-醇(見圖2)作為結(jié)構(gòu)單元聚合而成，其A環(huán)可出現(xiàn)間苯二酚或間苯三酚形式，而B環(huán)可出現(xiàn)鄰苯二酚或鄰苯三酚形式[14]，構(gòu)成了不同的縮合單寧結(jié)構(gòu)單元[15]；分子間以碳碳鍵相連且不含糖基，不易被水解；與水解單寧相比，縮合單寧的分子量范圍較廣，可以在酸、堿或酶作用下發(fā)生縮合反應(yīng)，而進(jìn)一步的縮聚會(huì)產(chǎn)生不溶于水的紅粉[12]，但高相對(duì)分子質(zhì)量的縮合單寧的分子體積大，在空間中移動(dòng)時(shí)受到的阻力大，導(dǎo)致其生物活性較低。

圖2 黃烷-3-醇的結(jié)構(gòu)

1.2 植物單寧的應(yīng)用

單寧不僅可以作為調(diào)味劑在茶、咖啡等飲料中調(diào)節(jié)風(fēng)味，用于生產(chǎn)速溶飲料，還能影響食品色澤，其機(jī)理是單寧在環(huán)境中容易被氧化為醌類物質(zhì)而加深顏色。此外利用單寧與蛋白結(jié)合的性質(zhì)，將牛血清蛋白與單寧酸制成多層微膠囊，可延緩胃酸的侵蝕，有效保護(hù)膠囊中的乳鐵蛋白，并制備多層微膠囊的乳鐵蛋白口服制劑[16]，而固定化單寧可在食品加工領(lǐng)域中純化活性肽與蛋白質(zhì)、澄清酒與飲料[17]；單寧還可以抑制食品腐敗菌而延長(zhǎng)食品保藏期[18]。此外，單寧在制革[19]、醫(yī)藥[20]與水處理[21]等領(lǐng)域也發(fā)揮著重要作用。

2 植物單寧提取與純化

2.1 提取方法

單寧的含量測(cè)定[22]見表2。目前，單寧的定量分析方法有高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法等，這些方法較多應(yīng)用于總酚含量的測(cè)定，盡管有測(cè)定縮合單寧的方法，但幾乎沒有一種可以普適于各種植物單寧定量的方法，因?yàn)槎繒r(shí)常用的如沒食子酸、兒茶素、表兒茶素等標(biāo)準(zhǔn)品，與各種植物單寧組分差異較大，其標(biāo)準(zhǔn)品選擇仍是一個(gè)尚未解決的問題。因此目前定量植物單寧一般參考前人文獻(xiàn)的方法，或者對(duì)多種測(cè)定方法進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法等方法學(xué)篩查，確定含量后再經(jīng)高效液相色譜分離可以明確植物單寧組分。

表2 單寧的定量方法

2.1.1 溶劑浸提法 溶劑提取法是提取單寧的基礎(chǔ)方法，可以分為無機(jī)溶劑法和有機(jī)溶劑法，如水和甲醇、乙醇、丙酮等。其中熱水提取是中國(guó)最傳統(tǒng)的方法，雖然單寧溶于水、乙醇與丙酮，但植物中也含有水溶性的樹脂、蛋白質(zhì)、淀粉等雜質(zhì)，直接用水提取所得到的植物單寧含量較低，水與有機(jī)溶劑混合后進(jìn)行提取成為主流，如水—丙酮體系能破壞單寧與蛋白質(zhì)的連接鍵，提高單寧提取率[23]。為了更高效地提取單寧，在確定提取溶劑的基礎(chǔ)上，輔以超聲波、微波、加熱等方法(見表3)，并利用正交試驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行單寧提取工藝優(yōu)化。

2.1.2 超聲波、微波提取和酶解轉(zhuǎn)化法 單寧是植物細(xì)胞產(chǎn)物，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁是單寧提取的主要阻礙。超聲波具有機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)，微波則使胞內(nèi)水分吸收微波能而汽化，對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞壁產(chǎn)生壓力而形成小孔，酶能選擇性地分解細(xì)胞膜與細(xì)胞壁，且條件更為溫和，因此酶輔助提取已被廣泛用于從食品和植物中提取不同種類的化合物[34]。三者一般用于輔助溶劑對(duì)植物單寧進(jìn)行提取。

表3 不同植物單寧的提取方法?

2.1.3 超臨界流體萃取法 超臨界流體具有液體和氣體的雙重性質(zhì)，通過控制壓力和溫度即能選擇性地萃取出植物單寧，二氧化碳因其清潔、成本低、萃取時(shí)性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，目前被用作超臨界流體，且利用超臨界二氧化碳萃取可以保護(hù)單寧免受氧化。姜萍等[35]應(yīng)用超臨界二氧化碳提取五倍子中的單寧酸，經(jīng)條件優(yōu)化后得率高達(dá)57.83%，但目前國(guó)內(nèi)外較少應(yīng)用該技術(shù)提取單寧，可能是萃取所用儀器要求高，成本也較高。

2.2 純化方法

2.2.1 溶劑萃取及沉淀吸附法 單寧在醇類、丙酮等有機(jī)溶劑中溶解度較高，而高濃度乙醇能沉淀植物的大部分蛋白質(zhì)，因此有機(jī)溶劑均能在提取與純化單寧時(shí)發(fā)揮作用，但利用溶劑萃取仍處于初步純化階段且溶劑殘留會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量。此外，還可以利用疏松多孔的活性炭或皮粉吸附大量雜質(zhì)，其中包括植物色素、樹膠等。

2.2.2 色譜分離法 目前制備高純度單寧及有關(guān)化合物的主要方法是色譜分離法。固定相一般選用大孔樹脂和葡聚糖凝膠，前者的耐壓性較強(qiáng)，裝柱后能承載較高流速而不塌陷，純化效率比后者高，而后者以Sephadex LH-20為主。范小曼[36]聯(lián)合運(yùn)用XAD16HP大孔樹脂與葡聚糖凝膠LH-20提純了白花敗醬單寧，并對(duì)單寧組分進(jìn)行了有效分離。在對(duì)不同植物單寧進(jìn)行純化時(shí)，需先篩選合適的固定相，后進(jìn)行靜態(tài)與動(dòng)態(tài)的解吸、吸附試驗(yàn)，以確定層析柱的上樣濃度、上樣流速、洗脫劑類型及濃度等參數(shù)。

2.2.3 膜分離 膜技術(shù)以選擇透過性的膜為基礎(chǔ)，如微濾、納濾和超濾膜，為新興的綠色技術(shù)，但近年來鮮有報(bào)道，可能是因?yàn)榇蟛糠种参锏膯螌幒枯^低，提取時(shí)需要除去大量雜質(zhì)，易導(dǎo)致膜堵塞。杜運(yùn)平等[37]采用聚砜中空纖維膜分離了板栗苞單寧，純度約為64.00%。

3 植物單寧的功能活性及機(jī)制

3.1 抗氧化

單寧的抗氧化性體現(xiàn)在4個(gè)方面：① 作為氫供體通過還原反應(yīng)降低環(huán)境中的活性氧、自由基等；② 螯合金屬離子，避免催化過氧化物進(jìn)一步氧化；③ 調(diào)控機(jī)體中的氧化還原系統(tǒng)[38]，還原型谷胱甘肽可以上調(diào)Bcl-2與Bax的比值，清除機(jī)體內(nèi)自由基，而叢明等[39]研究發(fā)現(xiàn)，用原花青素灌胃大鼠，能顯著增加大鼠大腦皮質(zhì)的Bcl-2/Bax值，調(diào)控集體氧化系統(tǒng)；④ 調(diào)控機(jī)體與氧化應(yīng)激的相關(guān)信號(hào)通路，緩解應(yīng)激狀態(tài)下的損傷，目前主要調(diào)控的信號(hào)通路為Keap1-Nrf2/ARE，而杏仁皮中的縮合單寧能激活該通路[40]，提高機(jī)體抗氧化蛋白的表達(dá)量。單寧的抗氧化活性是觸發(fā)抗炎等有益機(jī)制的基礎(chǔ)，其可能涉及的機(jī)制如圖3所示，但具體的作用機(jī)制仍需更深入的研究，特別是考慮到不同植物的單寧的給藥劑量及其代謝圖譜的多樣性。此外，單寧還能與腸道相互作用，黃烷-3-醇單體能被腸道吸收[41]，但其聚合體能被腸道菌群降解吸收或與腸道蛋白結(jié)合而增強(qiáng)腸道屏障。

圖3 單寧的抗氧化特性可能涉及的機(jī)制[11]

3.2 抑菌

單寧對(duì)致齲細(xì)菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌[42]具有顯著的抑制效果，還可以促進(jìn)牙體組織礦化、治療牙周及牙體牙髓疾病，因此被廣泛應(yīng)用于口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。單寧對(duì)細(xì)菌抑制的重要結(jié)構(gòu)是酚羥基，而單寧抑菌的機(jī)制主要分為：① 螯合細(xì)菌所需的金屬離子，如鐵和銅；② 抑制并破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)外膜的形成，減少病菌的粘附；③ 與細(xì)菌特定靶標(biāo)蛋白和藥物外排蛋白結(jié)合，提高藥物對(duì)細(xì)菌的殺傷力；④ 抑制細(xì)菌代謝所需的酶[43]，影響細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成、能量代謝和氧化還原系統(tǒng)；⑤ 增強(qiáng)機(jī)體免疫力，如草莓單寧可以抑制NF-κB信號(hào)通路，降低人體炎癥因子的水平[44]。

3.3 抗病毒

植物單寧對(duì)冠狀病毒[45]和諾如病毒[46]有顯著抑制能力，后者利用NoV P蛋白開發(fā)了一種以唾液為基礎(chǔ)的結(jié)合—阻斷試驗(yàn)，并以此來評(píng)價(jià)50種植物單寧抑制諾如病毒的能力，從而篩選出石榴單寧與五倍子單寧作為抗諾如病毒的潛在候選藥物，這提示需要建立植物單寧的標(biāo)準(zhǔn)化藥效評(píng)價(jià)體系。單寧抗病毒的機(jī)制與抑菌類似，會(huì)抑制病毒的酶與生物膜，阻止病毒侵入細(xì)胞和細(xì)胞核，抑制病毒反轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，此外單寧還會(huì)削弱病毒粘附細(xì)胞的能力、運(yùn)動(dòng)能力[47]，同時(shí)單寧促使病毒蛋白質(zhì)變性、阻斷病毒的胞間傳播來實(shí)現(xiàn)抗病毒的功能，但不同來源和化學(xué)結(jié)構(gòu)的植物單寧抗病毒性能也有所差異，因此需進(jìn)一步探索其具體抗病毒機(jī)制和動(dòng)物試驗(yàn)。

3.4 抗腫瘤

單寧可以通過抑制端粒酶活性、激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的UPR信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。其中腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS含量是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵，一方面ROS能加快腫瘤細(xì)胞繁殖分化、激活轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)通路，而另一方面高濃度的ROS含量能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；單寧酸能提高腎癌細(xì)胞中ROS含量、降低黏附分子ICAM-1的表達(dá)量，促進(jìn)腎癌細(xì)胞的凋亡并抑制細(xì)胞集聚與轉(zhuǎn)移。同時(shí)抗炎、抗氧化的機(jī)制也對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞具有積極影響。已有研究[48]證明植物單寧對(duì)結(jié)腸直腸癌、胰腺癌細(xì)胞的抑制作用，但多數(shù)研究?jī)H聚焦于細(xì)胞模型的評(píng)價(jià)，這與動(dòng)物模型具有較大差異，細(xì)胞模型的積極作用不能等同于動(dòng)物試驗(yàn)的藥效，因此需要建立小鼠或大鼠的腫瘤模型進(jìn)行藥效試驗(yàn)。

3.5 調(diào)節(jié)血糖

單寧降低血糖的作用已在脂肪細(xì)胞、大小鼠、幼豬、魚類為對(duì)象的試驗(yàn)中得到了證實(shí)[49-50]。其血糖調(diào)節(jié)機(jī)制可分為：① 抑制α-葡萄糖苷酶等食物分解酶的活性，影響機(jī)體吸收；② 促進(jìn)胰島β細(xì)胞再生和胰島素的分泌；③ 促進(jìn)糖酵解，抑制糖異生；④ 作用于腸道菌群而調(diào)節(jié)血糖[50]。單寧對(duì)2型糖尿病的癥狀有改善作用[51]，但血糖調(diào)節(jié)的分子機(jī)制仍是單寧降血糖的研究點(diǎn)，單寧對(duì)糖酵解、糖異生途徑的影響研究不足，尤其是胰島素與糖代謝的信號(hào)通路具有較大的研究潛力。

3.6 抗炎

Aguiar等[52]報(bào)道原花青素能通過抑制新陳代謝和炎癥遞質(zhì)而起到積極的抗炎作用；Pallarès等[53]發(fā)現(xiàn)葡萄籽的原花青素可以降低營(yíng)養(yǎng)型肥胖大鼠模型的慢性低度炎癥。綜上，單寧的抗炎能力可能是調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥因子水平如下調(diào)肝臟組織中的TNF-α與IL-6水平、抑制NO與前列腺素E-2等致炎物質(zhì)的產(chǎn)生、防止致炎物質(zhì)與其他分子絡(luò)合，更具體的抗炎機(jī)制還有待探索，但單寧的抗炎活性已被證明，且單寧的抗炎能力與其抗氧化和抗菌等能力相關(guān)，因?yàn)橹虏【统趸锱c炎癥具有密切聯(lián)系。

3.7 抑制寄生蟲

植物及其提取物已被用作人類和家畜的驅(qū)蟲劑。從水解單寧的角度來看，其干擾蟲卵孵化和幼蟲運(yùn)動(dòng)的3種機(jī)制[54]為：① 擁有強(qiáng)蛋白沉淀能力的水解單寧與卵和幼蟲通過非共價(jià)鍵結(jié)合；② 具有高氧化活性的水解單寧可能被自身氧化，并且氧化產(chǎn)物與卵和幼蟲共價(jià)結(jié)合；③ 水解單寧進(jìn)行水解，并且水解產(chǎn)物可能通過非共價(jià)或共價(jià)相互作用與卵和幼蟲相互作用，從而破壞卵的發(fā)育及幼蟲運(yùn)動(dòng)，但縮合單寧的驅(qū)蟲機(jī)理與調(diào)控機(jī)制尚未明確，有待進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)與展望

目前單寧主要是從蟲癭五倍子中提取，但隨著單寧需求量的上升，不同植物的單寧開發(fā)逐漸受到關(guān)注，而植物單寧的自然資源豐富，具有廣闊的應(yīng)用前景。單寧類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有關(guān)單一植物單寧的結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)特性研究還不夠充分，學(xué)科間的交叉研究較為欠缺，導(dǎo)致部分結(jié)論與作用機(jī)理不明確，在不同植物單寧的生物活性研究方面難以形成完整系統(tǒng)。

在單寧功能活性產(chǎn)品開發(fā)方面，其難點(diǎn)在于工作人員需擴(kuò)大研究范圍，針對(duì)不同來源的植物單寧中起功效的活性成分、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和發(fā)揮作用的機(jī)理進(jìn)行探索，才能實(shí)現(xiàn)植物單寧在產(chǎn)品開發(fā)上的精準(zhǔn)應(yīng)用。但植物單寧的不同提取來源和添加濃度，以及不同動(dòng)物種類和生理狀態(tài)會(huì)影響其添加效果。后續(xù)需對(duì)不同植物單寧的構(gòu)效關(guān)系以及單寧的添加劑量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，建立不同藥效評(píng)價(jià)模型，并分析不同植物單寧的組分與結(jié)構(gòu)，以明晰不同分子結(jié)構(gòu)類型以及不同劑量單寧的作用機(jī)理，實(shí)現(xiàn)單寧在各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。