檳榔貯藏及加工過程中細菌群落結構變化

阮志強 鄧建陽 蔣雪薇 姚 力 李 浩 羅曉明 盧克強

(1. 長沙理工大學化學與食品工程學院，湖南 長沙 410114；2. 湖南皇爺食品有限公司，湖南 湘潭 411207)

檳榔(ArecacatechuL.)，是棕櫚科檳榔屬常綠喬木，主要分布在亞洲的熱帶地區(qū)[1]。目前中國檳榔生產主要集中在海南，深加工主要集中在湖南[2]。檳榔被稱為四大南藥(檳榔、砂仁、益智、巴戟天)之首[3]，由于咀嚼后會產生欣快感和輕微興奮性，頗受特定人群喜愛，已逐漸成為第四大嗜好品。檳榔鮮果不耐貯藏[4]，故需在產地經干制加工成檳榔原籽運至湖南進行貯藏或加工。不同檳榔廠家加工工藝略有不同[5-6]，但主要工藝比較相似，一般為：檳榔原籽→煮籽→發(fā)制→烤籽→悶香→壓籽→上膠→切籽(含去核、點鹵)→晾籽→包裝等多個工序[7]。根據這些工序的加工特點及細菌數量變化發(fā)現，原籽的初始帶菌對整個工藝過程細菌總數影響較大；煮籽是一個降細菌數量比較有效的工序；發(fā)制→烤籽→悶香是一個連續(xù)的過程，且對細菌數量提升有促進作用，是加工過程中的重要風險點；壓籽→上膠→切籽中的壓籽和上膠均為設備操作，而切籽(含去核、點鹵)則大多為人工操作，成為悶香后的又一個風險點；晾籽是包裝前進一步降低水含量的過程，且伴隨著紫外殺菌等措施，被認為是檳榔包裝前的減菌工序[6]。從上述工序分析可以發(fā)現，檳榔原籽(含新籽和老籽，新籽為當年采摘后干制而成的原籽，老籽為新籽貯藏1年及以上的原籽)、煮籽、悶香、切籽、晾籽以及成品為檳榔加工過程中控制的關鍵點。

檳榔污染菌分為細菌和霉菌兩大類。霉菌主要生長在檳榔產品表面，污染后易長成肉眼可見的菌絲體，霉菌在檳榔加工中可以從環(huán)境管控及產品水分控制兩個方面入手，目前課題組及其他研究團隊針對霉菌群落結構及其控制已經開展了較多研究[8-9]。檳榔加工中的細菌相較霉菌來說，其生長周期更短，且不易發(fā)覺，更難防控。檳榔的污染細菌主要來源于成果時的內生菌[7]以及加工污染[10]，是檳榔腐敗的主要因素，能使成品檳榔表面發(fā)黏，嚴重的情況下還會引起腹瀉等急性癥狀，而且耐熱的細菌(芽胞桿菌屬等)在檳榔加工中難以被殺滅，而目前對檳榔污染細菌及細菌在檳榔貯藏和加工過程中的變化尚未見報道。

高通量測序技術(HTS)因其效度快及通量高的優(yōu)勢[11-12]，目前已被廣泛應用于基因組學研究中，其在腸道[13-14]、土壤[15-16]和發(fā)酵食品[17-18]等樣品的微生物多樣性研究領域具有明顯的先進性和優(yōu)勢。蔣雪薇等[8]通過高通量測序技術發(fā)現檳榔原籽貯藏前后優(yōu)勢真菌為散囊菌屬(Eurotium)、曲霉屬(Aspergillus)；張祺玲等[9]通過高通量測序技術發(fā)現在食用檳榔整個加工過程中，檳榔內生菌Aspergillus均為絕對優(yōu)勢真菌，相對豐度達66.70%～97.67%。劉媛等[19]通過高通量測序技術發(fā)現在三藥檳榔種子的內生細菌中，腸球菌屬(Enterococcus)占比42.9%，為第一優(yōu)勢菌屬。文章擬利用高通量測序技術對檳榔原籽貯藏前后及加工過程中的細菌群落結構進行研究，獲得檳榔原籽貯藏前后及加工過程中的細菌群落結構及變化信息，為分析檳榔原籽貯藏及加工過程中細菌的污染源提供依據，在減少污染的同時為檳榔生產全線防控細菌污染提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

檳榔樣品采自湖南某檳榔公司，包括當年產的檳榔原籽新籽(BL1)、BL1貯藏1年的原籽老籽(BL2，貯藏條件為室溫避光通風干燥)、煮籽后樣品(BL3，原料為檳榔原籽新籽BL1)、悶香后樣品(BL4)、壓籽后樣品(BL5)、切籽樣品(BL6)和成品(CP7)，隨機采集樣品低溫運回實驗室，編號后于-80 ℃貯藏備用。

1.1.2 主要試劑

平板計數瓊脂(PCA)：杭州微生物世紀有限公司；

氯化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

E.Z.N.A.Soil DNA Kit試劑盒：美國Omega生物試劑公司；

Taq DNA Polymerase及dNTP-mix：美國Thermo Fisher科技公司；

SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒：上海生工生物工程有限公司；

瓊脂糖：北京天根生化科技有限公司;

16S rDNA V3～V4區(qū)引物：上游引物為341F[20](5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)，下游引物為805R[20](5′-GACTACCAGGGTATCTAATC-3′)，上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌鍋：BXM-30R型，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；

恒溫培養(yǎng)箱:MJ-250 Ⅱ型，上海一恒科技有限公司；

臺式離心機：Pico-21型，美國Thermo Fisher科技公司；

熒光定量儀：Qubit2.0型，美國Life科技公司；

漩渦混合器：GL-88B型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；

混勻型干式恒溫器：TND03-H-H型，深圳拓能達科技；

電泳儀電源：DYYY-6C型，北京市六一儀器廠；

電泳槽：DYCZ-21型，北京市六一儀器廠；

凝膠成像系統(tǒng):ChampGel5000型(增強型)，北京賽智公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細菌總數計數 參照GB 4789.2—2016。

1.3.2 含水量測定 選取同一工序樣品6～8個，去核切碎后混勻，準確稱取5.00 g于稱量瓶中，105 ℃烘干至恒重后計算樣品含水量。

1.3.3 總DNA提取及PCR擴增 采用E.Z.N.A.Soil DNA Kit試劑盒提取檳榔樣品中細菌總DNA，用Qubit 2.0熒光定量儀檢測DNA濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，于-20 ℃貯藏備用。選用16S rDNA V3～V4區(qū)通用引物341F-805R進行擴增。

(1) 初次PCR擴增反應體系為50 μL：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP(10 mmol/L each) 0.5 μL，Genomic DNA 10 ng，Bar-PCR primer F(50 μmol/L) 0.5 μL，Primer R(50 μmol/L) 0.5 μL，Plantium Taq(5 U/μL) 0.5 μL，ddH2O補齊至50 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s；5個循環(huán)，最終72 ℃延伸5 min。

(2) 初次PCR結束后進行第二輪擴增，第二輪擴增體系為50 μL：10 × PCR Buffer 5 μL，dNTP(10mmol/L each) 0.5 μL，DNA 20 ng，Primer F(50 μmol/L) 0.5 μL，Primer R(50 μmol/L) 0.5 μL，Plantium Taq(5 U/μL) 0.5 μL，ddH2O補齊至50 μL。PCR反應程序與初次相同。PCR結束后，將產物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

1.3.4 高通量測序 采用DNA回收試劑盒對PCR擴增產物進行切膠回收，利用Qubit2.0熒光定量儀對回收的DNA進行精確定量。根據獲得的DNA濃度，將所有樣品按質量比1∶1進行混合，混合后的樣品寄往上海生工進行測序，測序平臺為Illumina MiSeq平臺。

1.3.5 測序結果預處理 通過Flash軟件融合雙末端序列，使其形成一條序列，根據各樣品的barcode序列使數據回歸樣品。通過Prinseq軟件對各樣品序列進行質量控制(QC)，去除引物序列、短片段、低復雜度序列和低質量序列[21]。利用Uchime和pre.cluster軟件去除嵌合體及靶區(qū)域外序列以獲得最終可用于分析的序列[22]。

1.3.6 生物信息分析 利用uclust軟件(uclust v1.1.579)以97%的相似性為閾值對序列進行OTU聚類。根據樣品的OTU及序列關系，采用mothur軟件[23]對樣品進行Alpha多樣性分析，計算各物種多樣性指數，衡量樣本物種多樣性。采用RDP classifier軟件[24]將序列進行物種分類，RDP classifier參數：-f allrank -q input -g 16s -o rdp_out，分類閾值默認為0.8。

1.3.7 數據分析 采用Excel軟件對數據進行處理，Origin 2021軟件繪圖；所有樣品均采用3平行樣分析，測序結果取均值用于后續(xù)繪圖。

2 結果與討論

2.1 檳榔加工過程中關鍵工序樣品細菌總數及水分含量變化

由圖1和圖2可知，整個貯藏及加工過程中，檳榔樣品的細菌總數在數量級上的差異較小。檳榔原籽貯藏1年后，細菌總數從1.5×104CFU/g降至7.1×103CFU/g，水分含量從18.32%降至10.50%。加工過程中，檳榔原籽經一系列工序加工后，成品樣品中細菌總數為8.7×102CFU/g，達到產品出廠前的標準要求5.0×103CFU/g，水分含量為27.23%。加工過程中出現細菌總數升高的是煮籽到悶香的中間階段，包括發(fā)制、烤籽和悶香等工序，這是由于發(fā)制與悶香是檳榔加工中入味及定香的工序，一般在密閉的罐內進行，此時樣品的水分含量達到了最大值，為30.35%，較為適合微生物的生長。加工過程中多項工序的細菌總數與出廠標準相差不大，多依賴于晾籽工序中的食用酒精處理和紫外照射等消毒殺菌措施使成品達到產品的出廠標準，但這兩種處理方式會出現不均勻的情況，影響成品的細菌總數穩(wěn)定達標。

圖1 檳榔加工過程中關鍵工序樣品細菌總數變化

圖2 檳榔加工過程中關鍵工序樣品水分含量變化

2.2 測序數據處理與分析

將待測序樣品添加barcode序列作為測序標簽后進行樣品建庫與測序，測序結束后，根據barcode序列對獲得的測序序列進行區(qū)分，其中質控后BL1樣品獲得序列數為62 470，BL2樣品獲得序列數為36 624，BL2、BL3和BL4樣品獲得的序列數較為接近，分別為18 980，15 940，19 511，BL6樣品獲得序列數為35 915，CP7樣品獲得序列數為10 465。完成質控處理后，通過Uchime和pre.cluster軟件去除嵌合體及靶區(qū)域外序列，各樣本處理后統(tǒng)計結果如表1所示。其中BL1～BL6樣品最終獲得可用于分析的序列數均在10 000以上，滿足基本分析要求，CP7樣品最終獲得可用于分析的序列數為9 444，序列數較少，最終分析結果可能會有誤差。經最后處理后樣品的序列分布如圖3所示。由圖3可知，大部分序列長度分布在421～440 bp，符合16S rDNA高通量測序V3～V4區(qū)的要求和標準。

表1 各樣本數據信息統(tǒng)計

圖3 有效序列長度分布圖

2.3 高通量測序數據統(tǒng)計分析

2.3.1 OTU統(tǒng)計分類 將多條序列按其序列間的距離進行聚類，根據序列之間的相似性作為閾值分為操作分類單元(OTU)，閾值的序列相似性為97%。通過uclust軟件對7個樣品的序列進行聚類(見表2)，共獲得6 447個 OTU，其中獲得OTU數量最多的是BL2樣品，為3 028個，獲得OTU數量最小的是CP7樣品，為505個。

表2 樣品的OTU數量及Alpha多樣性

為驗證OTU分類能否真實反映樣品中微生物的群落多樣性，對各樣品采用Coverage及豐富度指數進行評估。由表2可知，Coverage值最大的是BL6樣品，為0.977 1，Coverage值最小的是BL4樣品，為0.950 3，7個樣品的Coverage值均在0.95以上，表明此次測序結果基本可以代表樣本中微生物的真實情況。

由圖4可知，BL1、BL2和BL6樣品的稀釋性曲線均趨于相對平穩(wěn)，而BL3、BL4、BL5和CP7樣品的稀釋性曲線還有較大增長的可能性，表示增大測序深度可以獲得更多的OTU，但是結合樣品的Coverage值來看，此次測序結果已覆蓋到樣本中絕大多數微生物，故7個樣品的OTU分類基本能夠真實反映樣品中微生物的群落多樣性。

圖4 樣品豐度稀釋性曲線

2.3.2 細菌菌群Alpha多樣性分析 由表2可知，BL1樣品的香農指數為2.831 6、辛普森指數為0.325 7，BL2樣品的香農指數為5.513 6、辛普森指數為0.032 9，說明BL1樣品的細菌群落物種多樣性低于BL2樣品。BL1樣品的Chao1指數為5 810.01、ACE指數為9 499.26，遠高于BL2樣品的Chao1指數(3 733.47)和ACE指數(3 748.95)，說明BL1樣品的細菌群落物種豐富度高于BL2樣品。結合2個樣品的物種多樣性和豐富度來看，BL1樣品具有更高的物種豐富度，但是物種多樣性低于BL2樣品，說明檳榔原籽在貯藏前后所含細菌的豐富度逐漸降低，但是物種多樣性逐漸升高。在各生產工序樣品中，BL3樣品的物種多樣性最低，物種豐富度也處于較低水平，說明煮籽工序具有較好的殺菌作用，能降低樣品中細菌數量；BL4樣品的物種多樣性最高，物種豐富度也處于較高水平，結合細菌總數檢測數據，說明在煮籽后至悶香結束的過程中溫度、水分等環(huán)境條件適宜細菌的生長；BL5、BL6樣品的物種多樣性和物種豐富度較BL4樣品均有所降低，這是由于壓籽到切籽工序樣品水分蒸發(fā)，含水量下降導致部分細菌死亡；CP7樣品的物種豐富度降至最低，但其物種多樣性仍維持在較高水平，是因為晾籽工序進一步降低了樣品水分，加上晾籽過程中采用食用酒精消毒處理和紫外線照射，使細菌總數進一步降低，但由于檳榔加工為固體物料的半連續(xù)化加工，所有工序受到環(huán)境因素的影響較大，致使成品(CP7)的細菌多樣性在7個樣品中依然維持較高水平。

2.4 檳榔貯藏前后及加工過程中細菌群落結構變化

在“科”的分類水平上，7個樣品共獲得239個細菌科，單個樣品獲得的細菌科數量依次為165，207，146，153，137，140，75。7個樣品的物種豐度圖如圖5所示，其中檳榔原籽新籽BL1樣品的優(yōu)勢細菌為芽胞桿菌科(Bacillaceae1)，占比72.91%，其次是假單胞菌科(Pseudomonadaceae)占比11.28%，叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)占比9.43%，unclassified細菌占1.01%，其余占比均低于1%。而檳榔原籽老籽BL2樣品的物種含量則更加均一，其中以Pseudomonadaceae占比最高，為27.7%，其次為Comamonadaceae占比17.76%，unclassified序列占比7%，其他細菌如疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)、黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)等10個科占比>1%。通過對比可知，兩種檳榔原籽在“科”的分類水平上存在較大差異，經貯藏后老籽細菌的相對豐度更為均衡，所以物種的多樣性明顯升高。而在各加工工序樣中，BL3樣品的明串珠菌科(Leuconostocaceae)和Bacillaceae1占主要地位，占比分別為47.01%，33.51%；BL4～CP7樣品中優(yōu)勢菌群較為相似，均為Comamonadaceae和Pseudomonadaceae，綜合占比均在70%以上。此外，黃桿菌科(Flavobacteriaceae)在加工過程中含量逐漸遞增，在CP7樣品中占比14.71%。

圖5 檳榔加工過程中關鍵工序樣品科水平物種豐度圖

在“屬”的分類水平上，7個樣品共獲得790個細菌屬，單個樣品獲得的細菌屬數量依次為458，579，343，353，353，340，133。7個樣品的物種豐度圖如圖6所示，BL1樣品中以芽胞桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)及氫噬胞菌屬(Hydrogenophaga)為主要污染細菌，分別占比72.90%，11.21%，9.23%。其他細菌如嗜熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacterium)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)與沙雷氏菌屬(Serratia)等也有少量存在，占比均<1%。BL2樣品中，Pseudomonas與Hydrogenophaga占比分別為27.40%，16.61%，在BL1樣品中占比較高的Bacillus在老籽中僅占0.59%。此外，在BL1樣品中含量較低的菌如艾克曼菌屬(Akkermansia)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)與Thermoanaerobacterium等，貯藏1年后在BL2樣品中占比均有所提升，分別為6.24%，2.23%，2.12%。而在各加工工序樣中，BL3樣品的明串珠菌屬(Leuconostoc)和Bacillus占主要地位，占比分別為47.01%，33.5%；BL4～CP7樣品中均為Hydrogenophaga和Pseudomonas，綜合占比均在70%以上。根據污染細菌群落結構及細菌的生活習性分析，Pseudomonas、Bacillus和Hydrogenophaga應屬于檳榔內生菌[25]，對于不耐熱的革蘭氏陰性菌，如Hydrogenophaga和Pseudomonas，煮籽工序可以將其有效殺死；而耐熱的革蘭氏陽性菌Bacillus則很難用單純的煮籽工序將其殺死，需選擇其他抑菌殺菌工藝。隨著工序的進行，金黃桿菌屬(Chryseobacterium)逐漸增加，在CP7樣品中占比14.64%。Chryseobacterium為革蘭氏陰性菌，廣泛存在土壤、水、植物等自然環(huán)境及醫(yī)院環(huán)境中，為條件致病菌，可能是在發(fā)制入味工序中由環(huán)境帶入，此外發(fā)制及悶香工序的環(huán)境條件有利于此菌繁殖，從而導致其數量增殖[26]。

圖6 檳榔加工過程中關鍵工序樣品屬水平物種豐度圖

2.5 檳榔加工過程中各工序污染細菌屬數量變化

檳榔加工過程中的污染細菌主要來源于兩個方面，一方面為檳榔成果時的內生菌[27]，另一方面為貯藏及加工各工序的污染菌。在屬水平對相鄰工序樣品共有細菌屬、消亡細菌屬及新增細菌屬進行分析，可以反映檳榔加工過程中兩相鄰工序間細菌菌屬的消長。由圖7可知，每兩相鄰工序均有新增細菌屬，說明檳榔加工過程的每個工序樣品都會受到來自環(huán)境的微生物污染；除BL6與CP7樣品外，每相鄰兩工序中共有細菌屬數量均比消亡細菌屬及新增細菌屬數量多，說明檳榔加工過程中，每個關鍵工序的污染細菌多數由上一工序傳遞而來；原籽新籽(BL1)貯藏1年后成為老籽(BL2)是新增細菌屬最多的過程，達227個屬，說明在原籽貯藏過程中受到環(huán)境污染較大，促進了新增細菌屬的數量，需對貯藏環(huán)境進行消殺，減少貯藏過程中的細菌污染；煮籽(BL3)到悶香(BL4)中新增細菌屬數量居次，為126個屬，結合細菌總橫坐標為貯藏前后或加工過程中的兩相鄰工序樣品；消亡細菌屬數為兩相鄰工序樣品中下游工序樣品相對上游工序樣品消亡的細菌屬數量；共有細菌屬數為兩相鄰工序樣品共有的細菌屬數；新增細菌屬數為兩相鄰工序樣品中下游工序樣品相對上游工序樣品新增的細菌屬數量數的變化(圖1)及樣品水分含量變化(圖2)，可以發(fā)現這一工序樣品細菌總數及樣品含水量均為加工過程中的最大，說明檳榔加工中的悶香(含前序的發(fā)制)由于溫度及水分含量適宜，成為細菌從數量到種類上的增殖階段，為后續(xù)工序減菌帶來困難，需重點關注；切籽(BL6)到成品(CP7)中消亡細菌屬數量最多，為227個屬，切籽(含去核、點鹵)后、成品包裝前，檳榔企業(yè)一般會進行晾籽及一些表面殺菌處理，隨著水分含量的下降及表面殺菌處理，成品中由上一工序帶來的細菌出現較大幅度的消亡，也是檳榔加工工序中最后一道可以進行有效減菌的工序；新籽(BL1)到煮籽(BL3)工序細菌消亡屬的數量位居其次，為216個屬，煮籽工序是檳榔加工中唯一的一個熱加工工序，后續(xù)工序處于對檳榔風味的保持，無法再采用熱加工工序，因此，煮籽對于細菌的防控具有一定作用。綜上，檳榔加工過程中細菌污染的防控重點應為控制好檳榔發(fā)制悶香中的細菌增殖、各工序中的環(huán)境污染、用好煮籽工序及成品前工序的減菌措施。

圖7 檳榔測序樣品相鄰工序細菌屬數量變化

3 結論

采用Illumina Miseq高通量測序技術對檳榔原籽貯藏和加工過程中細菌多樣性和群落結構進行分析。結果表明，檳榔原籽在貯藏過程中，新籽的物種豐富度高于老籽，而老籽擁有更高的物種多樣性。7個關鍵工序樣品共檢出239個科，790個屬，其中Bacillus、Pseudomonas和Hydrogenophaga為優(yōu)勢菌屬。通過對關鍵工序樣品的細菌總數、水分含量及細菌屬數量進行分析，發(fā)現檳榔成果時帶來的內生菌屬于檳榔比較主要的細菌來源；加工過程中每個工序樣品都會受到環(huán)境中細菌的污染；新籽貯藏為老籽、煮籽到悶香的工序中新增細菌屬數量較多，屬于重點防控環(huán)節(jié)；切籽到成品、新籽到煮籽工序新增細菌屬數量較少，屬于合適的減菌環(huán)節(jié)。檳榔鮮果成果時的內生菌在檳榔加工過程中仍占據一定比例，這對檳榔產品的細菌指標有較大影響，如何降低檳榔鮮果的內生菌并保持生產環(huán)境的潔凈將是今后檳榔加工細菌防控的重點。