嬰幼兒配方乳粉葉黃素含量檢測(cè)不確定度的評(píng)定

陳 忱

北大荒完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司質(zhì)檢中心，黑龍江哈爾濱 150000

0 引言

目前，國(guó)家對(duì)于嬰幼兒配方乳粉（簡(jiǎn)稱“嬰配粉”）的監(jiān)管日益嚴(yán)格[1]，尤其對(duì)于葉黃素這類極易降解、添加的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化物質(zhì)含量，抽檢頻次要求更為頻繁[2，3]。對(duì)于不同的檢測(cè)方法，在其檢測(cè)過程中總會(huì)引入A類不確定度和B類不確定度，A類不確定度主要來(lái)源是測(cè)量重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel Xrep()和多次測(cè)量試樣質(zhì)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel m2()。而B類不確定度則包含的比較廣泛，主要包括工作曲線相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel X()，稱量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel m1()，樣品定容體積,的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel V()，標(biāo)準(zhǔn)溶液相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel I()等。本文則是針對(duì)《GB5009.248—2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉黃素的測(cè)定》方法，對(duì)檢測(cè)過程中可能出現(xiàn)不確定的過程進(jìn)行數(shù)學(xué)建模[4]，最終獲得嬰配粉中葉黃素含量的不確定度[5]，為檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性提供更加詳實(shí)的基礎(chǔ)。

1 原理與方法流程

1.1 方法原理

脂肪含量高（脂肪含量以干基計(jì)，不低于3.0%）的食品經(jīng)氫氧化鉀溶液室溫皂化使葉黃素游離后，再以乙醚-正己烷-環(huán)己烷（40∶40∶20，體積比）提取，液相色譜法分離，紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量[6]。樣品在提取與分析過程中，反式結(jié)構(gòu)的葉黃素可能發(fā)生異構(gòu)化，轉(zhuǎn)化為順式葉黃素。對(duì)于轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的順式葉黃素，可通過保留時(shí)間定性、峰面積加合定量。

1.2 操作步驟

準(zhǔn)確稱取2 g（精確至0.01 g）均勻試樣于50.000 mL聚丙烯離心管中，加入約0.2 g二丁基羥基甲苯（BHT）和10.000 mL乙醇，混勻，加入10.000 mL10.0%氫氧化鉀溶液，渦旋振蕩1 min混勻，室溫避光振蕩皂化30 min，以10.000 mL萃取溶劑避光渦旋振蕩提取3 min，4500 r/min離心3 min，重復(fù)提取2 次。合并提取液，以10.000 mL水洗滌，4500 r/min離心3 min分層，重復(fù)洗滌1 次，合并有機(jī)相于室溫減壓濃縮至近干，以0.1% BHT 乙醇溶液渦旋振蕩溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜?.000 mL，過0.45 μm 濾膜，供液相色譜測(cè)定。

液態(tài)奶：準(zhǔn)確稱取10 g（精確至0.01 g）樣品于50.000 mL聚丙烯離心管中，加入約0.2 g BHT和10.000 mL乙醇，混勻，加入2.000 mL20.0%的氫氧化鉀溶液，渦動(dòng)1 min混勻，室溫避光振蕩皂化30 min，以10.000 mL萃取溶劑避光渦旋振蕩提取3 min，4500 r/min離心3 min，重復(fù)提取2 次。合并提取液，以10.000 mL水洗滌，4500 r/min離心3 min分層，重復(fù)洗滌1 次，合并有機(jī)相于室溫減壓濃縮至近干，以0.1%BHT乙醇溶液渦旋振蕩溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜?5.000 mL，過0.45 μm 濾膜，供液相色譜測(cè)定。在操作過程中，需要注意的是，由于葉黃素對(duì)光敏感，除非另行說(shuō)明，所有試驗(yàn)操作應(yīng)在無(wú)500 nm以下紫外光的黃色光源或紅色光源環(huán)境中進(jìn)行。

2 數(shù)學(xué)模型

試樣中葉黃素的含量按下式計(jì)算：

式中：X 為試樣中葉黃素的含量，單位為μg/100 g；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線而得的樣液中標(biāo)準(zhǔn)品的含量，單位為μg/mL；V為樣品最終定容體積，單位為mL；m為稱樣量，單位為g；F為校正系數(shù)。

可通過以下方式獲得：用液相色譜分析試樣溶液，將順式與反式葉黃素色譜峰面積加合作為總峰面積，其中反式葉黃素峰面積除以總峰面積所得值為校正系數(shù)。計(jì)算結(jié)果保留3 位有效數(shù)字。

3 各量值及其不確定度評(píng)定

公式1中的各量值見表1。

表1 量值及其不確定度

用液相色譜法測(cè)定濃度，為了校準(zhǔn)液相色譜儀器，采用葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為20.8575 μg/mL 配制6 種標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度分別為0.3337 μg/mL、0.6674 μg/mL、1.3349 μg/mL、2.0023 μg/mL、2.6698 μg/mL、3.3372 μg/mL。用液相色譜法對(duì)6 種濃度溶液進(jìn)行含量測(cè)定，每個(gè)濃度測(cè)定3 次，結(jié)果見表2。

表2 各濃度下測(cè)量葉黃素含量量值

3.1 濃度的不確定度

濃度的不確定度有兩部分構(gòu)成，一是由于6 種濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液擬合的線性方程求得的濃度時(shí)測(cè)量產(chǎn)生的不確定度；二是由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成6 種濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)所產(chǎn)生對(duì)濃度的測(cè)量帶來(lái)的不確定度。

3.1.1 濃度的線性方程引起的不確定度

根據(jù)表1，數(shù)據(jù)擬合得到如下線性方程：y=0.7108x+0.0180，其中x為溶液含量，y為峰面積比，對(duì)一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行2 次重復(fù)測(cè)量，通過線性方程求得待測(cè)樣品x=1.6426 μg/mL，則x的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為[7]：

式中，n=18（n為標(biāo)準(zhǔn)系列點(diǎn)數(shù)6，重復(fù)次數(shù)3 次）；P 為待測(cè)樣品的重復(fù)測(cè)定次數(shù)，P=2；X為待測(cè)樣品濃度的平均值1.6426 μg/mL（1.6425 μg/mL，1.6427 μg/mL）；C0為標(biāo)準(zhǔn)系列各點(diǎn)濃度的平均值1.7242 μg/mL）；C0i為各標(biāo)準(zhǔn)液濃度；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率0.7108；a為截距0.0180；yi為各標(biāo)準(zhǔn)液的面積比。

根據(jù)以上數(shù)據(jù)，由公式6計(jì)算得U（x）=0.0181 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.1.2 配標(biāo)準(zhǔn)溶液所產(chǎn)生的不確定度

（1）標(biāo)準(zhǔn)品的稱量引入的不確定度

電子天平準(zhǔn)確稱取1.05 mg葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品，所使用天平精密度為0.01 mg，包含因子因此，天平的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）標(biāo)準(zhǔn)品的定容引入的不確定度

配置葉黃素的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液采用的容量瓶在20 ℃時(shí)的體積為50.00 mL，按照《JJG196—2006 常用玻璃量具檢定規(guī)程》的要求，經(jīng)查詢，50.00 mL容量瓶的允差為±0.05 mL，包含因子其標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc（B2）為：

（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程溫度對(duì)容量瓶引入的不確定度

配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中采用的容量瓶已在 25 ℃時(shí)校準(zhǔn)，而實(shí)驗(yàn)室的溫度也控制在（20±5）℃。由溫度波動(dòng)引起的不確定度可通過估算溫度范圍和體積膨脹系數(shù)進(jìn)行計(jì)算，液體的膨脹系數(shù)遠(yuǎn)高于玻璃的膨脹系數(shù)，所以玻璃的膨脹系數(shù)可忽略。標(biāo)準(zhǔn)工作液是用甲醇配制，甲醇的體積膨脹系數(shù)為0.0012 ℃-1，產(chǎn)生的體積變化為：（5010.0012 ℃-1=0.06 mL，則區(qū)間半寬度a2=0.06 mL設(shè)為均勻分布，包含因子工作液配置過程中用到了6 個(gè)10.000 mL容量瓶，（1060.0012 ℃-1=0.072 mL，則區(qū)間半寬度a2=0.072 mL設(shè)為均勻分布，包含因子k=其標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel（B3）為：

（4）標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程移液管引入的不確定度

吸取葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋到標(biāo)準(zhǔn)溶液的過程所用為移液管，吸取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)所選用的1.000 mL（2 次）、2.000 mL（1 次）、5.000 mL（1 次）、10.000 mL（1 次）的移液管來(lái)吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0958 μg/mL，0.1915 μg/mL，0.3831 μg/mL，0.7661 μg/mL，1.5323 μg/mL，1.9153 μg/mL。根據(jù) SGCR-3-535 批次胖肚移液管的校正說(shuō)明書，得到以下規(guī)格移液管的偏差范圍，根據(jù)均勻分布，包含因子移液管量取體積和次數(shù)的不確定度分別見表3、4。

由表3和表4，根據(jù)公式可得：

表3 移液管量取體積的不確定度

表4 移液管量取次數(shù)的不確定度

3.2 質(zhì)量的不確定度

質(zhì)量的不確定度主要有兩個(gè)方面，一是所用天平的不確定度，二是多次測(cè)量引入的不確定度。天平制造商給出了±0.10 mg 的線性分量，該數(shù)值代表了托盤上被稱量的實(shí)際重量與從天平所讀取的數(shù)值的最大差值。線性分量被假設(shè)成矩形分布，換算成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

上述分量必須計(jì)算二次，一次作為空盤，另一次為毛重，因?yàn)槊恳淮畏Q重均為獨(dú)立的觀測(cè)結(jié)果，兩者的線性影響不相關(guān)，因此，由天平引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

稱樣量為2.0000 g，則相對(duì)不確定度為：Urel（m1）=0.0816/2103=0.0000408

對(duì)樣品重復(fù)測(cè)量10 次引入的不確定度為A類分量，區(qū)次測(cè)量結(jié)果分別為2.0002 g，2.0005 g，2.0009 g，2.0004 g，2.0005 g，2.0003 g，2.0008 g，2.0007 g，2.0007 g，2.0002 g。

3.3 結(jié)果的不確定度評(píng)定

在重復(fù)性條件下，對(duì)試樣進(jìn)行了10 次獨(dú)立測(cè)試值（μg/100 g）：

標(biāo)準(zhǔn)偏差S=0.675 μg/100g，則算術(shù)平均值的不確定度為：

由測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)不確定度：

3.4 體積的不確定度評(píng)定

樣品定容采用在20 ℃時(shí)的5.00 mL吸管，按照《JJG 196—2006 常用玻量具檢定規(guī)程》的要求，經(jīng)查詢，5 mL 吸管的允差為±0.025 mL，包含因子 k=其標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc（v）為：

4 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel的計(jì)算：

5 結(jié)論

擴(kuò)展不確定度評(píng)定U c（X）=Urel（X）X=0.012234.3 μg/100g=2.8116 μg/100 g，取置信因子k=2（P約為95.0%）擴(kuò)展不確定度為U擴(kuò)展=kUc（X）=5.62 μg/100g，故當(dāng)多次試驗(yàn)數(shù)據(jù)的所測(cè)樣品中葉黃素結(jié)果為234.30 μg/100g 時(shí)，測(cè)量結(jié)果為：X=（234.30±5.62）μg/100 g。結(jié)論在葉黃素含量測(cè)定過程中，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度引入的相對(duì)不確定度是影響測(cè)量乳粉重葉黃素含量不確定度的主要因素[8]。