蜂房的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

解紅霞，郝偉亮，趙炳聰，賈福群

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑部，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院）

蜂房是胡蜂科昆蟲果馬蜂[polistes olivaceous（DeGeer）]、日本長(zhǎng)腳胡蜂（polistes japonicas saussure）或異腹胡蜂（parapolybia varia fabricius）的巢[1]。目前對(duì)蜂房的研究多集中于化學(xué)成分及藥理作用方面。在中醫(yī)臨床上，蜂房常用于治療肺癌[3，4]、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[5，6]等疾病。姚娓[7]等通過實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了蜂房提取物具有抑制小鼠移植性肝癌H22腫瘤的作用。王輝[8]等以蜂房組合黃芪、蘇木及其他藥材進(jìn)行配伍，發(fā)現(xiàn)其具有抑制乳腺腫瘤EMT6細(xì)胞的作用。但是蜂房的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面，如顯微鑒別及薄層鑒別的文獻(xiàn)報(bào)道甚少，缺乏可靠的參考依據(jù)，并且2020年版《中國(guó)藥典》也僅收載了蜂房的性狀鑒別，未收載顯微、薄層鑒別以及含量測(cè)定方法。因此，本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)蜂房藥材的粉末特征和薄層色譜進(jìn)行觀察，并對(duì)其浸出物含量和沒食子酸含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法快速簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，并建立了蜂房的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，旨在提高蜂房藥材的質(zhì)量控制水平，為蜂房質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10A高效液相色譜儀（日本島津公司），GH0525046C18A色譜柱（250×4.6mm，5μm，北京綠百草科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試藥

蜂房（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，批號(hào)：121265-200301，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院李驍副教授鑒定），薄層層析硅膠（青島海洋化工有限公司，0110428）、羧甲基纖維素鈉（天津威晨化學(xué)試劑科貿(mào)有限公司，20070323）、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，生產(chǎn)批號(hào)110831-200302），蜂房對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：121265-200301），三氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸、甲醇、無水乙醇等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 蜂房的顯微特征

蜂房藥材粉末為灰褐色。光學(xué)顯微鏡下觀察可見蜂的剛毛淺黃色或黃色，散在且碎斷，長(zhǎng)30～100 μm或更長(zhǎng)，有的先端細(xì)尖或呈V型，有的前端細(xì)尖，基部突然膨大呈囊狀，有腔；蜂體壁碎片褐色或淺棕黃色，大小不等，分布散在，部分可見網(wǎng)狀紋理，少量呈魚鱗狀，碎片偶見瘤狀突起；蜂的橫紋肌淺黃色，具有紋理，平直，暗帶較窄；纖維呈絲狀，淺黃色，單個(gè)存在，部分成束；透明條狀物無色，彎曲處有褶皺；植物細(xì)胞偶見（見圖1）。

圖1 蜂房粉末顯微鑒別圖

表2 蜂房熱浸法水浸出物含量

表3 蜂房冷浸法醇浸出物含量

2.2 蜂房的薄層色譜鑒別

2.2.1溶液制備[7]取蜂房藥材粉末3.5 g，20倍體積水加熱回流提取，濾液醇沉，濃縮上清液，加正丁醇萃取?；厥沼袡C(jī)相，甲醇溶解殘?jiān)鳛楣┰嚻啡芤?。取蜂房?duì)照藥材3.5 g，同法制備對(duì)照藥材溶液。取標(biāo)準(zhǔn)品約5.10 mg，精密稱定，制得濃度為1.02 mg·mL-1的對(duì)照品甲醇溶液。

2.2.2薄層色譜分析 吸取蜂房供試品溶液、蜂房對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液各約4～6 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板。三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（5：4：1）展開，取出，晾干，254 nm紫外燈下檢視（見圖2），樣品分離度良好。

圖2 蜂房粉末顯微鑒別圖

2.3 蜂房的浸出物檢查

取供試品，按照水溶性浸出物測(cè)定法和醇溶性浸出物測(cè)定法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2201），分別采用水及乙醇作為浸出溶劑，冷、熱兩種浸出方法比較，測(cè)定結(jié)果（見表1~3）。結(jié)果顯示，以水為浸出溶劑熱浸法下，蜂房藥材浸出物的平均值為14.77%，浸出效率較高。

表1 蜂房冷浸法水浸出物含量

2.4 蜂房的含量測(cè)定

2.4.1對(duì)照品溶液的制備 取標(biāo)準(zhǔn)品1.32 mg，精密稱定，制得濃度為0.264 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液。

2.4.2供試品溶液的制備[8]取蜂房藥材粉末約2.0 g，精密稱定，加入100 mL的50%甲醇溶液，加熱回流提取1 h，放冷，過濾，濾液揮干，加甲醇定容于10 mL容量瓶，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4.3色譜條件依據(jù)查閱文獻(xiàn)及考察結(jié)果，確定色譜條件如下。采用北京綠百草科技發(fā)展有限公司GH0525046 C18A色譜柱（250×4.6 mm，5 μm），柱溫室溫，以甲醇-磷酸二氫鈉緩沖液（pH=3.0）（5：95）為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)273 nm，進(jìn)樣量10 μL。色譜圖（見圖3、4）。

圖3 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液高效液相色譜圖

圖4 蜂房供試品溶液高效液相色譜圖

2.4.4線性關(guān)系考察精密吸取“2.4.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶 液0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL，按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。峰面積為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為Y軸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖5）。沒食子酸線性考察結(jié)果表明，在5.28～47.52 μg·mL-1（R2=0.9993）濃度范圍內(nèi)，其峰面積與濃度的線性關(guān)系良好。

圖5 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4.5精密度試驗(yàn)精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。記錄沒食子酸的色譜峰面積。結(jié)果顯示，沒食子酸峰面積RSD（n=6）為0.33%，精密度良好。

2.4.6穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取供試品溶液10 μL，按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件在0、2、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積RSD（n=6）為1.58%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7重復(fù)性試驗(yàn)取同一批蜂房藥材6份，精密稱定，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得沒食子酸平均含量為1.25 mg·g-1，RSD為1.85%。

2.4.8加樣回收率試驗(yàn)稱取已知含量的“2.4.7”項(xiàng)下蜂房藥材6份，每份約1.0 g，精密稱定。每份分別精密加入沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制成樣品溶液，在“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰的面積。平均回收率測(cè)定結(jié)果（見表4）。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4.9蜂房樣品的含量測(cè)定取蜂房藥材粉末三份，每份約1.0g，精密稱定，按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備成蜂房樣品溶液，在“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算蜂房樣品液中沒食子酸含量（見表5）。

表5 蜂房樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇[9~13]

本實(shí)驗(yàn)分別考察五種流動(dòng)相體系（見表6）。分別按照上述條件等度洗脫后，結(jié)果顯示，pH值為3，配比為5：95的甲醇-磷酸二氫鈉緩沖液作為流動(dòng)相時(shí)色譜峰分離情況較好，故選該體系為流動(dòng)相。

表6 流動(dòng)相條件表

3.2 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

按照《中國(guó)藥典》2015年版三部制劑通則0401制備沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，于200-800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)光譜掃描，在273 nm附近沒食子酸吸光系數(shù)最大且干擾較少，故選擇273 nm作為吸收波長(zhǎng)。

3.3 色譜條件的選擇

色譜條件優(yōu)化時(shí)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，水相中多用的純水相或加有磷酸或乙酸。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水相中加入磷酸二氫鈉且將PH值調(diào)為酸性，分離效果明顯，且基線穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)等度洗脫分離時(shí)間較長(zhǎng)，雜質(zhì)峰分離度較差現(xiàn)象，因此進(jìn)行梯度洗脫。梯度洗脫時(shí)，混合對(duì)照品能很好的分離，但因?yàn)槌跏紳舛炔煌龇逦恢貌煌?，分離效果不同，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)對(duì)比篩選，最終選定以35%有機(jī)相開始進(jìn)行梯度洗脫。

3.4 小結(jié)

本試驗(yàn)對(duì)蜂房的顯微、薄層特征進(jìn)行鑒別，對(duì)其浸出物及沒食子酸含量進(jìn)行了測(cè)定，以期為蜂房的質(zhì)量控制以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供些許幫助。