夏枯草對(duì)食管癌細(xì)胞Survivin和Caspase-3表達(dá)的影響及機(jī)制研究

鄭學(xué)芝 郭冉 李佳 王文婷 張緒東 徐秋玲

摘 要：目的：觀察夏枯草提取物對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞Survivin和Caspase-3基因表達(dá)影響，研究夏枯草抗食管癌作用及其機(jī)制。方法：IC50濃度夏枯草提取物作用于食管癌Eca-109細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，RT-PCR、Western Blotting法檢測(cè)Survivin和Caspase-3基因及蛋白表達(dá)，Annexin-V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：食管癌Eca-109細(xì)胞出現(xiàn)增殖抑制， Survivin表達(dá)減少，Caspase-3表達(dá)增加，細(xì)胞凋亡率增高。結(jié)論：夏枯草可抑制食管癌Eca-109細(xì)胞增殖，抑制Survivin表達(dá)，促進(jìn)Caspase-3表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：夏枯草;食管癌;凋亡;Survivin;Caspase-3

夏枯草具有消炎、抗菌、降血糖、抗病毒、抗腫瘤等藥理學(xué)作用[1]。本實(shí)驗(yàn)研究夏枯草對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞Survivin和Caspase-3基因表達(dá)的影響，探討夏枯抗食管癌作用及機(jī)制，為臨床應(yīng)用夏枯草治療食管癌提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

食管癌Eca-109細(xì)胞系，牡丹江醫(yī)學(xué)院科研中心提供;夏枯草，購自Sigma-Aldrich中國公司;RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、原裝胎牛血清，Gibco公司;順鉑，齊魯制藥廠;RT-PCR試劑盒、Cell Counting Kit-8、GAPDH小鼠單抗，碧云天生物技術(shù)研究所;Annexin-V-FITC/PI凋亡雙染試劑盒，BD公司;兔抗人Survivin抗體、鼠抗人Caspase-3抗體，武漢博士德生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞準(zhǔn)備工作 食管癌Eca-109細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清），置37℃，飽和濕度為5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組情況 共分3組：夏枯草作用組（濃度為IC50，Pr組）、陽性對(duì)照組（加順鉑5 μg/mL，Po組）、空白對(duì)照組（加培養(yǎng)液，Bl組）。

1.2.3 觀察細(xì)胞形態(tài)變化 各組細(xì)胞常規(guī)孵育培養(yǎng)24、48、72 h后，置于倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化情況。

1.2.4 CCK-8法測(cè)定各組細(xì)胞增殖抑制率 在96孔培養(yǎng)板上按照4×105/孔接種各組細(xì)胞，接種3板，每板每組接種12復(fù)孔，加入4個(gè)劑量（0、50、100、200 μg/mL，每個(gè)劑量3復(fù)孔）的夏枯草提取物，分別于接種后24、48、72 h取1板，向待測(cè)孔內(nèi)加入CCK-8試劑10 μL，培養(yǎng)箱孵育1 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值（OD值），每次每組測(cè)定5復(fù)孔。以培養(yǎng)液做空白對(duì)照并調(diào)零，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值，計(jì)算細(xì)胞增值抑制率，進(jìn)一步求出半數(shù)抑制濃度（IC50）。

細(xì)胞增殖抑制率=1-細(xì)胞存活率

即：細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值）×100%

1.2.5 RT-PCR法檢測(cè)Survivin和Caspase-3基因表達(dá)收集常規(guī)培養(yǎng)48 h后的各組細(xì)胞，利用Trizol試劑一步法提取總RNA。按照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參考文獻(xiàn)[2-3]，設(shè)計(jì)Suivivin、Caspase-3、GAPDH引物序列如下：Suivivin基因擴(kuò)增產(chǎn)物約363 bp，上游P1：5′-AGCCCTTTCTCAACGACCAC，下游P2：5′-GCACTTTCTTCGAGTTTCC;Caspase-3基因擴(kuò)增產(chǎn)物約194 bp，上游P1：5′-CGTGTCATAAAATACCAGTGGA，下游P2：5′-AAATTCTGTTGCCACCTTTCG;GAPDH基因擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約280 bp，上游P3：5′-GGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGA，下游P4：5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTGGG。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30次循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠分析系統(tǒng)下成像，測(cè)定各組光密度值。通過Survivin/GAPDH和Caspase-3/GAPDH光密度比值進(jìn)行定量分析。

1.2.6 Western Blotting法檢測(cè)Survivin和Caspase-3蛋白表達(dá) 收集培養(yǎng)48 h后的各組細(xì)胞，加入RIPA裂解緩沖液，進(jìn)行蛋白提取及蛋白定量，SDS-PAGE電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉，兔抗人Survivin抗體、鼠抗人Caspase-3抗體（1∶400）一抗孵育，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗小鼠IgG（1∶400）二抗孵育，ECL反應(yīng)后用quantity one 4.6.2軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組食管癌Eca-109細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，收集濃度為1×106細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液3 mL，按Annexin-V-FITC/PI凋亡試劑盒說明分別處理各組細(xì)胞進(jìn)行雙染，30 min內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0軟件包，進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

倒置顯微鏡下觀察，夏枯草作用組食管癌細(xì)24 h后呈現(xiàn)貼壁不佳現(xiàn)象，細(xì)胞體積縮小;48 h后細(xì)胞數(shù)量減少且大量細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，細(xì)胞膜出現(xiàn)空泡、褶皺，胞漿內(nèi)顆粒增多，胞核染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞固縮成圓形。對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，密集貼壁。

2.2 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定

與空白對(duì)照組相比，夏枯草作用組，陽性對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞均有增殖抑制作用，且呈量效和時(shí)效關(guān)系，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表1）。經(jīng)過 Graph Pad Prism5 軟件計(jì)算得到 48 h IC50=168 μg/mL。

2.3 RT-PCR法檢測(cè)Survivin和Caspase-3基因表達(dá)

夏枯草作用組、陽性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，Survivin基因表達(dá)水平降低，Caspase-3基因表達(dá)水平增高（P<0.01）（圖1 、表2）。

2.4 Western blotting法檢測(cè)Survivin和Caspase-3蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，夏枯草作用組、陽性對(duì)照組Survivin蛋白表達(dá)量減少，Caspase-3蛋白表達(dá)量增多（P<0.01）（圖2、表3）。

2.5 各組細(xì)胞凋亡情況

夏枯草組細(xì)胞凋亡率增高，與空白對(duì)照組相比差異具有顯著性（P<0.01）（表4）。

3 討論

開發(fā)新的、高效低毒的抗腫瘤藥物具有重要臨床意義[4]。腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡失衡、機(jī)體免疫功能處于失穩(wěn)態(tài)有關(guān)[5]，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是目前抗腫瘤中草藥的作用機(jī)制之一。腫瘤細(xì)胞異常增殖的主要原因與細(xì)胞凋亡抑制基因表達(dá)增多，促細(xì)胞凋亡基因表達(dá)減少有關(guān)，Survivin和Caspase-3作為研究的熱門基因，與腫瘤的很多生物學(xué)特性密切相關(guān)，尤其是在腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控中的作用受到廣泛關(guān)注。Survivin在正常人體組織中幾乎不表達(dá)，在絕大多數(shù)惡性腫瘤組織中卻高表達(dá)[6-7]，具有抑制細(xì)胞凋亡作用;Caspase-3是Caspase家族的重要成員之一，是凋亡發(fā)生中的關(guān)鍵控制因素，具有凋亡促進(jìn)作用，使細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段[8]。研究表明，多種抗腫瘤藥物可能是通過調(diào)節(jié)Survivin和Caspase-3基因表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤作用[9]。本研究表明，夏枯草使食管癌細(xì)胞增殖減慢，細(xì)胞中Caspase-3基因表達(dá)量增多，Survivin基因表達(dá)量減少，細(xì)胞凋亡率增多。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷，夏枯草可能通過抑制Survivin基因表達(dá)、促進(jìn)Caspase-3基因表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抑制食管癌細(xì)胞增殖的作用，提示食管癌的異常增殖可能與Survivin和Caspase-3基因表達(dá)失衡有關(guān)，為臨床食管癌中藥輔助治療及靶點(diǎn)確定提供科學(xué)依據(jù)?！?/p>

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Effects and Mechanism of Prunella vulgaris on Expressions of Survivin and Caspase-3 in Esophageal Cancer Cells

ZHENG Xue-zhi1，GUO Ran1，LI Jia2，WANG Wen-ting 1，ZHANG Xu-dong1，XU Qiu-ling1

（1Department of Physiology，Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China;2The Second People’s Hospital of Mudangjiang，Mudanjiang 157011，China）

Abstract：Objective To investigate the effects of Prunella vulgaris on expressions of Survivin and Caspase-3 in Esophageal cancer Eca-109 cells and study the anti-esophageal cancer effect of Prunella vulgaris and its mechanism.Method Esophageal cancer Eca-109 cells were co-cultured with Prunella vulgaris concentration of IC50，the rate of cell proliferation inhibition was detected by CCK-8 assay.The levels of Survivin and Caspase-3 expression were detected by RT-PCR and western blotting，the cells apoptosis ratio were detected by Annexin-V-FITC/PI kit.Result Prunella vulgaris could effectively inhibit esophageal cancer Eca-109 Cells proliferation，reduce the level of Survivin expression and increase the level of Caspase-3 expression，increase rate of apoptosis.Conclusion Prunella vulgaris substantially inhibited esophageal cancer Eca-109 cells proliferation，reduceed the level of Survivin expression，increaseed the level of Caspase-3 expression and induced apoptosis.

Keywords：Prunella vulgaris;esophageal cancer;apoptosis;Survivin;Caspase-3