二甲雙胍抑制PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的影響

牛艷邦，王曉玲，陳晨，任益凡，張海利，董勝利

1.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院普通外科，山西 太原030000；

2.山西省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，山西 太原030012；

3.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤科，山西太原030001

肝臟是人體內(nèi)臟中維持生命的關(guān)鍵器官之一，在體內(nèi)起代謝、解毒、造血以及免疫功能等多種作用，但易受創(chuàng)傷、感染、藥物、自身免疫異常等各種體內(nèi)外致病因素和損傷因子侵襲而引起肝損傷［1］。一直以來(lái)，肝臟疾病始終給人類(lèi)的健康帶來(lái)嚴(yán)重危害，其中急性肝損傷是臨床上常見(jiàn)的對(duì)患者生命造成威脅的疾病之一，由于許多肝細(xì)胞受損，導(dǎo)致肝功能異常，進(jìn)一步可能發(fā)展為急性肝功能衰竭［2］。為了減緩機(jī)體肝臟的進(jìn)一步損傷，臨床上在急性肝損傷早期選擇快速有效的治療藥物意義重大［3］。

二甲雙胍在臨床上廣泛用于治療2型糖尿病，藥效顯著且毒副作用較小、效價(jià)比高［4］。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍在抑制炎癥、抗腫瘤［5-6］、緩解非酒精性脂肪性肝炎癥狀［7］、預(yù)防酒精性肝損傷［8］方面也起到一定作用。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，PI3K-AKTmTOR信號(hào)通路具有免疫協(xié)調(diào)功能［9-10］，而且可平衡抗炎和促炎作用［11-13］，而二甲雙胍可抑制該信號(hào)通路［14］。因此，二甲雙胍在急性肝損傷中可能參與PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。

本研究應(yīng)用二甲雙胍干預(yù)四氯化碳（carbon tetrachloride，CCL4）誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型，研究其能否通過(guò)下調(diào)PI3K蛋白活化，進(jìn)而導(dǎo)致AKT及mTOR蛋白的磷酸化受抑制，從而抑制mTOR活性實(shí)現(xiàn)抗炎作用，通過(guò)組織病理學(xué)，細(xì)胞炎癥因子IL-6、TNFα、IL-10水平，PI3K、AKT、mTOR蛋白及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3、ROR-γt蛋白表達(dá)水平，探討二甲雙胍在小鼠急性肝損傷中的抗炎作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18只SPF級(jí)健康C57BL／6小鼠，雄性，6～8周齡，體重約20 g，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，機(jī)構(gòu)許可證號(hào)：SYXK（晉）2015／0001。本實(shí)驗(yàn)在分子生物學(xué)系動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，給與晝夜12 h光照，每籠6只，給予滅菌處理的飲用水和小鼠飼料，自由哺食。

1.2 主要試劑及儀器CCL4購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；橄欖油購(gòu)自陜西圣瑞醫(yī)藥科技有限公司；鹽酸二甲雙胍片（格華止）購(gòu)自中美上海施貴寶制藥有限公司；TNF-α、IL-6和IL-10 ELISA試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Bosterbio公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertaidTMFirst Strand cDNA Synthesis購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；兔抗人PI3K多克隆抗體、兔抗p-AKT多克隆抗體、兔抗AKT多克隆抗體、兔抗mTOR多克隆抗體和兔抗Foxp3多克隆抗體購(gòu)自萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司；兔抗ROR-γt多克隆抗體、兔抗p-mTOR多克隆抗體和兔抗p-PI3K多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld Techology，Inc；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑（minibioTM）購(gòu)自百奧生物科技有限公司；核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒（KeyGE BioTECH）購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；RT-qPCR試劑盒TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseHPlus）購(gòu)自日本TaKaRa Bio；實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosytems、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（SpectraMaxR iD3）購(gòu)自美國(guó)MOLECULAR DEVICES；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（ChemicDocTMImaging System）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；BECKMAN AU5821全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter，Inc。

1.3 小鼠急性肝損傷模型的建立及分組給藥 將18只C57BL／6小鼠平均分成3組：正常對(duì)照組、模型組、模型+干預(yù)組，每組6只。分別經(jīng)小鼠腹腔注射等量生理鹽水、生理鹽水、二甲雙胍（溶于生理鹽水，按照小鼠體重400 mg／kg劑量給藥）預(yù)處理6 h，隨后將CCL4加入橄欖油中按2∶3配制成混合溶液，按5 mL／kg劑量分別經(jīng)腹腔注射模型組和模型+干預(yù)組小鼠，同時(shí)正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。給藥18 h后，稱(chēng)量各組小鼠體重，用4%水合氯醛麻醉小鼠，摘眼球取血，離心分離上清，將血清置-20℃保存?zhèn)溆?；在無(wú)菌條件下打開(kāi)小鼠腹腔，取出完整肝臟，肉眼觀察肝臟的表觀形態(tài)變化并拍照稱(chēng)重，計(jì)算小鼠肝重體重比；隨機(jī)取部分肝組織置于多聚甲醛固定液中，石蠟包埋肝組織制備切片；將剩余肝組織分裝凍存管中-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 肝組織病理學(xué)觀察 將制備的肝組織切片進(jìn)行HE染色，顯微鏡觀察肝細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、肝小葉等的改變并拍照，分析肝臟組織病理變化。

1.5 血清轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè) 使用BECKMAN AU5821全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST水平。

1.6 肝組織中炎癥因子IL-6、IL-10、TNF-α水平的檢測(cè)

1.6.1 ELISA法 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.6.2 RT-qPCR法 用Trizol試劑提取各組小鼠肝組織總RNA，取1 μL RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；95℃變性60 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。相關(guān)引物序列信息見(jiàn)表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR

1.7 肝組織中PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blot法。取小鼠肝臟組織100 mg，在冰上按照核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取核蛋白、漿蛋白。BCA法測(cè)定總蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)10%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，加入兔抗p-PI3K（1∶1 000稀釋?zhuān)?、PI3K（1∶500稀釋?zhuān)?、p-AKT（1∶1 000稀釋?zhuān)?、AKT（1∶1 000稀釋?zhuān)?、p-mTOR（1∶500稀釋?zhuān)?、mTOR（1∶500稀釋?zhuān)?、Foxp3（1∶500稀釋?zhuān)OR-γt（1∶1 000稀釋?zhuān)┒嗫寺】贵w，4℃孵育過(guò)夜；TBST緩沖液洗膜后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋?zhuān)?，室溫孵? h；TBST緩沖液洗膜3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯影，分析灰度值，計(jì)算各蛋白在肝組織中的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)所有分析數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析比較多組樣本均數(shù)差異，組間數(shù)據(jù)兩兩比較采用LSD-t法，不服從正態(tài)分布數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝臟的形態(tài)學(xué)及肝重體重比變化 與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟顏色灰暗腫脹，質(zhì)地偏硬，肝重體重比明顯升高（F=5.363，P=0.026），提示肝臟出現(xiàn)炎性滲出、水腫；與模型組相比，給予二甲雙胍預(yù)保護(hù)后，肝臟腫脹減輕，肝重體重比明顯下降（F=5.363，P=0.040）。見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 各組小鼠肝臟的表觀形態(tài)Fig.1 Appearance of livers of mice in various groups

圖2 各組小鼠的肝重體重比Fig.2 Ratios of liver weight to body weight of mice in various groups

2.2 小鼠肝臟病理學(xué)改變 正常對(duì)照組小鼠肝臟細(xì)胞排列整齊，組織結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)異常病理學(xué)變化；與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟細(xì)胞核質(zhì)比變大，出現(xiàn)不同程度的氣球樣變及壞死灶，且肝小葉不規(guī)則；與模型組相比，給予二甲雙胍預(yù)保護(hù)后，小鼠肝細(xì)胞氣球樣變和壞死灶明顯減少，肝組織結(jié)構(gòu)較完整。見(jiàn)圖3。

2.3 小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶變化 與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中ALT、AST水平均明顯上升（F分別為16.126和25.568，P均＜0.001）；而給予二甲雙胍預(yù)保護(hù)后，小鼠血清ALT和AST水平均明顯下降（F分別為16.126和25.568，P分別為0.007和0.006）。見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠血清中ALT（A）和AST（B）水平Fig.4 ALT（A）and AST（B）levels in sera of mice in various groups

2.4 小鼠肝組織中炎癥因子IL-6、IL-10、TNF-α水平的變化

2.4.1 ELISA法 與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織勻漿中IL-6、IL-10、TNF-α的水平均明顯升高（F分別為92.88、165.1和115.6，P均＜0.001）；給予二甲雙胍預(yù)保護(hù)后，小鼠肝組織勻漿中IL-6、TNF-α的水平明顯降低（F分別為92.88和115.6，P均＜0.05），IL-10水平明顯升高（F=165.1，P=0.020）。見(jiàn)圖5。

圖5 各組小鼠肝組織勻漿中IL-6（A）、IL-10（B）和TNFα（C）水平Fig.5 IL-6（A），IL-10（B）and TNF-α（C）levels in liver tissue homogenate of mice in various groups

2.4.2 RT-qPCR法 與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織中IL-6和TNF-α基因mRNA水平明顯升高（F分別為8.012和9.878，P分別為0.004和0.0014），IL-10基因mRNA水平也升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.15，P=0.127）；給予二甲雙胍預(yù)保護(hù)后，小鼠肝組織中IL-6和TNF-α基因mRNA水平顯著下降（F分別為8.012和9.878，P分別為0.042和0.036），而IL-10基因mRNA水平更高（F=21.15，P=0.015）。見(jiàn)圖6。

圖3各組小鼠的肝組織病理觀察（HE染色）Fig.3 Histopathological examination of livers of mice in various groups（HE staining）

圖6 各組小鼠肝組織中IL-6（A）、IL-10（B）和TNF-α（C）基因mRNA水平Fig.6 IL-6（A），IL-10（B）and TNF-α（C）mRNA levels in liver tissue of mice in various groups

2.5小鼠肝組織中PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化 與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、ROR-γt、Foxp3蛋白的表達(dá)量均顯著升高（F分別為16.08、9.208、7.888、20.07和22.08，P＜0.05）；給予二甲雙胍預(yù)保護(hù)后，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、ROR-γt蛋白的表達(dá)量均有不同程度的降低（F分別為16.08、9.208、7.888和20.07，P＜0.05），而Foxp3蛋白的表達(dá)水平仍上升（F=22.08，P＜0.05）。見(jiàn)圖7和圖8。

圖7 Western blot法分析各組小鼠肝組織中PI3K-AktmTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.7 Western blotting of expression of PI3K-Akt-mTOR signaling pathway-associated proteins in liver tissue of mice in various groups

圖8 各組小鼠肝組織中PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.8 Expression of PI3K-Akt-mTOR signaling pathway-associated proteins in liver tissue of mice in various groups

3 討論

急性肝損傷主要是由有毒化學(xué)物質(zhì)、藥物、病毒和細(xì)菌等多種因素造成的肝功能異常［15］，其中CCL4作為一種細(xì)胞毒性物質(zhì)，誘導(dǎo)的肝損傷為經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)研究模型，是目前最常用的急性肝損傷模型之一。

PI3K-Akt-mTOR通路在細(xì)胞中參與多種功能活動(dòng)。PI3K為一種細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，研究發(fā)現(xiàn)，在Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）介導(dǎo)的炎癥發(fā)生時(shí)抑制PI3K信號(hào)，可抑制巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞促炎因子的分泌以及增加抗炎因子IL-10的分泌［13］。AKT也稱(chēng)蛋白激酶B，為PI3K下游重要的效應(yīng)物。PI3K轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)可通過(guò)激活A(yù)kt下游的NFκB促進(jìn)促炎細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-6）表達(dá)［13］。mTOR為一類(lèi)絲氨酸／蘇氨酸激酶，可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖分化、凋亡等方面發(fā)揮重要作用，另外，mTOR還可以通過(guò)影響T細(xì)胞分化調(diào)節(jié)免疫。研究發(fā)現(xiàn)，抑制mTOR蛋白表達(dá)可抑制CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)h17細(xì)胞，同時(shí)可以增強(qiáng)Treg細(xì)胞的生成［16-17］。目前，mTOR被廣泛認(rèn)為是參與Treg細(xì)胞分化與增殖的負(fù)性調(diào)控因子，因此，抑制PI3K／Akt／mTOR通路可促使Treg／Th17平衡向免疫耐受方向轉(zhuǎn)變。

Th17細(xì)胞為一種能夠加重炎癥反應(yīng)的受轉(zhuǎn)錄因子（ROR-γt）調(diào)控的特異性CD4+T細(xì)胞［18-19］，Treg細(xì)胞為一種具有免疫抑制作用的受轉(zhuǎn)錄因子叉狀頭盒P3（Foxp3）調(diào)控的CD4+T細(xì)胞亞群，通過(guò)釋放IL-10和TGF-β減輕炎癥反應(yīng)［20-21］。ROR-γt和Foxp3作為主要的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子，分別在Th17和Treg細(xì)胞內(nèi)特異性高表達(dá)。

本研究首先觀察小鼠肝臟的形態(tài)學(xué)、組織病理學(xué)變化，初步評(píng)估小鼠肝臟的受損程度。與模型組相比，給予二甲雙胍預(yù)保護(hù)可顯著改善肝臟的光澤，減少肝細(xì)胞氣球樣變性及灶狀壞死，其肝細(xì)胞、肝索排列較整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，表明二甲雙胍對(duì)CCL4誘導(dǎo)的急性肝損傷具有一定的緩解作用。

一般情況下，肝臟發(fā)生病變肝細(xì)胞受損時(shí)，存在于肝細(xì)胞內(nèi)的血清轉(zhuǎn)氨酶會(huì)被釋放到血液中，轉(zhuǎn)氨酶的升高程度常與肝細(xì)胞損傷一致。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔注射CCL4 18 h后，可引起血清轉(zhuǎn)氨酶上升，而給予二甲雙胍預(yù)保護(hù)處理，小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶濃度明顯低于模型組。因此，通過(guò)小鼠肝臟形態(tài)學(xué)、組織病理學(xué)及血清學(xué)變化得知，二甲雙胍對(duì)CCL4誘導(dǎo)的急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

當(dāng)肝臟發(fā)生急性肝損傷時(shí)，會(huì)發(fā)生炎癥反應(yīng)產(chǎn)生并釋放炎癥因子，過(guò)度炎癥反應(yīng)會(huì)促進(jìn)肝細(xì)胞損傷壞死，肝功能發(fā)生紊亂［22］。本研究通過(guò)測(cè)定小鼠肝組織中炎性因子的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，小鼠腹腔注射CCL4 18 h后，IL-6、TNF-α、IL-10表達(dá)水平都均升高；而經(jīng)二甲雙胍預(yù)保護(hù)6 h，小鼠體內(nèi)的IL-6、TNF-α的表達(dá)水平明顯下降，而IL-10表達(dá)水平更高，表明二甲雙胍可有效抑制小鼠急性肝損傷的炎癥。

為明確PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路參與急性肝損傷的炎癥反應(yīng)，本研究通過(guò)Western blot檢測(cè)小鼠肝組織中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、Foxp3及ROR-γt的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，小鼠腹腔注射CCL4可顯著引起PI3K-AktmTOR信號(hào)通路的磷酸化，給予二甲雙胍預(yù)保護(hù)6 h，PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路的磷酸化受到一定抑制，表明二甲雙胍可通過(guò)抑制PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路對(duì)急性肝損傷起到保護(hù)作用。同時(shí)，F(xiàn)oxp3及ROR-γt表達(dá)水平的變化表明抑制PI3K／Akt／mTOR通路可促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，同時(shí)抑制Th17細(xì)胞生成，調(diào)節(jié)肝組織的免疫反應(yīng)。

綜上所述，二甲雙胍可通過(guò)抑制PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，從而減輕CCL4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷，對(duì)小鼠肝臟起到一定的保護(hù)作用，為研究二甲雙胍減輕急性肝損傷的作用機(jī)制及臨床治療提供了一種新的思路。但PI3K／Akt／mTOR信號(hào)通路在二甲雙胍改善急性肝損傷過(guò)程中不是唯一途徑，相關(guān)通路機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。