無血清懸浮培養(yǎng)MDCK-siat7e細胞的傳代穩(wěn)定性

張生琰，吳元元，孫燕，劉鵬，孫振鵬，王革，李薇

蘭州生物制品研究所有限責任公司中試研究室

甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730046

犬腎上皮（Madin-Darby canine kidney，MDCK）細胞MDCK-siat7e是將人siat7e基因轉(zhuǎn)染MDCK細胞后，經(jīng)懸浮馴化所獲得的適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的哺乳動物細胞系。MDCK-siat7e細胞克服了貼壁細胞規(guī)?；囵B(yǎng)困難、操作復(fù)雜、難以放大的缺點，能夠用于疫苗的研發(fā)及生產(chǎn)［1］。蘭州生物制品研究所有限責任公司應(yīng)用無血清無蛋白培養(yǎng)基cellhappy BD001（簡稱BD001）培養(yǎng)MDCK-siat7e細胞，在優(yōu)化培養(yǎng)工藝的基礎(chǔ)上能夠獲得理想的細胞密度，有望用于流感疫苗的研發(fā)及生產(chǎn)［2］。MDCK-siat7e細胞在傳代培養(yǎng)的過程中有目的基因丟失的風險，這勢必會造成細胞種群異質(zhì)性的發(fā)生，使得細胞種群與起始細胞種群間存在差異，影響流感病毒在細胞上的易感性，另外還有成瘤性和致瘤性發(fā)生的風險，影響流感疫苗的研發(fā)［3］。因此，MDCK-siat7e細胞如用于大規(guī)模流感疫苗生產(chǎn)，需建立穩(wěn)定的MDCKsiat7e細胞系，確定MDCK-siat7e細胞培養(yǎng)代次，才能為MDCK-siat7e細胞從搖瓶放大培養(yǎng)至規(guī)?；a(chǎn)提供依據(jù)，但目前相關(guān)MDCK-siat7e細胞傳代穩(wěn)定性方面的研究較少。

本研究從細胞形態(tài)、生長曲線、生長代謝、siat7e基因表達量、成瘤性和致瘤性等方面進行了MDCKsiat7e細胞的傳代穩(wěn)定性研究，以期為MDCK-siat7e穩(wěn)定細胞系的建立及MDCK-siat7e細胞在規(guī)?；糯笾写蔚拇_立提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞MDCK-siat7e細胞由美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）惠贈，由蘭州生物制品研究所第六研究室經(jīng)搖瓶馴化無血清懸浮培養(yǎng)后，建立細胞庫。

1.2 主要試劑及儀器 無血清無蛋白培養(yǎng)基cellhappy BD001（簡稱BD001）購自甘肅健順生物科技有限公司；One Step SYBR PrimeScript RT-PCR kit購自日本TaKaRa公司；RNeasy Mini kit購自美國Qiagen公司；7500 Real time PCR system購自美國ABI公司；Bioprofile 400生化分析儀購自美國Nova Biomedical公司；CASY細胞計數(shù)分析儀購自德國INNOVATIS公司。

1.3 MDCK-siat7e細胞的傳代培養(yǎng) 復(fù)蘇工作細胞庫細胞，檢測細胞活率＞95%時，按（0.8~1）×106個／mL接種至三角搖瓶，即為0代細胞，置37℃，5% CO2，20 r／min條件下培養(yǎng)。每日取樣檢測細胞密度及活率，每隔3~4 d傳代1次，連續(xù)傳代獲得7、17、28及45代細胞。

1.4 不同代次MDCK-siat7e細胞的生長狀況觀察及生長曲線繪制 將0、7、17、28及45代MDCK-siat7e細胞在BD001培養(yǎng)基中按接種密度（0.7~1）×106個／mL進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37℃，5% CO2濃度。連續(xù)培養(yǎng)9 d，培養(yǎng)期間不再添加培養(yǎng)基。每日取樣計數(shù)并檢測細胞活率。培養(yǎng)4 d時取樣，于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，包括細胞形態(tài)、大小均勻性、是否聚團等。以培養(yǎng)時間為橫坐標，活細胞數(shù)為縱坐標，繪制生長曲線。

1.5 不同代次MDCK-siat7e細胞各生長指標及生化指標的比較 計算并比較0、7、17、28及45代MDCKsiat7e細胞的比生長速率（μ）、葡萄糖比消耗率［Qi（Gluc）24h］、乳酸比生成率［Qi（Lac）24h］及氨比生成率［Qi（NH4+）24h］。

1.6 45代MDCK-siat7e細胞的成瘤性及致瘤性檢測 委托中國食品藥品檢定研究院進行45代MDCKsiat7e細胞的成瘤性和致瘤性檢測。依據(jù)《中國藥典》三部（2015版）中《生物制品生產(chǎn)檢定用動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程》中相關(guān)規(guī)定，采用裸鼠體內(nèi)接種法檢測MDCK-siat7e細胞的成瘤性；采用細胞裂解物裸鼠體內(nèi)接種法和細胞DNA裸鼠體內(nèi)接種法檢測MDCK-siat7e細胞的致瘤性。

1.7 不同代次MDCK-siat7e細胞中siat7e基因表達量的比較 采用qRT-PCR法，具體參考文獻［4］進行。取細胞密度為1×106個／mL、細胞活率＞95%的0、7、17、28及45代MDCK-siat7e細胞，用RNeasy Mini kit提取細胞總RNA，檢測提取RNA的純度及濃度，-80℃凍存?zhèn)溆?。上游引物序列?′-ATGAAGACCCTGCGCC-3′，下游引物序列：5′-TTAGAACACAGGTTTATTCTCAGG-3′，擴增片段大小為1 010 bp。引物設(shè)計及合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。以不同代次的MDCK-siat7e細胞同一濃度的RNA為模板，采用One Step SYBR PrimeScript RTPCR kit檢測siat7e基因表達量。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸10 s，共35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。以DEPC水為空白，GAPDH基因作為內(nèi)參基因，采用△△Ct法按下式計算各代次細胞中siat7e基因表達量的相對倍數(shù)，即目的基因的量（2-△△Ct）。

△△Ct=（實驗組目的基因Ct-實驗組內(nèi)參基因Ct）-（對照組目的基因Ct-對照組內(nèi)參基因Ct）

1.8 細胞計數(shù)及細胞活率檢測 應(yīng)用CASY細胞計數(shù)分析儀進行細胞計數(shù)。按下式計算細胞比生長速率（μ），即細胞生長速率與培養(yǎng)基中細胞密度之比［5］。

式中t為培養(yǎng)時間（d），tn和tn+1分別表示試驗開始和結(jié)束時間（d）；μtn+1為細胞在tn+1時刻的比生長速率（d-1）；Xtn和Xtn+1分別為tn和tn+1時刻的活細胞密度（個／mL）。

1.9 葡萄糖、乳酸、氨含量檢測 應(yīng)用生化分析儀進行檢測。計算營養(yǎng)物（葡萄糖）的比消耗率［Qi（Gluc）24h］和副產(chǎn)物乳酸［Qi（Lac）24h］和氨的比生成率［Qi（NH4+）24h］［6］。

營養(yǎng)物（葡萄糖）的比消耗率，表示單位細胞在單位時間內(nèi)消耗的營養(yǎng)物的量，按下式計算。

式中P表示營養(yǎng)物；CP表示營養(yǎng)物濃度（mmol／L），Cp，tn和Cp，tn+1分別為tn和tn+1時刻營養(yǎng)物濃度（mmol／L）；Qp，tn+1表示在tn+1時刻營養(yǎng)物的比消耗速率［mmol／（L·h）］。

副產(chǎn)物（乳酸、氨）的比生成速率，表示單位細胞在單位時間內(nèi)生成的代謝副產(chǎn)物的量，按下式計算。

式中P表示副產(chǎn)物；CP表示副產(chǎn)物濃度（mmol／L），Cp，tn+1和Cp，tn分別為tn和tn+1時刻副產(chǎn)物濃度（mmol／L）；Qp，tn+1表示在tn+1時刻副產(chǎn)物的比生成速率［mmol／（L·h）］。

1.10 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用F檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同代次MDCK-siat7e細胞的形態(tài)觀察 顯微鏡下觀察顯示，5個不同代次的MDCK-siat7e細胞均呈圓形，細胞邊緣清晰，細胞均勻分散于培養(yǎng)液中，無聚團現(xiàn)象，呈懸浮生長狀態(tài)，生長狀態(tài)良好。見圖1。

圖1 不同代次MDCK-siat7e細胞的形態(tài)觀察（×40）Fig.1 Morphologies of MDCK-siat7e cells of various passages（×40）

2.2 不同代次MDCK-siat7e細胞生長曲線的比較0、7、17、28及45代MDCK-siat7e細胞按相同密度接種后，經(jīng)1~2 h的停滯期后進入快速生長期，細胞在培養(yǎng)基中懸浮增殖，以指數(shù)方式生長，細胞濃度達6.5×106個／mL，呈極高的活力，存活率至少為95%，細胞培養(yǎng)后期仍呈單個懸浮生長狀況，生長至后期細胞活率逐漸下降。見圖2和圖3。

圖2 不同代次MDCK-siat7e細胞的增殖曲線Fig.2 Growth curve of MDCK-siat7e cells of various passages

圖3 不同代次MDCK-siat7e細胞的活率Fig.3 Survival rates of MDCK-siat7e cells of various passages

2.3 不同代次MDCK-siat7e細胞各生長指標及生化指標的比較 不同代次MDCK-siat7e細胞的μ、Qi（Gluc）24h、Qi（Lac）24h及Qi（NH4+）24h差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

表1 不同代次MDCK-siat7e細胞各生長指標和生化指標（±s，n=9）Tab.1 Growth and biochemical indexes of MDCK-siat7e cells of various passages（±s，n=9）

表1 不同代次MDCK-siat7e細胞各生長指標和生化指標（±s，n=9）Tab.1 Growth and biochemical indexes of MDCK-siat7e cells of various passages（±s，n=9）

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2.4 45代MDCK-siat7e細胞的成瘤性和致瘤性裸鼠體內(nèi)接種法成瘤性檢測結(jié)果顯示，10只裸鼠中有1只裸鼠的肺部可見0.2 cm×0.2 cm結(jié)節(jié)，心、肝、脾、腎、淋巴結(jié)等其余主要臟器未見結(jié)節(jié)，其余9只裸鼠心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)等主要臟器未見結(jié)節(jié)；10只裸鼠中僅1只裸鼠肺組織可見轉(zhuǎn)移瘤，瘤組織結(jié)構(gòu)及細胞形態(tài)清晰，細胞異型性明顯，局部區(qū)域可見瘤栓形成，與陰性對照相比，該只裸鼠心、肝、脾、腎、淋巴結(jié)病理改變無明顯差異；其余9只裸鼠與陰性對照相比，心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)病理改變無明顯差異。

細胞裂解物裸鼠體內(nèi)接種法和細胞DNA裸鼠體內(nèi)接種法致瘤性檢測結(jié)果顯示，裸鼠心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)等主要臟器未見結(jié)節(jié)，且與陰性對照相比，心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)組織病理改變無明顯差異。

2.5 不同代次MDCK-siat7e細胞中siat7e基因表達量 不同代次MDCK-siat7e細胞siat7e基因表達量差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

表2 不同代次MDCK-siat7e細胞siat7e基因表達量的比較（±s，n=3）Tab.2 Expression levels of siat7e gene in MDCK-siat7e cells of various passages（±s，n=3）

表2 不同代次MDCK-siat7e細胞siat7e基因表達量的比較（±s，n=3）Tab.2 Expression levels of siat7e gene in MDCK-siat7e cells of various passages（±s，n=3）

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3 討論

MDCK細胞是常見的哺乳動物細胞系，廣泛用于人用和獸用疫苗的研發(fā)及生產(chǎn)，具有培養(yǎng)簡單、增殖速度快、易感病毒、病毒產(chǎn)量高的特點，其在流感疫苗的研發(fā)中擴增的流感病毒與原始流感病毒株高度相似，且免疫效果相近［7］。siat7e基因編碼α-2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶，調(diào)控細胞的貼壁性，其表達水平越高，細胞黏附性越低［8］。人siat7e基因轉(zhuǎn)染MDCK細胞，經(jīng)過懸浮馴化后獲得MDCK-siat7e細胞系，應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模懸浮培養(yǎng)有望成為疫苗生產(chǎn)的細胞基質(zhì)［9］。蘭州生物制品研究所有限責任公司應(yīng)用無血清無蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK-siat7e細胞，該培養(yǎng)基無動物源性成分，培養(yǎng)基成分明確，消除了動物源性成分在細胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的不確定性，也明顯減輕了下游純化工藝的負擔，有助于最終產(chǎn)品質(zhì)量的提高［10］。

在前期研究中，蘭州生物制品研究所有限責任公司已能夠應(yīng)用無血清無蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCKsiat7e細胞用于流感疫苗的研發(fā)，且獲得了較高的細胞密度，而MDCK-siat7e細胞在無血清無蛋白培養(yǎng)基中傳代穩(wěn)定性方面的研究尚缺乏研究數(shù)據(jù)。《中國藥典》三部（2015版）中《生物制品生產(chǎn)檢定用動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程》中明確規(guī)定，要對人用生物制品生產(chǎn)／檢定用的動物細胞基質(zhì)進行穩(wěn)定性檢查［11］。MDCK-siat7e細胞株的穩(wěn)定性在工業(yè)化生產(chǎn)中對產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性具有重要作用［12］。因此，本文開展了MDCK-siat7e細胞的傳代穩(wěn)定性研究。

本研究結(jié)果顯示，0、7、17、28及45代MDCKsiat7e細胞在培養(yǎng)4 d時均呈圓形，細胞邊緣清晰，均勻分散于培養(yǎng)液中，無聚團現(xiàn)象，呈懸浮生長狀態(tài)，生長狀態(tài)良好。5個不同代次細胞均按照相同密度接種，經(jīng)過1~2 h停滯期后均進入快速生長期，整個培養(yǎng)過程中細胞生長曲線和活率、μ均有較好的吻合，無明顯變化；培養(yǎng)過程中細胞代謝指標Qi（Gluc）24h、Qi（Lac）24h及Qi（NH4+）24h也無明顯差異。不同代次MDCK-siat7e細胞的siat7e基因表達量也無明顯差異。MDCK-siat7e細胞連續(xù)傳代至45代后無致瘤性，但有成瘤性的風險。

綜上所述，MDCK-siat7e細胞的傳代穩(wěn)定性較好，在規(guī)?；糯笈囵B(yǎng)中即使細胞代次有大的變化，但只要在45代范圍內(nèi)，細胞傳代穩(wěn)定性均良好。本研究為流感疫苗的開發(fā)、規(guī)模放大、制定細胞傳代限定代次等提供了參考，但需要關(guān)注高代次細胞成瘤性的風險。