腸道病毒71型滅活疫苗體外和體內(nèi)相對效力試驗的相關(guān)性

周振歆，易力，張晗，趙勇，楊驕雪，王丹丹，苗睿，張玉平，董少忠

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明650031

腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）是導(dǎo)致兒童及嬰幼兒手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）重癥和死亡病例的主要病原體［1-2］。過去40余年，HFMD在歐洲、美洲及亞太地區(qū)暴發(fā)流行，2008—2014年間，我國兒童HFMD患者超過1 200萬例，死亡約3 200例，對兒童及嬰幼兒生命健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅［3-5］。由于尚無明確治療HFMD的藥物上市，疫苗仍是控制HFMD流行的主要手段［6-7］。EV71滅活疫苗自2015在中國獲批上市，顯示出良好的有效性及安全性［8-10］，保護率達90%以上，且免疫后第2年保護力仍較高［11-12］。

根據(jù)國家藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)的企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)，EV71滅活疫苗的效力試驗包括體外相對效力試驗和體內(nèi)效力試驗，體外相對效力試驗為抗原含量測定，體內(nèi)效力試驗包括ED50效力試驗和中和抗體效價測定。體內(nèi)相對效力試驗操作周期長，檢測結(jié)果受試驗動物個體差異的影響較大，且受動物倫理的約束，因此，用簡便有效的體外相對效力試驗替代體內(nèi)相對效力試驗顯得尤為重要，建立替代方法的基礎(chǔ)是疫苗生物活性成分含量與免疫效果是否具有相關(guān)性［13］。本實驗以EV71滅活疫苗上市以后一個自然年內(nèi)生產(chǎn)的62批EV71滅活疫苗成品為研究對象，對其進行抗原含量、半效稀釋倍數(shù)、ED50效力、中和抗體效價檢測，并對抗原含量與半效稀釋倍數(shù)、抗原含量與ED50效力、抗原含量與中和抗體效價、ED50效力與中和抗體效價之間的相關(guān)性進行評價。

1 材料與方法

1.1 供試品及標(biāo)準(zhǔn)品 供試品為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所EV71滅活疫苗上市以后一個自然年內(nèi)生產(chǎn)的62批EV71滅活疫苗成品（完成企業(yè)自檢，并取得批簽發(fā)合格證）；EV71抗原標(biāo)準(zhǔn)品由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 細(xì)胞及病毒RD細(xì)胞購自ATCC；EV71 FY-523毒株由中國食品藥品檢定研究院提供；EV71滅活病毒液由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所制備。

1.3 主要試劑TritonX-100、二乙醇胺及0.05%的聚山梨酯20購自美國Sigma公司；顯色A液（TMB溶液）、B液（醋酸緩沖液）購自美國Seracare-KPL公司；酶結(jié)合物（親和素標(biāo)記的HRP）購自美國Thermo Fisher公司；EV71抗原檢測板（包被兔抗EV71多克隆抗體）、生物素標(biāo)記的EV71抗體、PBS（0.01 mol／L，pH 7.4±0.2）、2 mol／L H2SO4及0.35 mg／mL Al（OH）3均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所制備。

1.4 實驗動物SPF級BALB／c小鼠，35～42日齡，體重18～22 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供，動物生產(chǎn)許可證號為：SCXK（滇）K2014-0002。

1.5 抗原含量的檢測 用PBS對標(biāo)準(zhǔn)品和解離后的供試品（采用TritonX-100和二乙醇胺對供試品進行解離）進行2倍系列稀釋，取5～8個稀釋度，加入至EV71抗原檢測板，每個稀釋度設(shè)2個復(fù)孔，100 μL／孔，同時設(shè)陽性對照（EV71滅活病毒液）、陰性對照（PBS）及空白對照，（37±1）℃孵育1 h；洗滌液（含0.05%聚山梨酯20的PBS）洗滌5次，加入生物素標(biāo)記的EV71抗體，100 μL／孔，（37±1）℃孵育1 h；洗滌液洗滌5次，加入顯色液A、B液，均50 μL／孔，37℃避光顯色10 min；加入終止液（2 mol／L H2SO4），50 μL／孔，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測A450值。采用量反應(yīng)平行線測定法計算抗原含量［14］，單位以U／mL進行統(tǒng)計。

1.6 ED50效力試驗 用0.35 mg／mL Al（OH）3將供試品分別按1∶16、1∶32、1∶64稀釋，經(jīng)腹腔接種小鼠，1.0mL／只，每個稀釋度10只，接種28 d，經(jīng)眼球或心臟采血，分離血清。將血清稀釋為1∶4～1∶16，加入EV71 FY-523，50 μL／孔（劑量為100 CCID50／孔），同時設(shè)細(xì)胞對照（100 μL稀釋液）、血清對照（50 μL供試品血清+50 μL稀釋液）和病毒對照（50 μL EV71 FY-523+50 μL稀釋液），均設(shè)2個復(fù)孔，37℃中和2 h；加入RD細(xì)胞懸液，100 μL／孔，（37±0.5）℃培養(yǎng)7 d。以1∶8血清稀釋度供試品孔細(xì)胞未發(fā)生病變判為EV71中和抗體陽性，并按下式（Reed-Muench法）計算半效稀釋倍數(shù)，ED50效力為抗原含量與半效稀釋倍數(shù)的比值，單位以U／mL統(tǒng)計。

半效稀釋倍數(shù)=lg-1［lg大于50%陽轉(zhuǎn)率稀釋度+（大于50%陽轉(zhuǎn)率-50%）／（大于50%陽轉(zhuǎn)率-小于50%陽轉(zhuǎn)率）×lg2］

1.7 中和抗體效價的檢測 將原倍供試品經(jīng)腹腔注射小鼠，0.5 mL／只，接種后28 d，經(jīng)眼球或心臟采血，分離血清。將抗體稀釋為1∶4～1∶512，其他檢測步驟同1.6項。以1∶8血清稀釋度供試品孔細(xì)胞未發(fā)生病變判為EV71中和抗體陽性，反之判為陰性，計算中和抗體GMT值，以GMT值除以8作為1個效力單位，單位以EU統(tǒng)計。

1.8 相關(guān)性分析 將62批EV71滅活疫苗的抗原含量與半效稀釋倍數(shù)、ED50效力、中和抗體效價進行相關(guān)性分析；同時，將62批EV71滅活疫苗的ED50效力與中和抗體效價進行相關(guān)性分析。應(yīng)用SPSS 20軟件統(tǒng)計抗原含量、半效稀釋倍數(shù)、ED50效力、中和抗體效價的正態(tài)分布情況，再進行Pearson相關(guān)性檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并繪制相關(guān)性散點圖。

2 結(jié)果

2.1 抗原含量、半效稀釋倍數(shù)、ED50效力、中和抗體效價的檢測62批EV71滅活疫苗成品抗原含量、半效稀釋倍數(shù)、ED50效力、中和抗體效價檢測結(jié)果均服從正態(tài)分布。抗原含量為200～320 U／mL，均值為248.645U／mL，標(biāo)準(zhǔn)差為26.530 0 U／mL；半效稀釋倍數(shù)為13.8～26.7，均值為18.960，標(biāo)準(zhǔn)差為2.521 1；ED50效力為5.1～7.8 U／mL，均值為6.606 U／mL，標(biāo)準(zhǔn)差為0.608 4 EU；中和抗體效價為3.5～7.4 EU，均值為5.345 EU、標(biāo)準(zhǔn)差為0.883 5 EU。

2.2 相關(guān)性分析

2.2.1 抗原含量與半效稀釋倍數(shù)的相關(guān)性62批EV71滅活疫苗抗原含量與半效稀釋倍數(shù)呈良好正相關(guān)（r=0.711，P＜0.01），見圖1。

圖1 EV71滅活疫苗抗原含量與半效稀釋倍數(shù)相關(guān)性的散點圖Fig.1 Scatter diagram of antigen content and median effective dilution factor of inactivated EV71 vaccine

2.2.2 抗原含量與ED50效力的相關(guān)性62批EV71滅活疫苗抗原含量與ED50效力無相關(guān)性（r=0.131，P＞0.05），見圖2。

圖2 EV71滅活疫苗抗原含量與ED50效力相關(guān)性的散點圖Fig.2 Scatter diagram of antigen content and ED50 potency of inactivated EV71 vaccine

2.2.3 抗原含量與中和抗體效價的相關(guān)性62批EV71滅活疫苗抗原含量與中和抗體效價呈良好正相關(guān)（r=0.388，P＜0.01），見圖3。

圖3 EV71滅活疫苗抗原含量與中和抗體效價相關(guān)性的散點圖Fig.3 Scatter diagram of antigen content and neutralizing antibody titer of inactivated EV71 vaccine

2.2.4 ED50效力與中和抗體效價的相關(guān)性62批EV71滅活疫苗ED50效力與中和抗體效價呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.356，P＜0.01），見圖4。

圖4 EV71滅活疫苗ED50效力與中和抗體效價相關(guān)性的散點圖Fig.4 Scatter diagram of ED50 potency and neutralizing antibody titer of inactivated EV71 vaccine

3 討論

體外和體內(nèi)相對效力試驗均可用于疫苗效力檢測。體外相對效力試驗具有靈敏、特異、快捷、準(zhǔn)確等特點；體內(nèi)效力檢測需使用動物進行試驗，其檢驗時間較長，易受動物的種屬、窩別、年齡、性別、體重、健康狀況、飼養(yǎng)營養(yǎng)及飼料環(huán)境等影響。根據(jù)WHO及國際生物制品標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會要求，盡量不使用動物法進行生物制品質(zhì)量檢定［15］，《中國藥典》三部（2005版）［16］也規(guī)定，應(yīng)盡量采用準(zhǔn)確可靠的化學(xué)、物理學(xué)或細(xì)胞學(xué)方法取代動物試驗進行生物制品質(zhì)量檢定，以減少采用動物進行試驗，該版《中國藥典》開始將重組酵母乙肝疫苗的體外抗原檢測替代體內(nèi)抗體檢測作為疫苗效價指標(biāo)。有研究基于同原理建立了滅活甲肝疫苗體外效力檢測方法［17］，并收錄至2005年后的各版《中國藥典》中。因此，用體外相對效力試驗代替動物體內(nèi)效力試驗是必然趨勢［17］。

劉建生等［18］研究顯示，抗原免疫劑量與半效稀釋倍數(shù)之間存在良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，半效稀釋倍數(shù)與抗原免疫劑量呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，62批EV71滅活疫苗的抗原含量與半效稀釋倍數(shù)呈良好正相關(guān)（P＜0.01）。二者結(jié)論相符，即抗原含量越高，其半效稀釋倍數(shù)越大；抗原含量越低，其半效稀釋倍數(shù)越小。但抗原含量變化的幅度或倍數(shù)與半效稀釋倍數(shù)變化的幅度或倍數(shù)并非完全一致，半效稀釋倍數(shù)的結(jié)果受試驗過程中單只或少數(shù)實驗動物質(zhì)量、敏感性波動的影響較大，ED50效力為抗原含量與半效稀釋倍數(shù)的比值，因此，抗原含量與ED50效力可能出現(xiàn)正相關(guān)、負(fù)相關(guān)或不相關(guān)的情況。本研究中，抗原含量與ED50效力無相關(guān)性，符合試驗特點、為合理結(jié)果。

韓金樂等［19］發(fā)現(xiàn)，的21株EV71抗原的特異比活與免疫血清中和抗體間存在強相關(guān)性；另外，毛群穎等［20］對免疫前抗體陰性的嬰幼兒免疫后的血清進行中和抗體檢測，結(jié)果表明，EV71滅活疫苗免疫后呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。本研究結(jié)果表明，62批EV71滅活疫苗的抗原含量與中和抗體效價呈良好正相關(guān)（P＜0.01），與上述研究結(jié)果相符。

當(dāng)疫苗抗原含量一定的情況下，ED50效力越低，表明其半效稀釋倍數(shù)越大，試驗動物陽轉(zhuǎn)越高，疫苗免疫效果越好［21］，但對于中和抗體效價則相反，即中和抗體效價越高、疫苗保護效果越好［22］，因此，同批次疫苗，若ED50效力與中和抗體效價呈負(fù)相關(guān)，表明該疫苗的保護效果良好。本研究的結(jié)果顯示，62批EV71滅活疫苗成品的ED50效力與中和抗體效價呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），表明檢測的疫苗具有良好的免疫效果。

綜上所述，體外相對效力試驗（抗原含量測定）替代體內(nèi)相對效力試驗（ED50效力試驗和中和抗體效價檢測）用于EV71滅活疫苗效力檢測具有可行性。