創(chuàng)新細菌疫苗的研究進展及挑戰(zhàn)

顧江，曾浩，鄒全明

陸軍軍醫(yī)大學國家免疫生物制品工程技術研究中心，重慶400038

某種意義上講，人類文明史就是與病原微生物抗爭的歷史。在疫苗及抗生素發(fā)明之前，細菌一直是人類健康的最大威脅，如鼠疫桿菌、麻風桿菌、傷寒桿菌、霍亂弧菌等，這些曾經(jīng)讓人聞之色變的黑死病、麻風、破傷風等在疫苗使用后幾乎銷聲匿跡，疫苗在幫助人類抵抗細菌性傳染病中發(fā)揮了極其重要的作用。雖然抗生素的發(fā)明和廣泛應用使大多數(shù)細菌感染獲得較好治療，但目前細菌疫苗仍然是公共衛(wèi)生防疫體系的重要組成部分，我國規(guī)劃免疫的“14苗防15病”中，細菌性疫苗占“5苗5病”。此外，細菌性疫苗品種如肺炎球菌疫苗、b型流感嗜血桿菌疫苗、A群C群腦膜炎球菌疫苗等，在非免疫規(guī)劃疫苗品種中占比超過半數(shù)。

由于受到諸多限制，過去研制的細菌疫苗存在血清型保護譜欠寬、有效性不足、生產(chǎn)工藝繁復等問題，已上市的肺炎鏈球菌疫苗、結核桿菌疫苗、腦膜炎球菌疫苗等正進行升級優(yōu)化。隨著細菌抗生素耐藥問題日趨嚴重，研制針對超級耐藥細菌的原創(chuàng)疫苗是目前細菌疫苗的另一個主要研究領域。本文對近年來創(chuàng)新細菌疫苗研發(fā)取得的突破和面臨的挑戰(zhàn)作一簡要綜述。

1 已上市細菌疫苗升級優(yōu)化

1.1 肺炎鏈球菌疫苗 肺炎鏈球菌是一類富含莢膜的革蘭陽性球菌，通常定植于人咽部，主要導致肺炎、中耳炎等局部器官感染和全身膿毒血癥乃至死亡。WHO數(shù)據(jù)顯示，僅2008年約880萬5歲以下兒童死亡，其中47.6萬兒童死于肺炎鏈球菌感染［1］。20世紀初期美國已研制出滅活全菌肺炎鏈球菌疫苗，但抗生素的發(fā)明使疫苗需求下降，導致疫苗升級進展緩慢。至20世紀60年代抗生素耐藥問題出現(xiàn)，疫苗在防控肺炎鏈球菌感染和耐藥中的地位重新獲得重視，并推動了疫苗的迅速發(fā)展。胞外豐富的莢膜是肺炎鏈球菌的關鍵致病因子，其通過介導細菌的黏附、抵抗宿主的免疫殺傷過程發(fā)揮致病作用，因此也是疫苗的關鍵靶標。肺炎鏈球菌的莢膜具有高度的多樣性，已報道的血清型高達97種。目前市面上主要使用的疫苗包括23價肺炎球菌多糖蛋白結合疫苗、13價肺炎球菌多糖蛋白結合疫苗，分別針對23種血清型和13種血清型的肺炎鏈球菌［1］。

為提高肺炎鏈球菌疫苗的保護效率，新一代疫苗研發(fā)主要聚焦在以下2個方面：首先，增加了多糖結合疫苗的莢膜血清型。2021年6月，美國FDA批準的Prevnar 20以CRM197為載體蛋白，在原有13價多糖基礎上，增加了7個血清型的莢膜多糖抗原，分別為8、10A、11A、12F、15B、22F和33F。該疫苗分別在3 902名18~60歲（NCT03760146）、1 710名18~49歲（NCT03828617）和876名65歲以上（NCT03835975）志愿者中完成了Ⅲ期臨床試驗，結果顯示，疫苗的安全性與13價多糖結合疫苗無顯著差異，在保證原13價多糖抗原的免疫原性基礎上，新增加7個多糖抗原的功能性抗體水平達到預期［2］。同一階段批準的肺炎鏈球菌疫苗V114為15價，是CRM197結合的15種血清型莢膜多糖，血清型分別為1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、22F、23F和33F［3］。

其次，隨著對肺炎鏈球菌致病機制研究的不斷深入，大量新型蛋白類毒力因子被發(fā)現(xiàn)，并以其為靶標進行新型肺炎鏈球菌疫苗的研發(fā)。重組PcpA、PhtD、PlyD1等單個或聯(lián)合組成的肺炎鏈球菌疫苗已經(jīng)完成Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗［4］。2021年7月，美國FDA授予突破性療法認定的創(chuàng)新疫苗產(chǎn)品ASP3772，是含有24種肺炎鏈球菌多糖及2種保守蛋白抗原的新型疫苗（24+2）［5］。該疫苗不僅安全性與13價多糖結合疫苗（輝瑞Prevnar13）無顯著差異，且在所有ASP-3772劑量水平下，對血清型3的抗體水平高于Prevnar13對照組；在ASP3772最高劑量水平下，對血清型5和19F的功能性抗體水平顯著高于對照組。

1.2 腦膜炎球菌疫苗 腦膜炎球菌是一種革蘭陰性帶莢膜的需氧雙球菌，主要寄居在人體鼻咽部，是引起急性細菌性腦膜炎的主要病原菌之一。在全球范圍內(nèi)每年導致30萬~50萬人感染，病死率約40%。其中10%~20%的腦膜炎球菌感染幸存者伴有永久性神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，給家庭和社會造成嚴重的負擔［6］。與肺炎鏈球菌類似，莢膜是其主要的致病因子和疫苗靶標。根據(jù)其抗原特性，腦膜炎球菌的莢膜可分為至少13種血清型，其中血清型A、B、C、W135、X、Y導致約95%的腦膜炎感染病例。腦膜炎球菌的血清型分布隨患者年齡、地域以及疫苗應用的情況發(fā)生變化。目前上市的腦膜炎球菌疫苗主要以多糖或多糖結合疫苗為主。包括A群多糖疫苗、A群C群多糖結合疫苗、ACWY群多糖結合疫苗等［6］。

由于B群腦膜炎球菌的免疫原性較弱，且與人體組織的唾液酸糖蛋白存在交叉反應，不能作為疫苗抗原直接應用。因此，針對B群腦膜炎球菌的疫苗研發(fā)一直是疫苗學的難點?；诜聪蛞呙鐚W技術，PIZZA等［7］篩選出了B群腦膜炎球菌蛋白類保護性抗原，為研制B群腦膜炎球菌疫苗奠定了基礎。2014年，F(xiàn)DA批準基于2種重組類脂化H因子結合蛋白（factor H-binding protein，fHBP）變異體疫苗Trumenba。超過2萬名志愿者的Ⅲ期臨床試驗結果顯示，該疫苗耐受性良好，可有效誘導針對4種血清型菌株的功能性抗體。使用外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMV）技術也是研究B群腦膜炎球菌的重要手段。古巴、挪威和新西蘭率先批準使用了基于OMV的疫苗——MeNZB。但自2008年6月起，由于疾病的發(fā)病率降低及項目成本等問題，MeNZB停止了常規(guī)接種。2015年，F(xiàn)DA批準了由3個重組蛋白和OMV組成的疫苗Bexsero。該疫苗的3個重組蛋白分別為fHbp、奈瑟菌屬黏附素A（Neisseria adhesion A，NadA）和奈瑟菌屬肝素結合抗原（Neisseria heparin binding antigen，NHBA）。62%~88%接種Bexsero的受試者可產(chǎn)生血清功能性抗體［8］。

1.3 結核桿菌疫苗 由結核分枝桿菌導致的結核?。╰uberculosis，TB）是危害全球兒童健康的重要傳染病?！?020年全球結核病報告》顯示，2019年約1 000萬人患TB，約140萬人死于TB相關疾病［9］。每年新發(fā)兒童TB患者約112萬，死亡人數(shù)約17.3萬［10］。截至目前為止，卡介苗（BCG）是全球使用時間最長、用于預防TB的唯一疫苗。全球每年約89%的兒童（約1億）接種BCG。BCG接種對重癥TB，如粟粒型TB和結核性腦膜炎等具有較好的保護作用。然而BCG還存在諸多不足，主要如下：對青少年和成年人的免疫保護作用不明確，保護作用持續(xù)時間有限，且不同免疫方式保護作用差異較大。對于一些存在免疫缺陷的新生兒，早期BCG接種可引起卡介苗病，嚴重者可導致患兒死亡［11］。因此研究新型結核桿菌疫苗勢在必行。

利用基因工程將BCG改造成新型減毒結核桿菌疫苗是重要的研究方向。德國馬普感染生物學研究所研制的VPM1002，是利用增強抗原釋放的李斯特菌溶血素（listeriolysin）替換BCG的尿素酶基因，以期促進BCG抗原的降解和遞送，提高疫苗的免疫應答。VPM1002疫苗的Ⅲ期臨床試驗結果顯示，該疫苗不僅可替代BCG預防重癥TB的發(fā)生，還可預防結核潛伏感染（latent tuberculosis infection，LTBI）及活動性結核?。╝ctive tuberculosis，ATB）的復發(fā)［12］。另一個進展較快的新型減毒結核桿菌疫苗為MTBVAC，是敲除編碼ESAT-6和CFP10基因的BCG。MTBVAC已在南非地區(qū)開展了Ⅰ期臨床試驗，結果顯示，MTBVAC的安全性、耐受性及免疫原性與BCG類似。此外，MTBVAC是目前唯一進入臨床試驗階段可用于預防新生兒TB的疫苗［13］。還有研究者在猴體試驗中直接將BCG通過靜脈注射進行免疫，可明顯提高BCG的免疫應答和保護效果［14］。

2021年6月，國家藥品監(jiān)督管理局批準了微卡（VaccaeTM）上市，用作免疫治療劑，幫助縮短藥物敏感TB患者的療程。微卡屬于滅活全菌疫苗，由母牛分枝桿菌菌體蛋白組成，Ⅲ期臨床試驗結果顯示，接種該疫苗及抗結核分枝桿菌治療的耐多藥TB患者，6個月后的痰液陰轉率為43%，遠高于僅接受藥物治療患者（21%）［15］。RUTI是西班牙Parexel公司研制的新型結核桿菌疫苗，由包裹在脂質體的滅活MTB的毒素組成，Ⅰ期臨床試驗結果顯示，在活動性結核病（active tuberculosis，ATB）患者體內(nèi)具有較好的免疫原性和安全性［16］。目前RUTI已在南非進入Ⅱa期臨床試驗，以進一步評價其在治療耐多藥ATB中的免疫原性和安全性。

基因工程重組蛋白疫苗也是新一代結核桿菌疫苗的重要研究方向［17］。目前進展最迅速的為進入Ⅱb期臨床試驗階段的Mtb72F和H56。Mtb72F疫苗以Mtb32A和Mtb39A的融合蛋白作為抗原，以AS01E作為佐劑。H56的核心抗原為包括Ag85B、ESAT-6和Rv2660c的融合蛋白，佐劑為聚陽離子肽與CpG OND1a復合佐劑IC31。此外，重組蛋白疫苗GamTBvac和ID93也完成了Ⅱa期臨床試驗。GamTBvac的核心抗原由Ag85a、ESAT6、CFP10組成，通過融合右旋糖酐結核結構域（dextran-binding domain）與右旋糖酐-DEAE和CpG佐劑制成疫苗。ID93的核心抗原由Rv2608、RV3619、Rv3620、Rv1813組成，佐劑為吡喃葡萄糖脂質的穩(wěn)定乳液（GLA-SE）。此外還有多種重組蛋白疫苗正處于臨床前或Ⅰ期臨床試驗階段。

2 原創(chuàng)細菌疫苗的研究進展

抗生素的使用很大程度上解決了細菌感染治療的問題，因此導致抗生素時代的創(chuàng)新細菌疫苗研發(fā)進展緩慢。隨著抗生素耐藥性的出現(xiàn)和廣泛傳播，單純依賴抗生素很難有效解決細菌感染及防控的難題。2014年，WHO發(fā)布的《抗菌素耐藥：全球監(jiān)測報告》顯示，每年美國因感染超級耐藥細菌死亡的人數(shù)高達約6.3萬，歐盟范圍內(nèi)死亡人數(shù)也約達2.5萬［18］。2015年，美國公布了一項為期5年的國家行動計劃，應對緊迫而嚴重的細菌耐抗生素威脅。在“十三五”期間，由國家衛(wèi)生計生委牽頭，聯(lián)合十四個部委，制定了《遏制耐藥細菌國家行動計劃》，應對細菌耐藥帶來的挑戰(zhàn)，遏制細菌耐藥發(fā)展及蔓延，維護人民群眾身體健康。

疫苗可在源頭上預防細菌的定植及傳播，有助打破抗生素耐藥-新抗生素研發(fā)-新抗生素耐藥的死循環(huán)，從根本上解決細菌感染及耐藥菌株流行的問題［19］。肺炎鏈球菌的低耐藥率與肺炎鏈球菌疫苗的廣泛應用密不可分。臨床上耐藥性強、危害嚴重的細菌主要包括屎腸球菌（Enterococcus faecium）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、克雷伯桿菌（Klebsiella species）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、艱難梭菌（Clostridium difficile）等。以下對研究進展較快的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和艱難梭菌的疫苗作一介紹。

2.1 金黃色葡萄球菌疫苗 金黃色葡萄球菌屬于革蘭陽性球菌，是院內(nèi)感染及戰(zhàn)創(chuàng)傷、燒傷感染的主要病原體，在臨床上主要引起皮膚膿腫、骨髓炎、肺炎以及膿毒癥等疾病。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）是其耐藥性細菌的典型代表，每年造成的死亡人數(shù)與艾滋病相當。據(jù)美國疾病控制中心統(tǒng)計，僅2011年有80 461人感染MRSA，11 285人死于MRSA相關疾病，死亡率為14%［20］。中國細菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)（China Antimicrobial Surveillance Network，CHINET）數(shù)據(jù)表明，2016—2020年，在臨床分離的革蘭陽性菌中金黃色葡萄球菌一直保持第一的地位，同時，MRSA的平均檢出率為31.0%~38.4%［21-22］。

金黃色葡萄球菌疫苗的靶點主要集中莢膜、表面黏附因子和分泌性外毒素［23］。目前僅有2個疫苗完成了Ⅲ期臨床試驗，分別為StaphVax和V710。StaphVax由5型和8型莢膜多糖偶聯(lián)銅綠假單胞菌外毒素A組成，在3 600名血液透析患者的Ⅲ期臨床試驗中，未觀察到顯著的保護效果［24］。V710是重組細菌表面的鐵離子轉運蛋白抗原IsdB，在心胸外科手術患者中完成了Ⅲ期臨床試驗，結果顯示，V710疫苗接種可誘導高水平的特異性抗體，但未觀察到保護效果［25］。此外，還有其他7個疫苗開展了Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗，目前尚無金黃色葡萄球菌疫苗上市。

本研究團隊研制的新一代金黃色葡萄球菌疫苗rFSAV，由5個抗原（IsdB、HLA、SpA、SEB和MntC）組成，分別靶向細菌的毒素、膜蛋白及與細菌生長代謝相關的蛋白。該疫苗不僅具有良好的免疫原性，且在膿毒癥模型、骨折感染模型和肺炎模型中均可有效抵御金黃色葡萄球菌的感染侵襲，顯示出良好的保護效果［26-27］。rFSAV疫苗于2015年獲得臨床試驗研究批件，已經(jīng)分別完成了累計666人的Ⅰa、Ⅰb期和Ⅱ期臨床試驗，結果顯示，該疫苗具有良好的安全性和免疫原性（尚未發(fā)表）。rFSAV疫苗將于2022年開展Ⅲ期臨床試驗，以充分評價其安全性和免疫保護效果。

2.2 銅綠假單胞菌疫苗 銅綠假單胞菌屬于革蘭陰性非發(fā)酵桿菌，有單鞭毛，不含莢膜，廣泛存在于醫(yī)院環(huán)境和人體皮膚、呼吸道等部位，是醫(yī)院獲得性感染最為常見的條件致病菌之一。機體免疫障礙或呼吸功能受損時易感染銅綠假單胞菌，如罹患戰(zhàn)創(chuàng)傷、燒傷、機械通氣、慢性阻塞性肺病、囊性纖維化等患者。銅綠假單胞菌感染可發(fā)生在人體的任何組織和器官，其中角膜、肺臟、皮膚較為常見。進展至敗血癥等全身型感染的死亡率超過20%［28］。2016—2020年CHINET統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，銅綠假單胞菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率居高不下，泛耐藥銅綠假單胞菌的分離率逐年上升［22-23］。

上世紀60年代已開始針對銅綠假單胞菌疫苗的研發(fā)，但目前尚無上市疫苗。最初的疫苗多以細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為抗原，如輝瑞公司研發(fā)的7價脂多糖疫苗，分別在腫瘤、燒傷、急性白血病和囊性纖維化患者中完成了Ⅲ期臨床試驗，結果顯示，多糖結合疫苗免疫原性不足，無明顯保護效果［29］。另一個完成Ⅲ期臨床試驗的多糖疫苗為瑞士血清與疫苗所研制的8價脂多糖-外毒素A的結合疫苗，由于保護效果有限等原因未獲批上市［30］。澳大利亞IMMUNO公司提取天然的銅綠假單胞菌A型和B型鞭毛研制的蛋白疫苗，在483名囊性纖維化患者體內(nèi)完成了Ⅲ期臨床試驗，也未取得預期保護效果。奧地利Valneva Austria GmbH公司研制的基因工程重組蛋白疫苗IC43，由銅綠假單胞菌外膜蛋白OprF190-342和OprI21-83的融合蛋白構成。2015年8月，在812名ICU住院并使用機械通氣患者體內(nèi)完成了Ⅱ／Ⅲ期臨床試驗，結果顯示，該疫苗的接種不能明顯降低銅綠假單胞菌感染及其導致的死亡［31］。目前還有4種疫苗正處于Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗階段，結果值得期待［29］。

2.3 艱難梭菌疫苗 艱難梭菌屬于革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，可導致抗菌藥物相關性腹瀉、相關性結腸炎和偽膜性腸炎等腸道感染。由于對難治性腹瀉的重視和檢測手段的升級，近年來艱難梭菌的檢出率逐年上升。艱難梭菌毒素A（Clostridium difficiletoxin A，TcdA）和毒素B（Clostridium difficiletoxin B，TcdB）是該菌的主要毒力因子，可引起鳥嘌呤三磷酸酶（Rho GTPase）失活，導致細胞死亡和腸道屏障功能損害，從而引發(fā)感染性疾病。甲硝唑、萬古霉素和非達霉素是目前治療艱難梭菌感染的主要藥物，但由于耐藥性和復發(fā)等問題，這些抗生素治療效果有限，急需疫苗、抗體等其他手段進行干預［32］。2016年，美國FDA批準了首個用于艱難梭菌感染輔助治療的靶向毒素B的單克隆抗體藥物bezlotoxumab［33］。

目前該類疫苗研究主要靶向艱難梭菌的毒素A和B。研究進度較快的為賽諾菲巴斯德研制的TcdA和TcdB的雙價毒素疫苗。疫苗于2020年9月在9 302名50歲及以上高風險人群中完成了Ⅲ期臨床試驗，試驗中期分析表明，疫苗有效性為-5.2%，因不能降低高風險人群的艱難梭菌感染而中止后續(xù)研究［34］。輝瑞公司通過基因工程脫毒的雙價毒素疫苗IC84在Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗取得預期效果，目前正在50歲以上的高風險人群中開展Ⅲ期臨床試驗［35］。一個基于TcdA和TcdB的中和表位疫苗在50歲以上人群中完成了Ⅱ期臨床試驗，結果顯示，該疫苗針對2種毒素抗體的陽轉率高達83%，但目前尚無相關Ⅲ期臨床試驗（NCT02316470）的報道［36］。此外還有針對細菌芽孢形成和組裝關鍵蛋白BclA1、CdeM和CotA的候選疫苗等，目前仍處于實驗動物評價階段［36］。

3 創(chuàng)新細菌疫苗研究的難點及對策

與病毒明顯不同，細菌以獨立的生命體存在，不僅基因組龐大，還可形成芽孢、L形變異體、鞭毛、莢膜等特殊結構。細菌感染是一個動態(tài)調(diào)控的過程，依靠差異化的致病因子，在人體組織器官造成結局迥異的感染，這可能是大多數(shù)單一靶點的細菌疫苗均未達到預期效果的主要原因。運用大數(shù)據(jù)、人工智能、多組學技術，全面加深對細菌致病過程和宿主抗感染免疫應答的認識，基于多靶點、多組分的“雞尾酒”疫苗成為研發(fā)細菌疫苗的重要策略。目前大量的多組分細菌疫苗正處于臨床研究階段或批準上市，見表1。

表1 基于“雞尾酒”策略的細菌疫苗Tab.1 Bacterial vaccines based on“cocktail”strategy

疫苗佐劑和遞送系統(tǒng)對疫苗保護效力提升更加重要，而目前細菌疫苗的佐劑主要以傳統(tǒng)的誘導體液免疫應答的鋁鹽佐劑為主。因此，充分利用納米醫(yī)學、結構生物學、材料學等學科的最新進展，開展脂質體、自主裝納米顆粒、假病毒顆粒、高分子納米材料、細胞因子復合佐劑、黏膜佐劑等新一代疫苗佐劑和遞送系統(tǒng)研究，提高細菌疫苗的免疫應答強度及豐富免疫應答類型，是成功研發(fā)新型細菌疫苗的基礎。

系統(tǒng)、準確的臨床流行病學數(shù)據(jù)是評估創(chuàng)新疫苗研究的必要性、有效性和重要性的基礎和前提。一些經(jīng)典的重要病原細菌如白喉桿菌、百日咳桿菌等發(fā)病情況由國家和地方的疾控中心進行監(jiān)測。而針對耐藥金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和艱難梭菌等細菌的臨床數(shù)據(jù)不完整，主要來自行業(yè)協(xié)會，缺乏行政力度，數(shù)據(jù)的權威性和系統(tǒng)性有限，嚴重阻礙了疫苗人體臨床試驗方案設計和有效性評價。因此，建議在國家層面納入法定管理，并聯(lián)合多學科、多部門，完善耐藥細菌感染流行病學監(jiān)測體系，深入開展病原細菌的流行規(guī)律、感染疾病負擔研究，為創(chuàng)新細菌疫苗研制提供基礎性條件支撐。

突發(fā)其來的新型冠狀病毒肺炎疫情，重新讓疫苗獲得了科學家、政府和資本的青睞，全面推動了疫苗技術如mRNA疫苗技術、多糖結合生物合成、新型疫苗佐劑等的快速發(fā)展，創(chuàng)新細菌疫苗的研究也迎來前所未有的機遇。希望更多的科學家們在后疫情時代研制出更多更好的細菌疫苗，為人類健康保駕護航。