鈍頂螺旋藻分離純化SOD的中試生產(chǎn)

謝婷玉,張亞旗,盧珍華,蘇國成,張鈴玉

(集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

0 引言

螺旋藻起源于非洲和拉丁美洲[1]，在地球上存在的時(shí)間超過35億a，被稱為自然界的活化石。螺旋藻中蛋白質(zhì)含量豐富[2-3]，是目前已知的理想蛋白質(zhì)來源[4]，螺旋藻的早期研究也集中于此。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，螺旋藻內(nèi)含有的酶具有抗氧化、抗炎以及抗腫瘤等多種生物活性[5-6]，從螺旋藻中獲得生物酶的工藝研究受到越來越廣泛的關(guān)注[7]。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一種重要的抗氧化劑，它廣泛存在于自然界的動(dòng)物、植物以及一些微生物體內(nèi)[8-9]。SOD按其所含金屬輔基的不同可分為Mn、Fe、Cu/Zn、Ni 4種類型[10-11]。SOD可有效清除體內(nèi)的自由基，在抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、抗炎癥和抗衰老等方面發(fā)揮著重要作用，被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及化妝品行業(yè)[12-13]。在醫(yī)藥行業(yè)，SOD可用來治療多種由超氧陰離子自由基引發(fā)的疾病，比如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[14]、高血壓[15]等。在食品行業(yè)，SOD可作為果汁、啤酒和罐頭等食品的抗氧化劑，便于食品的保鮮、保藏[16]。在化妝品行業(yè)，SOD是防曬霜、面霜、眼霜等產(chǎn)品中重要的添加劑之一，在防曬、抗衰、祛斑等方面有明顯的功效[17]。此外，Carillon等[18]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，富含SOD的濃縮甜瓜汁可有效預(yù)防高血壓的發(fā)生與發(fā)展。

目前，SOD的來源主要有動(dòng)物、微生物和植物3種。動(dòng)物來源方面，比如羊血[19]是目前SOD的主要來源，但是由于動(dòng)物原料價(jià)格相對(duì)昂貴且易受污染，亟需尋找工業(yè)化生產(chǎn)SOD的替代方式[20-21]。微生物來源方面，比如類球紅細(xì)菌[22]，該來源安全性欠佳且提取技術(shù)尚不成熟。植物來源方面，比如番茄[23]、玉米[24]等，該來源因具有安全可靠、原料廣泛、適合大批量生產(chǎn)的特點(diǎn)，已成為最有潛力的生產(chǎn)方式，但目前尚停留在實(shí)驗(yàn)室階段，有待進(jìn)一步研究。為了建立一種從植物源中穩(wěn)定獲得高比活力SOD的中試生產(chǎn)方法，本文在韓文清等[25]實(shí)驗(yàn)室研究的基礎(chǔ)上，對(duì)鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)來源的SOD進(jìn)行中試放大生產(chǎn)，為植物來源SOD產(chǎn)業(yè)化的實(shí)現(xiàn)提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

鈍頂螺旋藻干粉，福建省神六保健食品有限公司提供。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和硫酸銨，西隴科學(xué)股份有限公司；離子交換樹脂填料，蘇州納微科技有限公司；凝膠過濾層析填料，通用電氣醫(yī)療集團(tuán)；SOD檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，碧云天生物技術(shù)。

1.2 儀器與設(shè)備

不銹鋼反應(yīng)釜 (100 L)，淄博蓋億化工設(shè)備有限公司；高速管式分離機(jī)，海寧市亞東過濾設(shè)備有限公司；卷式膜中試設(shè)備，三達(dá)膜科技；中空纖維膜中試設(shè)備，非標(biāo)；三足離心機(jī)，江蘇賽德力制藥機(jī)械制造有限公司；高速冷凍連續(xù)流離心機(jī)，HITACHI，日本；GE ATKA Pure 蛋白純化儀，GE Healthcare，瑞典；酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SOD的純化工藝流程

SOD的純化工藝流程見圖1。

1)螺旋藻破壁處理。在室溫下，往反應(yīng)釜中加入100 L的純化水，然后投入716 g磷酸氫二鈉、80 g磷酸二氫鈉，以60 r/min的速度攪拌5 min。當(dāng)pH值穩(wěn)定在7.8左右時(shí)開始投料，加入螺旋藻干粉5 kg，以相同速度攪拌5 h。

2)離心濃縮。首先，用三足離心機(jī)對(duì)處理好的料液反復(fù)離心2次；其次，用管式離心機(jī)以14 000 r/min的轉(zhuǎn)速和750 mL/min的進(jìn)料速度進(jìn)行離心去渣并收集上清液；再次，用中空纖維膜按照V(上清液)∶V(純化水)=1∶1的比例反復(fù)處理上清液；最后，用分子截留量為10 ku的納濾膜對(duì)SOD清液進(jìn)行濃縮，得到濃縮液。按照V(濃縮液)∶V(純化水)=1∶1的比例對(duì)濃縮液進(jìn)行3次重復(fù)除雜。

3)兩步鹽析萃取。第一步鹽析：粗SOD濃縮液倒入反應(yīng)釜中并打開冷油。在反應(yīng)釜中以10 ℃、60 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌0.5 h，同時(shí)緩慢加入17.55 kg硫酸銨。0.5 h后將料液放出，于4 ℃下靜置2 h。用管式離心機(jī)對(duì)料液進(jìn)行離心，收集上清液。第二步鹽析：在硫酸銨飽和度為40%～90%范圍內(nèi)進(jìn)一步鹽析。將第一步鹽析獲得的上清液再次倒入反應(yīng)釜，在反應(yīng)釜中以10 ℃、60 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌0.5 h，同時(shí)緩慢加入3.105 kg硫酸銨。硫酸銨飽和度分別調(diào)至50%，60%，70%，80%，90%。0.5 h后將料液放出，于4 ℃ 下靜置2 h。用管式離心機(jī)對(duì)料液進(jìn)行離心，收集沉淀，去除上清液。沉淀用1 L、pH=7.8、20 mmol/L的磷酸緩沖溶液復(fù)溶。用分子截留量為200 u的納濾膜對(duì)1 L的SOD溶液進(jìn)行脫鹽，當(dāng)SOD溶液的電導(dǎo)率為3 ms/cm時(shí)，第二步鹽析結(jié)束。

4)柱層析精制純化。采用GE AKTA Pure半制備型蛋白純化儀系統(tǒng)將兩步鹽析后獲得的SOD溶液進(jìn)一步純化。主要填料為Uni Gel DEAE 50XS和SuperdexTM200。

DEAE離子交換色譜柱層析：將兩步鹽析獲得的SOD沉淀用pH=7.8、20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶解后，用AKTA Pure 進(jìn)行Uni Gel DEAE 50XS柱層析(柱尺寸φ15 mm×310 mm，柱體積54.5 mL)。利用波長280 nm進(jìn)行監(jiān)測(cè)，每10 mL流份收集1管，共收集50管。測(cè)定每管的酶活力，將酶活力大于500 U/mg 的部分收集、濃縮。

SuperdexTM200凝膠過濾柱層析：將DEAE柱層析純化后的SOD濃縮液再用SuperdexTM200凝膠過濾柱層析進(jìn)一步純化(柱尺寸φ10 mm×300 mm，柱體積26.4 mL)。利用波長280 nm進(jìn)行監(jiān)測(cè)，每0.5 ml流份收集1管，共收集50管。測(cè)定每管的酶活力，將酶活力大于4 000 U/mg的部分收集，最終得到目標(biāo)產(chǎn)品。

5)成品干燥制備。將收集到的活力大于4 000 U/mg的SOD溶液進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉。

6)純化倍數(shù)與回收率的計(jì)算。純化倍數(shù)=對(duì)照組的比活力/實(shí)驗(yàn)組的比活力，其中：對(duì)照組的比活力為粗藻液比活力(U/mg)；實(shí)驗(yàn)組的比活力為每道純化工序后的比活力(U/mg)。純化順序?yàn)槌瑸V、鹽析、DEAE柱層析、凝膠過濾柱層析?；厥章?%=(實(shí)驗(yàn)組總活力/對(duì)照組總活力)×100，其中：實(shí)驗(yàn)組總活力為每道純化工序后的總活力(IU)；對(duì)照組總活力為粗藻液總活力(IU)。純化順序?yàn)槌瑸V、鹽析、DEAE柱層析、凝膠過濾柱層析。

1.3.2 SOD活力及蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所的SOD測(cè)定試劑盒WST-1法對(duì)SOD活力進(jìn)行測(cè)定；采用碧云天BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0010)對(duì)SOD蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測(cè)定。SOD活力測(cè)定計(jì)算見以下公式：SOD抑制率/%=[(A1-A2)-(A3-A4)/(A1-A2)]×100， SOD活力/(U·mg-1)=(SOD抑制率÷50%×(反應(yīng)體系/稀釋倍數(shù))/待測(cè)樣本蛋白質(zhì)濃度，其中：A1為對(duì)照(20 μL雙蒸水、20 μL酶工作液、200 μL底物應(yīng)用液)的吸光度值；A2為對(duì)照空白(20 μL雙蒸水、20 μL酶稀釋液、200 μL底物應(yīng)用液)的吸光度值；A3為測(cè)定(20 μL待測(cè)樣品、20 μL酶工作液、200 μL底物應(yīng)用液)的吸光度值；A4為測(cè)定空白(20 μL待測(cè)樣品、20 μL酶稀釋液、200 μL底物應(yīng)用液)的吸光度值。

1.3.3 SDS-PAGE分析

用SDS-PAGE方法[25-26]對(duì)分離提純得到的SDS進(jìn)行分子質(zhì)量分析。將樣品用5%的堆積凝膠在恒壓80 V的條件下分離20～30 min后，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的分離凝膠在恒壓100 V的條件下分離1.5 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 螺旋藻SOD的提取純化

螺旋藻經(jīng)超濾、分段鹽析、DEAE柱層析、凝膠過濾柱層析后，總活力、酶比活力、提純倍數(shù)、回收率結(jié)果如表1所示。由表1可見，從螺旋藻中最終獲得的SOD的比活力為4 131.00 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到了238.96，回收率為8.30%。這與韓文清等[25]獲得的結(jié)果(SOD比活力為2 078.20 U/mg，純化倍數(shù)為126.50，回收率為19.90)相比，酶的比活力和純化倍數(shù)均顯著提高，回收率有所降低。推測(cè)原因是本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最適的沉淀梯度并采取了二步鹽析，在提純SOD的同時(shí)也損失了部分目標(biāo)產(chǎn)品。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)將體系放大為90 L后，依然可以從鈍頂螺旋藻中獲得SOD，且通過優(yōu)化工藝，顯著提高了SOD的比活力。該結(jié)果也證明，本實(shí)驗(yàn)所建立的SOD中試生產(chǎn)方法是可行的。

表1 螺旋藻SOD的中試純化結(jié)果

2.2 不同飽和度硫酸銨鹽析對(duì)螺旋藻中SOD酶活力的影響

SOD溶液在飽和度為40%～90%范圍內(nèi)的硫酸銨中每隔10%梯度進(jìn)行鹽析，獲得沉淀。對(duì)沉淀進(jìn)行復(fù)溶后脫鹽，再測(cè)定其SOD活力，結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，在飽和度為40%～70%的范圍內(nèi)，隨著硫酸銨溶液飽和度的增加，SOD活力不斷提高，在飽和度為61%～70%的硫酸銨中，SOD活力達(dá)到最高。此后，SOD活力隨硫酸銨溶液飽和度的增加而降低。因此，在第一步鹽析中，選擇飽和度為0～60%的硫酸銨對(duì)SOD溶液進(jìn)行鹽析除雜；在第二步鹽析中，選擇飽和度為61%～70%的硫酸銨對(duì)SOD溶液再次進(jìn)行鹽析，然后取沉淀復(fù)溶，再使用柱層析對(duì)其進(jìn)行脫鹽，最后得到活力最強(qiáng)的SOD。

2.3 DEAE離子交換色譜柱層析

使用GE AKTA Pure半制備型蛋白純化儀系統(tǒng)對(duì)活力最強(qiáng)的SOD進(jìn)行DEAE柱層析，結(jié)果如圖3所示。根據(jù)SOD活力曲線，合并SOD活力大于500 U/mg的試管中溶液，即合并第23～39管，得到SOD活力的平均值大于2 156 U/mg的溶液。

2.4 SuperdexTM200凝膠過濾柱層析

使用GEAKTA Pure半制備型蛋白純化儀系統(tǒng)對(duì)SOD活力平均值大于2 156 U/mg的溶液進(jìn)行SuperdexTM200凝膠過濾柱層析，結(jié)果如圖4所示。根據(jù)SOD活力曲線，合并SOD活力大于4 000 U/mg的試管中溶液，即合并第16～23管，得到SOD活力的平均值大于4 131 U/mg的溶液。

2.5 SDS-PAGE分析

將最終得到的SOD酶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖5所示。由圖5可見，螺旋藻中SOD的分子質(zhì)量約為18.4 ku，有且僅有唯一一條條帶，為僅含有一種亞基的SOD。

2.6 重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

如表2所示，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)均可從螺旋藻中分離提純得到SOD，且平均酶活力均大于4 000 U/mg。

表2 3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)按照兩步鹽析法、DEAE離子交換色譜柱層析和SuperdexTM200凝膠過濾柱層析法的分離純化順序，從螺旋藻中分離純化獲得高比活力的SOD，且通過3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了本文方法的穩(wěn)定性和可靠性。實(shí)驗(yàn)所得的SOD酶液平均比活為4 131 U/mg，回收率為8.3%，純度提高了238.96倍。由SDS-PAGE電泳分析可知，純化所得SOD蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量約為18.4 ku，為僅含一種亞基的SOD。