油茶籽濕渣發(fā)酵制備蛋白飼料的菌種選擇

蘇 玲

（河北綠茵生化科技有限公司，河北石家莊 050000）

油茶是一種山茶科植物，主要分布在長(zhǎng)江下游以南地區(qū)（張暉等，2020；任澤文等，2019），對(duì)油茶育種及栽培技術(shù)研究歷史悠久。油茶是一種重要的油料作物，其主要成分包括不飽和脂肪酸、維生素、生育酚、油酸、亞油酸及黃酮等，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。目前，我國(guó)油料種植面積已達(dá)到436.7萬(wàn)hm2，年產(chǎn)油茶量為67萬(wàn)t，按照傳統(tǒng)工藝提油后茶籽餅約為80萬(wàn)t（鄧桂蘭，2016）。油茶籽餅為茶油提純后的副產(chǎn)品，主要包含15%蛋白質(zhì)，10%～15%皂素和30%～35%糖類(lèi)物質(zhì)等；油茶籽粕也是提純茶油的副產(chǎn)品，其含有25%蛋白質(zhì)，20%多糖類(lèi)物質(zhì)。油茶籽餅粕具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)其蛋白含量較高，可用作為植物蛋白飼料的重要來(lái)源（陳曉等，2015）。蛋白飼料是指飼料中蛋白質(zhì)含量大于20%，粗纖維低于20%的一類(lèi)飼料。蛋白飼料的粗蛋白質(zhì)含量越高，其市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值越高。菌體蛋白飼料是以工業(yè)中廢水及農(nóng)業(yè)加工下腳料等物質(zhì)為原料，經(jīng)過(guò)細(xì)菌和藻類(lèi)等微生物發(fā)酵而獲得的菌體蛋白（黃浦等，2015）。菌體蛋白飼料的優(yōu)勢(shì)是其蛋白含量高，營(yíng)養(yǎng)豐富；菌體繁殖速度快，獲得菌體蛋白飼料周期短；菌體蛋白飼料的原料豐富，生產(chǎn)過(guò)程穩(wěn)定（黃浦等，2015；衛(wèi)洋洋等，2012）。

油茶籽濕渣是水酶解法提純茶油的副產(chǎn)品，經(jīng)檢測(cè)其水分含量為73%，蛋白質(zhì)為10%～14%，粗纖維為16%，皂素含量為1%～3%，油茶籽濕渣的水分含量較高，不及時(shí)處理極易發(fā)霉，影響其質(zhì)量和環(huán)境，不利于直接作為蛋白原料。因而，適當(dāng)處理油茶籽濕渣，降低其纖維素含量，提高菌體蛋白的含量，同時(shí)增加飼料適口性。本研究是以油茶籽濕渣為原料，選擇最佳的霉菌和酵母菌，將其接種到最佳的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，便于降低其纖維素含量，提高飼料的蛋白質(zhì)含量，改變其適口性，生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的蛋白飼料。

1 材料與方法

1.1 材料葡萄酵母（Grape cerevisiae）、木糖酵 母（Xylose cerevisiae）、楊 梅 酵 母（Bayberry cerevisiae）、啤酒酵母（Beer cerevisiae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、青 霉（Penicillium glaucum（Pe 40）、毛 霉（Mucor mucedo（M06）、根 霉（Rhizopus oryzae）。該試驗(yàn)微生物由企業(yè)單位實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.1 油茶原料與培養(yǎng)基

油茶籽濕渣由企業(yè)單位提供。

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基。

初選培養(yǎng)基：油茶籽濕渣與水分之比為1∶1，瓊脂粉含量為2%，pH為8～9，放入高溫滅菌鍋121℃進(jìn)行滅菌，滅菌結(jié)束后冷卻到55℃倒入滅菌培養(yǎng)皿中，將其冷卻凝固。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中油茶籽濕渣與麩皮的含量分別為10%和70%，水含量為55%，pH為8～9，放入高溫滅菌鍋121℃滅菌，滅菌結(jié)束后冷卻到55℃，再倒入滅菌培養(yǎng)皿中，待其冷卻凝固。

1.1.2 主要設(shè)備 立體壓力蒸汽滅菌鍋、臺(tái)式空氣恒溫?fù)u床、水平搖床、數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱、恒溫?fù)u床、震蕩培養(yǎng)箱、電子天平、酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、霉菌培養(yǎng)箱、立式超低溫保溫箱、電冰箱、分析試驗(yàn)用純水機(jī)、電磁爐、超凈工作臺(tái)、光學(xué)顯微鏡、渦旋機(jī)、玻璃皿、若干燒杯、量筒、玻璃棒、棉花與紗布、石棉網(wǎng)。

1.1.3 主要試劑與材料 瓊脂粉，淀粉，葡萄糖，氫 氧 化 鈉（5%，2 mol/L），鹽 酸（5%，2 mol/L），硝 酸 鉀，NaCl，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，F(xiàn)eSO4·7H2O，PH試紙，對(duì)硝基苯酚，乙酸鈉，乙酸，甲醛，乙酰丙酮，硫酸銨。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備方法 固體培養(yǎng)基制備方法：首先，將200 g土豆切成碎末，對(duì)其加熱至沸騰，使用濾布過(guò)濾，將濾液放入燒杯中，向燒杯內(nèi)加入1 L水、再放入23 g葡萄糖、19 g瓊脂粉；使用電磁爐對(duì)燒杯內(nèi)液體培養(yǎng)基進(jìn)行加熱，并用玻璃棒不斷攪拌，待其瓊脂全部溶解，放入立體壓力滅菌鍋加熱滅菌（121℃，30 min），將其液體培養(yǎng)基倒入玻璃皿中，放入超級(jí)潔凈工作臺(tái)中冷卻，以備用。

1.2.2 菌類(lèi)培養(yǎng)方法 酵母菌擴(kuò)大培養(yǎng)方法：先將酵母細(xì)菌接種到合適斜面培養(yǎng)基中，放入合適環(huán)境培養(yǎng)，使其處于活化狀態(tài)，再將其部分活化細(xì)菌培養(yǎng)后，將其接種到合適的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，放入恒溫?fù)u床（200 r/min），28℃培養(yǎng)24 h后將液體酵母菌稀釋為不同濃度梯度，將其接種于不同標(biāo)記斜面培養(yǎng)基中，放入細(xì)菌培養(yǎng)箱（28℃）中培養(yǎng)，24 h后對(duì)其細(xì)菌平板鏡檢計(jì)數(shù)，最終計(jì)算出細(xì)菌密度為2.5×107～3.1× 107cfu/mL。

霉菌擴(kuò)大培養(yǎng)方法：先將霉菌接種到合適斜面培養(yǎng)基中，放入合適的環(huán)境中培養(yǎng)，使其處于活化狀態(tài)，再將部分活化細(xì)菌培養(yǎng)后，將其接種到合適的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，放入恒溫?fù)u床（200 r/min）中28℃培養(yǎng)8 h，然后將液體霉菌稀釋為不同濃度梯度，將其接種于不同標(biāo)記斜面培養(yǎng)基中，放入細(xì)菌培養(yǎng)箱（28℃）中培養(yǎng)24 h后，并對(duì)其細(xì)菌平板進(jìn)行鏡檢計(jì)數(shù)，最終計(jì)算出細(xì)菌密度為3.5×107～4.2×107cfu/mL.

1.2.3 不同菌種初選試驗(yàn) 將不同類(lèi)型的酵母菌和霉菌進(jìn)行接種活化，使用點(diǎn)值法接種在初選培養(yǎng)基中，每種菌種組合做4個(gè)重復(fù)。酵母菌類(lèi)培養(yǎng)基中點(diǎn)4個(gè)點(diǎn)，霉菌培養(yǎng)皿中點(diǎn)2個(gè)點(diǎn)。放入恒溫培養(yǎng)箱中（28℃）培養(yǎng)，間隔14 h進(jìn)行觀察霉菌與酵母菌培養(yǎng)情況。本研究是以菌種的生長(zhǎng)狀況和生長(zhǎng)密度為觀察指標(biāo)，選取在油茶籽濕渣培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好的菌種。

1.2.4 粗蛋白質(zhì)的測(cè)定方法 油茶籽濕渣經(jīng)酵母菌或霉菌發(fā)酵的粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法參考GB/T5009.5-2010記錄中分光光度法。

1.2.5 不同菌種復(fù)選試驗(yàn) 對(duì)初次選取的菌種進(jìn)行分類(lèi)后，將其分別接種在相應(yīng)標(biāo)記的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，將其分別放入霉菌和酵母菌恒溫培養(yǎng)箱中（28℃）進(jìn)行大量培養(yǎng)，培養(yǎng)6 d后對(duì)其培養(yǎng)基進(jìn)行高溫（85℃）烘干，測(cè)定其粗蛋白質(zhì)的含量，選取粗蛋白質(zhì)含量最高的酵母菌和霉菌。

1.2.6 混合菌種選取試驗(yàn) 對(duì)初選和復(fù)選的不同類(lèi)型酵母菌和霉菌按照比例1∶1組合（2個(gè)菌種組合和3個(gè)菌種組合），將其不同組合酵母菌和霉菌按照12%菌體量接種到對(duì)應(yīng)的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別放入霉菌和酵母菌恒溫培養(yǎng)箱中（28℃）大量培養(yǎng)2 d，進(jìn)行混合菌種發(fā)酵試驗(yàn)，對(duì)其培養(yǎng)基使用高溫（85℃）烘干，測(cè)定不同混合菌種組中粗蛋白質(zhì)含量，選取不同混合菌種組中發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量最高的作為最佳混合菌種組。

1.2.7 混合菌種接種比例和培養(yǎng)周期 將混合菌種選取試驗(yàn)中的最佳霉菌和酵母菌組合按不同體積霉菌和酵母菌比例進(jìn)行組合，霉菌：酵母菌=1：5（0.2）、2：5（0.4）、3：5（0.6）、4：5（0.8）、1：1（1），將不同組合酵母菌和霉菌按照12%菌體量接種到對(duì)應(yīng)的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，放入不同類(lèi)型恒溫培養(yǎng)箱中（28℃）培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置為2、4、6、8、10d，進(jìn)行混合菌種發(fā)酵試驗(yàn)，對(duì)其培養(yǎng)基使用高溫（85℃）烘干，測(cè)定其粗蛋白質(zhì)含量，以便確定發(fā)酵的不同霉菌和酵母菌的比例和培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 本試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。菌種初選試驗(yàn)和復(fù)選試驗(yàn)均采用“+”和“-”號(hào)表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 不同菌種初選試驗(yàn)結(jié)果將8種不同類(lèi)型的酵母菌和霉菌按照試驗(yàn)培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，將其接種到初選培養(yǎng)基中，使用點(diǎn)培養(yǎng)方法，每組3個(gè)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)不同類(lèi)型菌種在油茶籽濕渣培養(yǎng)基的生長(zhǎng)狀況，以便于分析得出最佳單個(gè)發(fā)酵菌種，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。

表1 不同菌種初選結(jié)果

由表1可知，不同類(lèi)型菌種在以油茶籽濕渣為底物的培養(yǎng)基上呈現(xiàn)不同的生長(zhǎng)狀況，木糖酵母、啤酒酵母、根霉菌在此培養(yǎng)基中基本不生長(zhǎng)，其余菌種均能在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)情況較好。其主要原因是不同類(lèi)型的菌種對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和運(yùn)用情況不同，也可能是油茶籽濕渣的其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)木糖酵母、啤酒酵母、根霉菌的生長(zhǎng)存在抑制作用，才會(huì)導(dǎo)致3種菌類(lèi)不能正常生長(zhǎng)，而其他類(lèi)型菌種能較好適應(yīng)其培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和外部條件。

2.2 不同菌種復(fù)選試驗(yàn)結(jié)果將初次選取的5種類(lèi)型菌株：葡萄糖酵母、楊梅酵母、黑曲霉、青霉和毛霉，將其接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其粗蛋白質(zhì)測(cè)定值如圖1所示。

圖1 不同菌種發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，不同菌種經(jīng)過(guò)發(fā)酵后其培養(yǎng)基中的粗蛋白質(zhì)含量高低順序?yàn)椋汉谇梗厩嗝梗緱蠲方湍福久梗酒咸烟墙湍福緦?duì)照組。這些結(jié)果說(shuō)明經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，該培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量最高。

2.3 混合菌種選取試驗(yàn)結(jié)果將復(fù)選試驗(yàn)中的優(yōu)勢(shì)菌種按不同組合進(jìn)行混合菌種發(fā)酵試驗(yàn)，將其不同類(lèi)型的酵母菌和霉菌組合劃分為組1：楊梅酵母菌+黑曲霉，組2：楊梅酵母菌+青霉，組3：楊梅酵母菌+毛霉，組4：楊梅酵母菌+黑曲霉+青霉，組5：楊梅酵母菌+黑曲霉+毛霉，組6：楊梅酵母菌+青霉+毛霉，其粗蛋白質(zhì)含量結(jié)果如下圖2所示。

由圖2可知，酵母和霉菌混合菌種組合發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)含量高于單菌種的發(fā)酵產(chǎn)物，本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究的酵母和霉菌混合能提高飼料中蛋白含量的結(jié)果類(lèi)似。將3種不同類(lèi)型菌種進(jìn)行混合發(fā)酵試驗(yàn)，該培養(yǎng)基產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)的含量最高，而組5培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)含量低于組4培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)含量，組3培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)含量最低。其中組4培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)含量最高，因而將楊梅酵母菌+黑曲霉+青霉組合確定為最佳的混合菌種。

圖2 不同混合菌種發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 混合菌種接種比例確定將混合菌種中最佳的組合按照不同體積比例接種到固體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并測(cè)定其發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)含量，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)混合菌種接種比例為3∶5時(shí)，該培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)含量最高，為35.67%；當(dāng)混合菌種接種比例為4∶5時(shí)，其發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)含量下降；當(dāng)混合菌種的比例為1∶1時(shí)，該發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)含量適當(dāng)提高。當(dāng)培養(yǎng)混合菌種時(shí)，酵母菌中利用原料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成一定量的蛋白質(zhì)，霉菌可以分泌適量纖維素酶，該酶能將原料中的纖維素分解為單糖原類(lèi)，為酵母的生長(zhǎng)提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因而，混合菌種的合適接種比例將會(huì)使得菌體蛋白含量增加。本試驗(yàn)的混合菌種發(fā)酵接種比例為3∶5。

圖3 不同接種比例和蛋白含量關(guān)系

2.5 混合菌種培養(yǎng)周期確定將最佳混合菌種組合放入恒溫培養(yǎng)箱中，將其固體進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，參考不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)含量，如圖4所示。

由圖4可知，最佳混合菌種組合培養(yǎng)基中粗蛋白質(zhì)含量隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加；培養(yǎng)到6～8 d時(shí)，該培養(yǎng)基粗蛋白質(zhì)含量增幅較為緩慢。在8 d后，其培養(yǎng)基粗蛋白質(zhì)含量開(kāi)始下降。真菌生長(zhǎng)發(fā)育培養(yǎng)周期為生長(zhǎng)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期；培養(yǎng)基中粗蛋白質(zhì)下降的主要原因是當(dāng)真菌生長(zhǎng)狀況達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)并走向衰亡期時(shí)，該時(shí)期真菌的發(fā)酵能力逐漸降低，其蛋白質(zhì)含量也會(huì)降低。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)會(huì)長(zhǎng)滿其他雜質(zhì)，聞起來(lái)有較大霉味。因此，本試驗(yàn)的混合菌種培育周期為8 d。

圖4 混合菌種培養(yǎng)周期與蛋白質(zhì)含量的關(guān)系

2.6 油茶籽濕渣的發(fā)酵粗蛋白質(zhì)含量對(duì)比分析由表2可知，經(jīng)過(guò)楊梅酵母菌+黑曲霉+青霉發(fā)酵油茶籽濕渣后，其產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)含量明顯高于發(fā)酵前的粗蛋白質(zhì)含量，為32.17%，產(chǎn)物有一種甜香味。該試驗(yàn)結(jié)果與前人的研究結(jié)果類(lèi)似，鄧佳蘭（2008）等以油茶籽濕渣為原料，對(duì)其進(jìn)行酵母和霉菌發(fā)酵培養(yǎng)后獲得豐富的菌體蛋白。這些試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明油茶籽濕渣經(jīng)過(guò)相應(yīng)的霉菌和酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)后，為菌體飼料提供了豐富的蛋白原料。

表2 油茶籽濕渣的發(fā)酵粗蛋白質(zhì)含量對(duì)比

3 結(jié)論與分析

油茶籽濕渣是一種重要的菌體蛋白來(lái)源。本試驗(yàn)對(duì)不同類(lèi)型菌種進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)比選，其結(jié)果表明，霉菌發(fā)酵效率高于酵母菌，其發(fā)酵結(jié)果較好；混合菌種的發(fā)酵效率高于其單一菌種，其發(fā)酵結(jié)果較好。培養(yǎng)基中楊梅酵母菌+黑曲霉+青霉體積比為1∶2∶5，即為接種比例（3∶5），經(jīng)過(guò)楊梅酵母菌+黑曲霉+青霉發(fā)酵培養(yǎng)基油茶籽濕渣后，培養(yǎng)基中粗蛋白質(zhì)含量為35.67%，顯著高于單一菌種發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)含量（23.45%）。

菌種最佳組合的選取是發(fā)酵試驗(yàn)最關(guān)鍵的一步，良好的菌種決定了菌種蛋白的質(zhì)量。本研究中酵母菌和霉菌的主要優(yōu)勢(shì)為（1）能有效利用培養(yǎng)基中的碳源和氮源等；（2）繁殖周期短，生長(zhǎng)速度快；（3）沒(méi)有毒害物質(zhì)；（4）生產(chǎn)規(guī)程操作方便、穩(wěn)定。在本研究中，對(duì)油茶籽濕渣使用酵母菌和霉菌進(jìn)行混合發(fā)酵，其原因?yàn)槊咕芊纸庥筒枳褲裨睦w維素和淀粉類(lèi)物質(zhì)，將其轉(zhuǎn)化為碳源，為酵母生長(zhǎng)活動(dòng)提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，適量提高其菌體蛋白產(chǎn)量（劉曉梅，2004；Shojaosadat等，1999）。微生物在發(fā)生代謝活動(dòng)時(shí)，相互之間還會(huì)進(jìn)行協(xié)調(diào)作用，為培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)物提供足夠的能量和物質(zhì)。

當(dāng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)菌體飼料時(shí)，決定菌體蛋白質(zhì)量的是菌種種類(lèi)，影響微生物生長(zhǎng)的外部因素為生長(zhǎng)環(huán)境；影響微生物生長(zhǎng)的條件為接種比例和培養(yǎng)周期。本研究對(duì)其混合菌種的最佳組合接種比例和接種培育周期進(jìn)行對(duì)比分析，選定楊梅酵母菌+黑曲霉+青霉的組合為最佳發(fā)酵搭配，確定其最佳接種比例為3∶5；培育周期為8 d。這些結(jié)果也說(shuō)明最適宜的接種比例和培育周期是提高實(shí)驗(yàn)發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量的關(guān)鍵因素。

本研究以油茶籽濕渣為原料，添加15%麩皮和適量的水作為培養(yǎng)基，采用經(jīng)試驗(yàn)選取的最佳混合菌種組合進(jìn)行發(fā)酵，以制備飼料蛋白，其發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)含量從19.78%提高到32.17%，同時(shí)提高其飼料適口性，為菌體蛋白飼料提供足夠的蛋白來(lái)源，有利于開(kāi)發(fā)更優(yōu)質(zhì)的菌體蛋白飼料。