腸道微生物群與兒童生長間相關(guān)性的研究進(jìn)展及臨床意義

董治亞，戴彤彤

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院兒內(nèi)科，上海 200025）

兒童的生長發(fā)育受多種因素影響，已有研究表明，遺傳、營養(yǎng)、運(yùn)動、睡眠及過敏體質(zhì)等均會影響兒童的生長發(fā)育[1]。新近研究表明，腸道微生物群在哺乳動物的生長中也發(fā)揮著重要作用。腸道微生物群是由數(shù)以萬計(jì)的微生物組成，寄居于胃腸道之中，其編碼的基因約是人類基因組的150 倍[2]。研究表明，腸道微生物群廣泛參與了機(jī)體的生理反應(yīng)，且與糖尿病[3]、高血壓[4]、肥胖癥[5]等多種疾病相關(guān)。目前，在動物模型中，腸道微生物群與生長間相關(guān)性的研究已取得了一定進(jìn)展。有研究顯示，與無菌小鼠相比，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級小鼠的身長、體重明顯較高[6]。目前的研究結(jié)果表明，長期營養(yǎng)不良會導(dǎo)致生長遲緩和生長激素抵抗，而將野生型小鼠腸道中的微生物群定植到營養(yǎng)不良小鼠體內(nèi)后，后者對生長激素的敏感性明顯提高，繼而可促進(jìn)體內(nèi)胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）產(chǎn)生，改善營養(yǎng)不良所導(dǎo)致的生長緩慢。

目前，營養(yǎng)不良仍然影響著全球1.5 億5 歲以下兒童，而腸道微生物群可以改善營養(yǎng)不良動物模型的生長遲緩，這具有重大的現(xiàn)實(shí)意義[6]。然而，當(dāng)前對腸道微生物群與生長間聯(lián)系的研究主要集中于果蠅、小鼠等動物模型中，尚缺乏大規(guī)模系統(tǒng)的臨床研究。對生長遲緩兒童與正常兒童間腸道微生物群差異的研究，分析腸道微生物群在兒童生長發(fā)育中發(fā)揮的作用，從而探討腸道微生物在兒童矮小治療中的臨床意義，這可能是今后的研究重點(diǎn)。本文將就腸道微生物群在動物模型生長及兒童生長疾病中的研究進(jìn)行介紹和總結(jié)。

動物模型中腸道微生物群與生長間的相關(guān)性

幾十年來，被稱為“益生菌”的腸道微生物群補(bǔ)充劑被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)中，人們期待通過這些腸道微生物群補(bǔ)充劑來促進(jìn)家禽、家畜的生長。然而，這種促進(jìn)生長作用的機(jī)制仍然存有較大的爭議[7]。如果微生物確實(shí)可以影響生長，究竟是哪一種微生物發(fā)揮著重要作用，微生物影響機(jī)體生長的具體分子機(jī)制是什么，是否在機(jī)體中存在對機(jī)體生長起抑制作用的微生物與促進(jìn)生長的微生物相互拮抗，微生物促進(jìn)生長的機(jī)制是否具有保守性，還是普遍參與到多種動物的生長中,諸多問題亟待解決。因此，建立動物模型來驗(yàn)證腸道微生物群與生長之間的關(guān)系十分必要。已有研究顯示，在斑馬魚、小鼠等動物模型中，無菌動物體內(nèi)的IGF-1 濃度低于SPF 級動物，而IGF-1 是動物生長的重要影響因子，提示腸道微生物群與生長間可能存在一定的相關(guān)性。由于在果蠅、小鼠等模型中相關(guān)研究較為深入，本文主要介紹在果蠅和小鼠中取得的研究進(jìn)展。

一、果蠅模型中腸道微生物群與生長間相關(guān)性的研究

腸道微生物群與生長間相關(guān)性研究中，最早建立的動物模型是果蠅。動物模型顯示，在低營養(yǎng)狀態(tài)下以植物乳桿菌為主的腸道微生物群可以維持果蠅幼蟲的生長。而進(jìn)一步的機(jī)制研究顯示，腸道微生物群可能影響了果蠅體內(nèi)激素的合成，從而影響果蠅生長。

1.腸道微生物群與果蠅生長相關(guān)：Storelli 等[8]以果蠅為動物模型，建立了果蠅腸道微生物群16s RNA 基因庫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在果蠅腸道中糞腸球菌和植物乳桿菌占比優(yōu)勢明顯。隨后，研究比較了無菌果蠅與正常果蠅在相同培養(yǎng)環(huán)境下的生長狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在營養(yǎng)充足的飼養(yǎng)環(huán)境下，兩者幼蟲的生長狀態(tài)并無差異；而在營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下，無菌幼蟲羽化為成蟲的時間卻是正常果蠅羽化為成蟲時間的2 倍，但最終2 組成蟲大小間并無差異。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在完全沒有酵母的情況下（酵母可為果蠅生長提供營養(yǎng)物質(zhì)），添加植物乳桿菌可以促進(jìn)這些無菌果蠅幼蟲的生長，而相同培養(yǎng)狀態(tài)下，未添加植物乳桿菌的無菌幼蟲則會死亡。但該研究對另一種果蠅腸道優(yōu)勢菌——糞腸球菌進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果卻未觀察到類似現(xiàn)象。這些結(jié)果表明，植物乳桿菌可促使低營養(yǎng)狀態(tài)下果蠅幼蟲的生長，同時也在保證低營養(yǎng)狀態(tài)下果蠅幼蟲的存活中發(fā)揮了重要作用[8]。

2.腸道微生物群與果蠅生長相關(guān)的相關(guān)機(jī)制：有研究顯示，果蠅幼蟲的生長、發(fā)育與類固醇激素、蛻皮激素和果蠅胰島素樣肽（drosophila insulin-like peptide，DILP）相關(guān)，該研究表明，伴生植物乳桿菌的幼蟲，其胰島素受體（insulin receptor，InR）表達(dá)較低。通常，胰島素受體的表達(dá)與DILP 活性呈負(fù)相關(guān)[9]，即低胰島素受體表達(dá)代表著高DILP 活性，提示以植物乳桿菌為主的腸道微生物群會導(dǎo)致果蠅幼蟲體內(nèi)促進(jìn)生長的相關(guān)激素水平上升，從而促進(jìn)果蠅幼蟲的生長。

二、小鼠模型中腸道微生物群及其與生長間相關(guān)性的研究

僅使用果蠅等無脊椎動物作為研究對象來論證腸道微生物群與生長發(fā)育間的關(guān)系，并沒有足夠的說服力以證明腸道微生物群對生長促進(jìn)作用的普遍性，只有綜合多種動物模型，才能回答腸道微生物群與宿主生長發(fā)育間相互作用是否具有普遍性的問題。小鼠是經(jīng)典醫(yī)學(xué)研究的首選哺乳動物模型。人們比較無菌小鼠與SPF 級小鼠間的生長差異，可探究腸道微生物群在哺乳動物生長中發(fā)揮的作用。

1.腸道微生物群與斷奶后小鼠的生長相關(guān)：研究顯示，在相同環(huán)境下，給予無菌小鼠與SPF 級小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，在剛斷奶時，2 組小鼠的體重?zé)o明顯差異，而在8 周齡時，無菌小鼠的體重比SPF級小鼠輕14.5%，身長短4%。無菌動物的骨生長參數(shù)，包括股骨長度、皮質(zhì)厚度、皮質(zhì)骨分?jǐn)?shù)和股骨小梁分?jǐn)?shù)皆降低，由此推斷，腸道微生物群在斷奶后小鼠的身長及體重增加中發(fā)揮了重要作用[6]。

2.腸道微生物群與小鼠生長的相關(guān)機(jī)制：腸道微生物群的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）可能參與了機(jī)體的生長、發(fā)育。SCFA 是由腸道微生物群進(jìn)行發(fā)酵作用后仍不可消化的多糖產(chǎn)生，可調(diào)節(jié)代謝率和能量平衡，潛在介導(dǎo)腸道微生物群與生長之間的聯(lián)系。有研究顯示，給經(jīng)抗生素治療的小鼠喂食SCFA 后，小鼠體內(nèi)的IGF-1濃度上升[10]。關(guān)于增加SCFA 是否會導(dǎo)致幼鼠骨量增加，則是接下來的研究方向。

腸道微生物群與生長間的相關(guān)機(jī)制研究

腸道微生物群是近期諸多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前，許多學(xué)者已在多種動物模型中進(jìn)行了生長相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，并對腸道微生物群影響生長的機(jī)制提出了一些假設(shè)。其中，較為成熟的是“腸道微生物-能量-生長”以及“腸道微生物-代謝產(chǎn)物-生長”假說。關(guān)于腸道微生物群影響生長的具體機(jī)制尚處于探索階段，以下筆者將就能量代謝、促生長和骨重建的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行總結(jié)。

一、腸道微生物群促進(jìn)能量代謝

1.機(jī)制：腸道微生物群可能經(jīng)發(fā)酵以及提供機(jī)體消化吸收所需要的酶類等機(jī)制，影響機(jī)體的能量代謝，從而參與到生長、發(fā)育過程中。腸道微生物群在食物成分的代謝中發(fā)揮著重要作用，特別是蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物[11]。每日飲食中，大量難消化的碳水化合物經(jīng)腸道微生物群的發(fā)酵作用，產(chǎn)生大量SCFA，特別是丁酸，它是結(jié)腸細(xì)胞發(fā)揮生理功能的首要能源，故而腸道微生物群可以合成SCFA，參與能量代謝，而如失去腸道微生物群的發(fā)酵作用，這些難以消化的碳水化合物便會經(jīng)糞便形式流失，從而影響機(jī)體的營養(yǎng)狀態(tài)。

2.臨床意義：出生低體重兒的發(fā)育明顯低于同胎齡正常體重兒，研究表明，兩者間的腸道微生物群構(gòu)成存在明顯差異[12]。腸道微生物群在新生兒中的定植基本過程為，由兼性厭氧微生物定植逐步發(fā)展到嚴(yán)格的厭氧菌定植。在健康的足月嬰兒腸道中，雙歧桿菌和擬桿菌等厭氧菌可能在第1 周內(nèi)達(dá)到高水平，但在低出生體重嬰兒腸道中，這種從兼性厭氧菌到嚴(yán)格厭氧菌的轉(zhuǎn)換過程被明顯延遲和擾亂，低出生體重嬰兒的腸道菌群分布表現(xiàn)為更高水平的兼性厭氧微生物定植，如腸桿菌科、腸球菌科、大腸桿菌、腸球菌屬、肺炎克雷伯菌、葡萄球菌屬等，而雙歧桿菌、類桿菌等嚴(yán)格厭氧菌的定植水平降低[12]。雙歧桿菌和類桿菌有利于母乳的消化，因人乳寡糖是母乳的重要營養(yǎng)成分，而嬰兒體內(nèi)缺乏乳寡糖消化所需的酶，難以消化的碳水化合物傳遞至腸道下部，由雙歧桿菌等腸道微生物消化，為嬰兒期的生長發(fā)育提供能量及營養(yǎng)[13]。出生低體重嬰兒體內(nèi)的雙歧桿菌等嚴(yán)格厭氧菌減少，因而影響其生長、發(fā)育。

二、腸道微生物群誘導(dǎo)IGF-1 的產(chǎn)生

已知IGF-1 對骨骼生長具有促進(jìn)作用，與野生型小鼠相比，無菌小鼠的血清IGF-1 水平明顯降低，同時保持無菌狀態(tài)的小鼠與再次定植常規(guī)腸道微生物群的無菌小鼠相比，后者血清中IGF-1 濃度較高[10]。隨著人們對抗生素和腸道微生物群間關(guān)系的逐漸了解，在飼喂小鼠過程中加入特定抗生素，可以此來影響其腸道微生物群構(gòu)成。有研究顯示，口服萬古霉素（針對腸道中革蘭陽性菌的抗生素）治療后，小鼠血循環(huán)中的IGF-1 降低，血清中的骨形成標(biāo)志物Ⅰ型膠原蛋白的N 端前肽（N-terminal propeptide of typeⅠcollage,P1NP）濃度也下降[14]。與IGF-1、P1N1 增加相對應(yīng)的是，腸道微生物群的定植增加了骨形成，導(dǎo)致股骨長度增加，因此與無菌小鼠相比，SPF 小鼠的股骨長度、皮質(zhì)厚度、骨小梁明顯增加[15]。這些研究皆表明，腸道微生物群可以促進(jìn)IGF-1 的產(chǎn)生，并影響骨的形成，從而發(fā)揮促進(jìn)生長的作用。

不同腸道菌屬對IGF-1 的產(chǎn)生可能具有不同的影響。與無菌幼鼠相比，常規(guī)幼鼠肝臟的IGF-1基因表達(dá)上調(diào)[6]，而給雞喂食了植物乳桿菌后，其肝臟IGF-1 基因的表達(dá)更高。腸道微生物群似乎可經(jīng)由調(diào)節(jié)IGF-1 基因表達(dá)從而影響IGF-1 的產(chǎn)生。肝臟是循環(huán)中IGF-1 的主要來源，同時，肌肉細(xì)胞、骨、脂肪也會產(chǎn)生IGF-1，經(jīng)旁分泌和自分泌效應(yīng)影響生長。此外，最近報道白色脂肪組織也會產(chǎn)生足量的IGF-1 分泌到循環(huán)中[16]。研究提示，在大腸桿菌O21∶H+定植于動物后，白色脂肪組織中的IGF-1 mRNA 和蛋白水平顯著升高，而肝臟和肌肉中的IGF-1 表達(dá)沒有變化[17]。

然而，目前對于腸道微生物群影響IGF-1 水平的具體分子機(jī)制仍然沒有明確，需要進(jìn)一步進(jìn)行探討和研究。

三、腸道微生物群介導(dǎo)骨重建機(jī)制（見圖1）

圖1 腸道微生物群介導(dǎo)骨重建機(jī)制

目前，腸道微生物群介導(dǎo)骨重建的機(jī)制有如下幾種。

1.IGF-1 介導(dǎo)成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)骨形成：骨重建是由破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞調(diào)控的，骨形成比骨吸收活躍則可觀察到凈合成代謝，骨吸收比骨形成活躍則可觀察到骨的分解代謝。早期研究顯示，與常規(guī)飼養(yǎng)的小鼠相比，無菌小鼠骨表面的破骨細(xì)胞數(shù)量減少，骨量增加，這似乎表明腸道微生物群可以激活骨吸收破骨細(xì)胞來刺激骨的丟失[18]。新近研究顯示，無菌小鼠體內(nèi)的IGF-1 濃度明顯低于常規(guī)飼養(yǎng)小鼠，提示腸道微生物群可能通過IGF-1 介導(dǎo)了骨形成[19]。

2.SCFA 誘導(dǎo)IGF-1 生成介導(dǎo)骨重建：研究表明，IGF-1 濃度與SCFA 濃度相關(guān)，給經(jīng)抗生素處理的小鼠補(bǔ)充SCFA 后，小鼠肝臟和脂肪產(chǎn)生IGF-1 增加，因而循環(huán)中的IGF-1 濃度也升高，表明了補(bǔ)充SCFA 后，體內(nèi)IGF-1 濃度的升高間接影響了骨形成。比較無菌小鼠與腸道定植微生物群后的無菌小鼠的生長狀態(tài)，根據(jù)顯微CT 和組織學(xué)的測量發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群定植小鼠的長骨生長板明顯更厚，并有更多肥大的軟骨細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明，在腸道微生物群定植小鼠中有更活躍的軟骨內(nèi)骨化，這可能會改變長骨的縱向生長[10]。

3.SCFA 通過G 蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled-receptor，GPCR)直接影響骨重建：腸道微生物群產(chǎn)生的SCFA，除了可增加IGF-1 濃度從而間接參與骨形成外，也可能直接參與了骨的生理調(diào)節(jié)。隨著SCFA 受體GPCR（特別是GPR41、GPR43）被發(fā)現(xiàn)，SCFA 的作用逐漸受到重視。丁酸鈉對破骨細(xì)胞分化的抑制作用已被證實(shí)[20]。研究表明，破骨細(xì)胞前體可以表達(dá)SCFA 受體，而丁酸鹽和丙酸鹽可以激活GPCR，從而抑制破骨細(xì)胞的分化，導(dǎo)致骨吸收降低，在機(jī)體內(nèi)表現(xiàn)為骨的凈合成代謝[19]。因此，腸道微生物群可能增加腸道內(nèi)SCFA 的產(chǎn)生，從而抑制骨吸收，促使骨重建。

腸道微生物群與各類生長遲緩疾病的相關(guān)性研究及臨床意義

一、腸道微生物群與特發(fā)性身材矮?。╥diopathic short stature，ISS）的研究

ISS 占身材矮小癥的60%～80%[21]，是一種病因不明的兒童身材矮小的總稱。ISS 的病因較為復(fù)雜，與遺傳、營養(yǎng)等多種因素相關(guān)，但仍有很多尚未明了的機(jī)制。腸道微生物群與生長間的相關(guān)性在動物模型中已經(jīng)得到證實(shí)，這為ISS 發(fā)病機(jī)制的研究提供了新方向。

李林等[22]對ISS 與健康兒童進(jìn)行研究，探討腸道微生物群對兒童生長、發(fā)育的影響。該研究經(jīng)過嚴(yán)格篩選，入選了16 例ISS 患兒和16 名同地區(qū)身高正常的健康兒童，以糞便中細(xì)菌16S rRNA V3～4區(qū)域作為目標(biāo)片段，采用第二代測序技術(shù)對其進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2 組兒童的腸道微生物群豐度和菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異。ISS 患兒腸道微生物群的豐度明顯低于健康兒童（P<0.05），加權(quán)主坐標(biāo)分析顯示，2 組腸道微生物群的構(gòu)成存在差異。線性分析結(jié)果顯示，ISS 組柔嫩梭菌屬、真桿菌屬等與身高呈正相關(guān)的菌屬豐度較低，而副擬桿菌屬、梭菌屬等與身高呈負(fù)相關(guān)的菌屬豐度較高。同時，對2 組兒童血液中IGF-1 濃度的分析顯示，ISS 組的血液IGF-1濃度較健康兒童降低。故該研究推測，ISS 患兒由于腸道微生物群的紊亂導(dǎo)致了體內(nèi)合成IGF-1 減少，從而造成身材矮小[15]。

該研究首次使用第二代測序技術(shù)，分析ISS 患者與健康兒童腸道微生物群之間的差異，為探索ISS 的發(fā)病機(jī)制及尋求更加安全、有效的ISS 診療方案提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。目前，國內(nèi)外尚無其他的腸道微生物群與兒童矮小癥間相關(guān)性的研究，但此方面的研究可能是今后探索兒童矮小癥發(fā)病機(jī)制及治療的一個方向。

二、腸道微生物群與小于胎齡兒（small forgestational age，SGA）生長追趕（catch-up growth，CUG）的相關(guān)性研究

約有87%的SGA 患兒在2 歲時身長提升到-2SD 以上，這部分兒童被稱為CUG-SGA，但仍有少數(shù)患兒未實(shí)現(xiàn)生長追趕（non-catch-up growth，NCUG），稱為NCUG-SGA[23]。

安靜靜等[24]建立了SGA 幼鼠模型，以探究腸道微生物群在SGA-CUG 生長追趕中的作用。該實(shí)驗(yàn)將SGA 幼鼠劃分為CUG-SGA及NCUG-SGA 2 組，通過對2 組幼鼠的腸道微生物群進(jìn)行Alpha 多樣性分析及主坐標(biāo)分析，發(fā)現(xiàn)2 組幼鼠腸道微生物群的多樣性、豐度以及菌群構(gòu)成存在顯著差異，CUGSGA 組腸道微生物群的多樣性高于NCUG-SGA組，同時CUG-SGA 組糞便中SCFA 水平以及血液IGF-1 水平明顯高于NCUG 組。相關(guān)分析顯示，SGA幼鼠腸道中11 種菌屬的相對豐度與SCFA 濃度明顯相關(guān)，證明SCFA 的產(chǎn)生與腸道微生物群密切相關(guān)，特別是丁酸弧菌，其與SCFA 中的丁酸、異丁酸、戊酸濃度呈顯著正相關(guān)，提示丁酸弧菌可能是產(chǎn)生SCFA 的主要菌屬。Spearman 相關(guān)分析顯示，腸道SCFA 與幼鼠的體重、身長以及血IGF-1 濃度顯著相關(guān)。故該研究提出，腸道微生物群，特別是丁酸弧菌，可增加幼鼠體內(nèi)的SCFA 濃度，誘導(dǎo)IGF-1產(chǎn)生，從而促進(jìn)SGA 幼鼠的CUG。該研究比較了CUG-SGA 組與NCUG-SGA 組間的腸道微生物群差異，驗(yàn)證腸道微生物群與CUG 間的相關(guān)性，提出SCFA 可能是參與到CUG 中的代謝產(chǎn)物，為SGA的CUG 機(jī)制提供新的研究思路。該研究結(jié)果提示，腸道微生物群可能與SGA 的CUG 相關(guān)聯(lián)，但因存在著物種差異，在兒童中是否存在相同的發(fā)病機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

總結(jié)與展望

腸道微生物群編碼著人類基因組約150 倍的基因，廣泛參與了機(jī)體的生理過程，在生長、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。盡管腸道微生物群促進(jìn)生長的具體機(jī)制仍在研究中，腸道微生物群與生長的相關(guān)性研究仍然為矮小的臨床治療帶來新的方向。腸道微生物群與生長間的相關(guān)性研究目前主要集中在動物模型中，以人群為研究對象的則較少，在人群中探索腸道微生物群對生長的影響，對矮小癥的發(fā)病機(jī)制研究及治療具有重要意義。