高效液相色譜技術(shù)聯(lián)合紅細胞參數(shù)在血紅蛋白病篩查中的應(yīng)用

王也飛，吳蓓穎，夏文權(quán)，陳 寧，胡翊群

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗系，上海 200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海 200025；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025）

血紅蛋白（hemoglobin,Hb）病是由于珠蛋白基因突變或缺如引起的單基因遺傳病，可分為兩大類，其中一類是由于珠蛋白基因的缺陷使Hb 中的一種或幾種珠蛋白肽鏈合成減少或不能合成，導(dǎo)致Hb 組分改變，稱為珠蛋白生成障礙性貧血（又稱地中海貧血，簡稱地貧）。迄今為止，世界范圍內(nèi)約有1.5%的人群（8 000 萬～9 000 萬人）攜帶β-珠蛋白生成障礙性貧血基因。20 世紀80年代，我國20 個省、市、自治區(qū)共60 萬人的Hb 病調(diào)查結(jié)果顯示，β-珠蛋白生成障礙性貧血的患病率約為0.67%[1]。另一類Hb 病是由于珠蛋白基因變異導(dǎo)致其分子結(jié)構(gòu)異常，形成Hb 變異體，故稱為異常Hb 病。在我國廣東、廣西和海南等地，異常Hb 病突變基因的人群攜帶率較高，為0.285%～0.479%[2]。

目前，基因檢測仍是診斷Hb 病最可靠的方法，但其方法繁瑣，且常規(guī)的珠蛋白生成障礙性貧血基因篩查無法檢出少見類型的Hb 變異體。隨著全自動血紅蛋白分析儀的問世，在我國尤其是兩廣地區(qū)已開始將高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）技術(shù)應(yīng)用于珠蛋白生成障礙性貧血的篩查。上海地區(qū)并非珠蛋白生成障礙性貧血或異常Hb 病的高發(fā)地區(qū)，但隨著人口流動，近年來由本實驗室確診的病例數(shù)呈逐年增多趨勢。作為本地區(qū)標(biāo)本量最大、最早采用HPLC 法進行Hb 病篩查的實驗室，本研究應(yīng)用HPLC 檢測聯(lián)合紅細胞參數(shù)測定，對1 029 例篩查樣本進行分析，同時與基因檢測結(jié)果進行比較，旨在探討HPLC檢測和紅細胞參數(shù)分析在上海地區(qū)Hb 病篩查中的實際應(yīng)用價值，分析結(jié)果總結(jié)如下。

資料與方法

一、資料

收集2014年11 月至2018年12 月期間，至上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院門診就診及住院進一步診治的疑似Hb 病患者（伴有小細胞低色素性貧血、黃疸或脾腫大等癥狀者）或存在進行溶血性貧血的患者，共1 029 例，其中女性700 例，男性329 例，年齡為1 個月～95 歲。

二、方法

1.紅細胞參數(shù)測定及血涂片檢查紅細胞形態(tài)：所有研究對象均抽取靜脈血，其中2 mL 置于乙二胺四乙酸二鉀抗凝管內(nèi)。采用希森美康XE-2100 全自動血細胞分析儀及配套試劑測定紅細胞參數(shù)，包括紅細胞計數(shù)、Hb、平均紅細胞體積（mean corpuscular volume,MCV）、平均紅細胞血紅蛋白量（mean corpuscular hemoglobin,MCH）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（mean corpuscular hemoglobin contentration MCHC）等。

2.HPLC 法Hb 分析：取2 mL 靜脈血置于乙二胺四乙酸二鉀抗凝管中，采用美國伯樂公司VARIANT Ⅱ高效液相色譜分析儀及配套試劑進行檢測，運行程序為β-珠蛋白生成障礙性貧血短程序，運行約6.5 min 后，由儀器自動分析定量計算全血中Hb 各成分，并顯示出圖譜和結(jié)果。對于貧血嚴重的標(biāo)本，取5 μL 全血，用1 mL 溶血緩沖液稀釋后再上機分析。根據(jù)各Hb 變異體的滯留時間，將HPLC 系統(tǒng)的出峰圖形依次分為P1窗、F窗、P2窗、P3窗、A0窗、A2窗、D窗、S窗和C窗，結(jié)合Hb 變異體在HPLC 檢測中的滯留時間、在總Hb 中的百分含量及色譜圖形特征對其進行鑒定。

3.珠蛋白生成障礙性貧血基因分析：采用聚合酶鏈反應(yīng)和反向斑點雜交技術(shù)檢測17 種國人常見的β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變和非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血的3 種基因突變（αCSα、αQSα、αWSα）；采用缺口聚合酶鏈反應(yīng)法結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測3 種缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血（--SEA、-α3.7、-α4.2），以上統(tǒng)稱為“常見珠蛋白生成障礙性貧血基因”。對HPLC 檢測出現(xiàn)異常峰譜，而常見珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測呈陰性者，采用DNA 測序技術(shù)對α-珠蛋白和β-珠蛋白基因外顯子進行序列分析。所用試劑盒均購自亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作、質(zhì)量控制及結(jié)果判斷。根據(jù)檢測結(jié)果，將常見珠蛋白生成障礙性貧血基因和DNA 測序均未發(fā)現(xiàn)異常者作為基因檢測陰性組，出現(xiàn)異常則作為基因檢測陽性組。

4.判斷標(biāo)準：Hb 病篩查中，患者血樣本中血紅 蛋 白A2（hemoglobin A2,HbA2）降 低（<2.5%）和（或）出現(xiàn)快速區(qū)帶時判斷為α-珠蛋白生成障礙性貧血，HbA2和血紅蛋白F（hemoglobin F,HbF）1 項或2 項均增高（參考值范圍HbA22.5%～3.5%，HbF<1.5%）時判斷為β-珠蛋白生成障礙性貧血。

5.統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件和MedCalc 軟件進處理分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準差（）表示，組間比較采用t 檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。繪制受試者操作特征曲線，確定HbA2及紅細胞參數(shù)篩查Hb 病的臨界值。

結(jié)果

一、珠蛋白基因檢測結(jié)果

1 029 例患者經(jīng)基因檢測，有591 例（57.43%）被確診為珠蛋白生成障礙性貧血，14 例（1.36%）被確診為異常Hb 病，2 例發(fā)現(xiàn)了單純β 珠蛋白基因（HBB）c.9T>C 組氨酸同義突變（未導(dǎo)致Hb 變異體的形成）。本研究中患者以β-珠蛋白生成障礙性貧血最多見(403/1 029,39.16%)，珠蛋白基因分析結(jié)果分布情況見圖1。本研究共檢測出19 種β-珠蛋白生成障礙性貧血基因型，其中以β654/βN 最多見(168/1 029,16.33%)；共檢測出10 種α-珠蛋白生成障礙性貧血基因型，其中以--SEA/αα 最常見(119/1 029,11.56%)。不同Hb 病的HbA2和HbF 檢測值范圍見表1，各類珠蛋白生成障礙性貧血基因型構(gòu)成比見圖2。

圖2 各基因型構(gòu)成比

表1 1 029 例珠蛋白基因分析結(jié)果及HbA2 和HbF 檢測值范圍

圖1 珠蛋白基因分析結(jié)果分布

二、紅細胞參數(shù)測定、血涂片檢查與HPLC 結(jié)果

1 029 例患者的血樣本經(jīng)HPLC 法檢測，有439 例HbA2>3.5%，其中423 例（96.4%）經(jīng)基因診斷確診為β-珠蛋白生成障礙性貧血、αβ-珠蛋白生成障礙性貧血和Hb 變異體（見圖3A、3B、3E、3F），其HbA2值為3.6%～72.7%。這423 例患者的外周血紅細胞參數(shù)檢測結(jié)果主要表現(xiàn)為紅細胞計數(shù)降低、增高或正常，輕度至中度貧血，血象呈小細胞低色素性改變。

另經(jīng)HPLC 檢測檢出存在快速區(qū)帶[（0.125±0.021）min 和（0.406±0.091）min 處]者共40 例（見圖3C、3D），經(jīng)基因診斷其中39 例被確診為HbH病，占97.5%（39/40），其HbA2值為0～2.1%，外周血紅細胞參數(shù)檢測結(jié)果表現(xiàn)為紅細胞計數(shù)正?；蚪档?，輕至中度貧血，血象呈小細胞低色素性改變，伴明顯異型性。

圖3 血紅蛋白HPLC 分析圖譜

1 029 例患者中，經(jīng)基因檢測顯示，其中珠蛋白基因陰性者有422 例，其HbA2值為0～6.2%?；驒z測陰性組與α 珠蛋白生成障礙性貧血（標(biāo)準型和靜止型）組（P=0.421>0.05）間HbA2水平比較，β-珠蛋白生成障礙性貧血組與αβ-珠蛋白生成障礙性貧血組（P=0.572>0.05）間HbA2水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余各疾病組間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）?；驒z測陰性組與珠蛋白生成障礙性貧血組及異常Hb 病組間比較，RBC、MCV、MCH值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（見表2）。

表2 各組HbA2及RBC 參數(shù)均值比較（ ）

表2 各組HbA2及RBC 參數(shù)均值比較（ ）

Hb：血紅蛋白；MCV：平均紅細胞體積；MCH：平均紅細胞血紅蛋白量；MCHC：平均紅細胞血紅蛋白濃度。

對HPLC 圖形異常，但常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因篩查為陰性的標(biāo)本，根據(jù)HPLC 中Hb 變異體的洗脫時間、在總Hb 中的百分含量和色譜圖形特征，結(jié)合基因分析結(jié)果，通過HbVar（http://globin.cse.psu.edu/hbvar/menu.html）進行比對，共發(fā)現(xiàn)了14 例共10 種Hb 變異體，分別為Hb E（2 例）、Hb Q-Thailand（2 例）、Hb Youngstown（2 例）、Hb GTaipei（2 例）、Hb Tamano（1 例）、Hb G-Siriraj（1 例）、Hb Guangzhou-Hangzhou（1 例）、Hb M-Boston（1 例）、Hb J-Baltimore（1 例）和Hb J-Sicilia（1 例），2 例Hb Q 均檢測出缺失型α 地中海貧血基因型-α4.2。各種異常Hb 的HPLC 色譜圖見圖4。

圖4 各種異常Hb 的HPLC 色譜圖

三、HPLC 檢測HbA2 診斷β-珠蛋白生成障礙性貧血的效能

以基因檢測結(jié)果作為診斷β-珠蛋白生成障礙性貧血(攜帶者和輕型)的金標(biāo)準，根據(jù)HPLC 檢測HbA2的結(jié)果，利用MedCalc 軟件繪制受試者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線，診斷β-珠蛋白生成障礙性貧血曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.962（P=0.000 1），HbA2>3.9%時，其診斷靈敏度為95.84%，特異度為96.87%，陽性似然比30.67%，陰性似然比0.043%，陽性預(yù)測值95.40%，陰性預(yù)測值97.20%（見圖5A）。

四、HPLC 診斷α-珠蛋白生成障礙性貧血的效能

以基因檢測結(jié)果作為診斷α-珠蛋白生成障礙性貧血（靜止型、標(biāo)準型和HbH 病）的金標(biāo)準，根據(jù)HPLC 檢測α-珠蛋白生成障礙性貧血（靜止型和標(biāo)準型）HbA2的結(jié)果，利用MedCalc 軟件繪制ROC曲線，最大AUC 為0.753（P=0.000 1），HbA2≤3.2%時的診斷α-珠蛋白生成障礙性貧血（靜止型、標(biāo)準型）靈敏度為97.76%，特異度為53.11%，陽性似然比2.09%，陰性似然比0.042%，陽性預(yù)測值24.0%，陰性預(yù)測值99.4%。HPLC 檢測中間型α-珠蛋白生成障礙性貧血（HbH?。〩bA2的結(jié)果，AUC為0.990（P=0.000 1），HbA2≤2.1%時的診斷中間型α-珠蛋白生成障礙性貧血的靈敏度為100.0%，特異度為96.32%，陽性似然比27.14%，陰性似然比0，陽性預(yù)測值52.6%，陰性預(yù)測值100.0%。α-珠蛋白生成障礙性貧血（靜止型和標(biāo)準型）的AUC 與中間型α-珠蛋白生成障礙性貧血（HbH ?。┑腁UC 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.000 1）（見圖5B、5C）。

圖5 HPLC 檢測HbA2 診斷α-和β-珠蛋白生成障礙性貧血患者的ROC 曲線

五、紅細胞參數(shù)診斷α-、β-和αβ-珠蛋白生成障礙性貧血

以基因診斷的結(jié)果作為診斷珠蛋白生成障礙性貧血（α-、β-和αβ-）的金標(biāo)準，檢測珠蛋白生成障礙性貧血患者MCV 的結(jié)果，利用MedCalc 軟件繪制ROC 曲線，AUC 為0.870（P=0.000 1），取MCV 73.3 fl 作為臨界值時的診斷靈敏度為87.98%，特異度為77.51%，陽性似然比為3.91%，陰性似然比為0.16%，陽性預(yù)測值為84.3%，陰性預(yù)測值為82.4%。檢測珠蛋白生成障礙性貧血患者MCH 的結(jié)果，AUC 為0.829（P=0.000 1），取MCH 23.5 pg 作為臨界值時的診斷靈敏度為93.73%，特異度為69.86%，陽性似然比為3.11%，陰性似然比為0.09%，陽性預(yù)測值為81.0%，陰性預(yù)測值為89.0%。MCHC 檢測診斷珠蛋白生成障礙性貧血的AUC 為0.639（P=0.000 1），取MCHC 324 g/L 作為臨界值時的診斷靈敏度為89.20%，特異度為47.61%，陽性似然比為1.70%，陰性似然比為0.23%，陽性預(yù)測值為70.0%，陰性預(yù)測值為76.2%（見圖6）。

圖6 MCV、MCH 和MCHC 檢測診斷珠蛋白生成障礙性貧血患者的ROC 曲線

六、HPLC 檢測及紅細胞參數(shù)輔助診斷β-和中間型α-珠蛋白生成障礙性貧血

HPLC 檢測聯(lián)合紅細胞平均指數(shù)篩查β-和中間型α-珠蛋白生成障礙性貧血的結(jié)果與基因檢測結(jié)果間的一致性強（Kappa=0.926，P<0.001）。以基因檢測結(jié)果作為診斷珠蛋白生成障礙性貧血的金標(biāo)準，比較HbA2和紅細胞平均參數(shù)對β-珠蛋白生成障礙性貧血和中間型α-珠蛋白生成障礙性貧血（HbH ?。┑暮Y查價值，利用MedCalc 軟件繪制ROC 曲線（見圖7），HbA2、MCV、MCH 和MCHC 檢測診斷β-珠蛋白生成障礙性貧血的AUC 依次為0.962、0.815、0.763 和0.552；診斷HbH 病的AUC依次為0.990、0.749、0.849 和0.829。

圖7 HbA2 和紅細胞平均參數(shù)診斷珠蛋白生成障礙性貧血的ROC 曲線

討 論

Hb 病中珠蛋白生成障礙性貧血是由于基因缺失或突變造成珠蛋白肽鏈合成速率改變的遺傳性溶血性疾病，較常見的受累基因為α-和β-珠蛋白基因，分別導(dǎo)致α-和β-或αβ-珠蛋白生成障礙性貧血，而異常Hb 病是珠蛋白基因缺陷導(dǎo)致珠蛋白肽鏈分子結(jié)構(gòu)異常而形成Hb 變異體的疾病。臨床上對Hb 病的表型篩查主要依靠紅細胞平均參數(shù)和（或）Hb 分析，基因型的確診則需要采用基因診斷。對疑似患者血液中的各種Hb 進行定性和定量分析是一種快速、可靠的表型篩查方法。

一、HPLC 檢測HbA2 的最佳臨界值建立

HPLC 是以離子交換作為工作原理，利用攜帶負電荷的層析柱和珠蛋白成分的電荷差異進行分離，帶正電荷越強的Hb，洗脫時間越長，在分離的同時，根據(jù)出峰位置可以定性，根據(jù)峰的面積可以定量。HPLC 檢測能快速、簡便、準確地對Hb 進行分析。國內(nèi)文獻報道[3]，瓊脂糖凝膠電泳法檢測中，可 以HbA2≥4.0%、HbA2≥3.9%、HbA2≥3.8%、HbA2≥3.5%為臨界值診斷β-珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者；而HPLC 法檢測中，可以HbA2≥4.0%、HbA2≥3.8%、HbA2≥3.45%為臨界值診斷β-珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者[4-7]。因此，不同的電泳方法必須制定各自的HbA2臨界值，各實驗室也有必要建立自己的HPLC 檢測HbA2的最佳臨界值，以提高β-珠蛋白生成障礙性貧血篩查試驗的準確性[8]。

二、紅細胞參數(shù)在輔助診斷珠蛋白生成障礙性貧血中的價值

文獻報道，當(dāng)同時MCV<80 fl、MCH<27 pg及HbA2>3.5%，即提示受檢者可能為β-珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶者，即輕型雜合子[9]。當(dāng)MCV<80 fl、MCH<27 pg 時；而HbA2正?；蚱停崾臼軝z者可能為α-珠蛋白生成障礙性貧血或αβ-珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶者。陳雅斌等[10]認為，MCV<82.1 fl 和（或）MCH<27.3 pg 聯(lián)合HbA2<3.05%或HbA2>3.90%標(biāo)準在珠蛋白生成障礙性貧血篩查中具有較好的診斷效能。本研究中α-珠蛋白生成障礙性貧血、β-珠蛋白生成障礙性貧血和αβ-珠蛋白生成障礙性貧血患者的MCV 和MCH 值均明顯低于非Hb 病者，而紅細胞計數(shù)明顯高于非Hb病者。以MCV≤73.3 fl、MCH≤23.5 pg、MCHC≤324 g/L 診斷受試各組珠蛋白生成障礙性貧血的靈敏度和特異度均較高。

異常Hb 病組的MCV、MCH 明顯高于基因陰性組，紅細胞計數(shù)則明顯低于基因陰性組，MCHC均值與基因陰性組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。原因可能在于本研究納入的異常Hb 病患者多伴隨其他血液病，從而掩蓋了因Hb 自身因素對紅細胞參數(shù)的影響。

三、HPLC 檢測篩查Hb 病的價值

鑒于上海地區(qū)不屬于Hb 病的高發(fā)區(qū)域，但隨著流動人口的增加以及外來人口的遷入，造成了上海地區(qū)Hb 病患者人數(shù)有了一定增長。采用HPLC檢測對Hb 進行分析，檢測效率和準確率均較高，因此本研究選擇用該法作為快速篩查Hb 病的首選方法。本實驗室在上海地區(qū)率先使用BIO-RAD VARIANT Ⅱ高效液相色譜分析儀對1 029 例臨床疑似Hb 病或行溶血篩查的標(biāo)本進行Hb 分析，結(jié)果顯示HbA2>3.9%診斷β-珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶者的靈敏度和特異度最高；HbA2≤2.1%診斷中間型α-珠蛋白生成障礙性貧血（HbH ?。┑撵`敏度和特異度最高，結(jié)合快速區(qū)帶的檢出，可準確篩查出該型α-珠蛋白生成障礙性貧血患者。這與馬升俊等[11]的報道相近，提示采用HPLC 檢測Hb對中間型α-珠蛋白生成障礙性貧血（HbH ?。┯休^高的診斷準確率，而采用該方法診斷靜止型和標(biāo)準型α-珠蛋白生成障礙性貧血則容易存在漏診。

本研究比較了HbA2和紅細胞平均參數(shù)對Hb病的篩查價值后發(fā)現(xiàn)，以上指標(biāo)篩查β-珠蛋白生成障礙性貧血的價值由高至低依次為HbA2、MCV、MCH、MCHC；篩查中間型α-珠蛋白生成障礙性貧血（HbH ?。┑膬r值由高至低依次為HbA2、MCH、MCHC、MCV。MCV≤73.2 fl、MCH≤23.5 pg、MCHC≤326 g/L、HbA2>3.9%對β-珠蛋白生成障礙性貧血的篩查具有較好的效能；MCV≤65.2 fl、MCH≤19.5 pg、MCHC≤301 g/L 且HPLC 法檢測HbA2≤2.1%，并伴快速區(qū)帶，篩查中間型α-珠蛋白生成障礙性貧血（HbH ?。┑男茌^佳；對于紅細胞計數(shù)正?；蛏撸t細胞平均參數(shù)明顯低于正常，而貧血程度較輕或無貧血者，HPLC 檢測Hb 顯示HbA2正?；蚱蜁r，應(yīng)考慮進行α-珠蛋白生成障礙性貧血基因分析，以免漏診靜止型和標(biāo)準型α-珠蛋白生成障礙性貧血。

總之，應(yīng)用HPLC 分析Hb 和紅細胞參數(shù)（MCV、MCH 和MCHC 等）診斷β-珠蛋白生成障礙性貧血、中間型α-珠蛋白生成障礙性貧血（HbH病）和異常Hb 病有較高的準確率，可用于該類Hb病的快速篩查，尤其在Hb 病非高發(fā)區(qū)，應(yīng)用此法進行篩查，可減少基因檢測的費用和時間，有一定的臨床價值和實用性。對于少見的異常Hb 病，可在HPLC 篩查基礎(chǔ)上再進行基因診斷，能提高此類疾病的陽性檢出率。對靜止型和標(biāo)準型α-珠蛋白生成障礙性貧血特異度和陽性預(yù)測值均較低，應(yīng)結(jié)合臨床資料和基因檢測來進行綜合分析，以降低漏診率。