肉制品中狗、狐、貂源性成分DNA檢測試劑盒的制備

賈慧建 王天添 趙遠(yuǎn) 宋順佳 邵學(xué)超 艾金霞 孫麗媛

摘 要：為快速檢測肉制品中狗、狐、貂3 種常見犬型總科動物源性DNA成分，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)分析種屬基因組序列差異，建立并優(yōu)化多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測體系，開發(fā)快速檢測試劑盒。結(jié)果表明：快速檢測試劑盒特異性良好，與常見肉類動物（豬、牛、羊、馬、驢、雞、鴨）源性DNA成分皆無交叉反應(yīng);靈敏度高，3 種靶標(biāo)樣品DNA質(zhì)量濃度同時降至10-4 ng/?L，仍可準(zhǔn)確檢測;陽性條帶經(jīng)切膠回收、克隆轉(zhuǎn)化、測序比對，與GenBank已登記的狗（MH105046.1）、狐（LT560065.1）、貂物種（KU145464.1）相似性為100%;對30 份模擬混合肉樣進(jìn)行鑒別檢測，檢測結(jié)果與預(yù)設(shè)混合情況完全相符;50 份市售樣品中，狗肉樣品中3 份出現(xiàn)摻假現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞：狗肉;狐肉;貂肉;DNA;試劑盒

Development of DNA Detection Kit for Dog， Fox and Mink-Derived Components in Adulterated Meat Products

JIA Huijian， WANG Tiantian， ZHAO Yuan， SONG Shunjia， SHAO Xuechao， AI Jinxia， SUN Liyuan*

（School of Medical Technology， Beihua University， Jilin 132013， China）

Abstract： In order to rapidly detect DNA derived from the common Canidae animals dog， fox and mink in adulterated meat products， molecular biology technology was applied to analyze the differences in the genomic sequence of various species， and a multiplex polymerase chain reaction system was establish and optimized to develop rapid detection kits. The results showed that the developed kit had good specificity without cross-reaction with common food-producing animal-derived DNA components （pigs， cattle， sheep， horses， donkeys， chickens and ducks）， as well as high sensitivity. When the DNA concentration of the three target samples decreased to 10-4 ng/?L at the same time， they still could be accurately detected using the kit. The positive bands were excised， cloned and sequenced， showing 100% similarity to the dog （MH105046.1）， fox （LT560065.1） and mink （KU145464.1） sequences deposited in the GenBank database. This kit correctly identified 30 simulated mixed meat samples with 100% accuracy. Of 50 commercially available samples， three dog meat samples were found to be adulterated.

Keywords： dog meat; fox meat; mink meat; DNA; kit

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210311-064

中圖分類號：TS251.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2021）08-0048-06

引文格式：

賈慧建， 王天添， 趙遠(yuǎn)， 等. 肉制品中狗、狐、貂源性成分DNA檢測試劑盒的制備[J]. 肉類研究， 2021， 35（8）： 48-53. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210311-064.? ? http：//www.rlyj.net.cn

JIA Huijian， WANG Tiantian， ZHAO Yuan， et al. Development of DNA detection kit for dog， fox and mink-derived components in adulterated meat products[J]. Meat Research， 2021， 35（8）： 48-53. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210311-064.

http：//www.rlyj.net.cn

狐、貂與狗同屬犬型總科動物，攜帶多種病毒，貿(mào)然食用易對食用者身體健康造成潛在威脅[1-2]。新型冠狀病毒肺炎的全球性肆虐，也在警醒食用野生動物的危險性[3-5]。為更好避免潛在的病毒威脅，我國對此作出了一系列舉措。2020年2月24日，全國人大委員會通過了關(guān)于革除濫食野生動物陋習(xí)的相關(guān)決定。同年3月31日，深圳市正式立法，狗肉缺席“白名單”[6]，狐、貂僅作為藥用。因此，亟需建立一種快速準(zhǔn)確檢測狗、狐、貂源性成分的方法，為立法后的監(jiān)管提供便利。

肉質(zhì)成分檢測多以形態(tài)學(xué)[7]、代謝學(xué)[8-9]、蛋白質(zhì)學(xué)[10-11]和基因?qū)W差異[12-14]作為切入點(diǎn)。目前，分子生物學(xué)技術(shù)是肉及制品檢測的常用技術(shù)[15]。近年來，頻頻爆出肉類摻假的新聞，肉類質(zhì)量安全監(jiān)管變得愈加迫切。

史瑩瑩等[16]應(yīng)用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法鑒定肉制品中牛源性成分。Li Tingting等[17]建立了一種基于對照引物的實(shí)時熒光定量PCR方法，用于豬肉中摻假山羊肉的定量檢測。張秀平等[18]應(yīng)用微滴數(shù)字PCR定量檢測鴨源性成分。以上方法可以完成定量檢測，但對于快速定性檢測無疑增加了成本。多重PCR方法可以同時檢測多個核酸片段，適合肉制品中動物源性成分鑒定[19]，利于市場監(jiān)管，有更廣泛的市場應(yīng)用價值。Li Xinnan等[20]應(yīng)用多重PCR技術(shù)建立三重、四重PCR體系，檢測牛羊肉中的狐、貂及浣熊源性成分。Qin Panzhu等[21]基于側(cè)向流動條帶平臺及PCR準(zhǔn)確鑒別摻假鴨肉。Liu Wanwan等[22]建立基于通用引物的多重PCR檢測系統(tǒng)，確定羊肉中是否含有來自大鼠、狐貍和鴨子的非突變成分。Xu Rusu等[23]建立多重TaqMan鎖定核酸實(shí)時PCR檢測方法，用于同時檢測鴨肉、豬肉、牛肉和雞肉。任易婕等[24]基于多重PCR與膜芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)對牛、羊、牦牛及驢源性肉類食品的鑒別及檢測。本研究從監(jiān)管角度出發(fā)，基于多重PCR技術(shù)，開發(fā)3 種常見犬型總科動物（狗、狐、貂）DNA成分檢測試劑盒，旨在為市場監(jiān)管提供有利技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品肉樣（狗肉、狐肉、貂肉）和其他檢測肉樣（豬肉、牛肉、羊肉、馬肉、驢肉、雞肉、鴨肉）由長春食品藥品檢測中心提供，模擬混合肉樣由標(biāo)準(zhǔn)品肉樣按質(zhì)量比混合而成，如表1所示。市售肉樣分別購自農(nóng)貿(mào)市場、狗肉館及線上銷售。

組織/細(xì)胞/血液基因組DNA提取試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pGM-T連接試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、100 bp DNA Marker、2×Taq PCR MasterMix 北京天根生化科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TC9600-G多功能梯度PCR儀 美國Labnet公司;JY300E通用型電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;UV WHITE-2020D紫外凝膠成像分析儀 美國Bio-Rad公司;NanoDrop One微量核酸蛋白測定儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 肉樣DNA提取

稱取待測樣品約0.05 g，分別置于潔凈EP管中，0.9 g/100 mL NaCl溶液浸泡、沖洗，去血水;每管加入150 μL 0.9 g/100 mL NaCl，勻漿器處理為細(xì)胞懸液，12 000 r/min離心1 min;棄上清，依次加入P1溶液500 μL、P2溶液30 μL、P3溶液15 μL，顛倒混勻，56 ℃水浴振蕩1 h（每15 min顛倒混勻1 次，至溶液變清亮即可）;加入P4溶液500 μL，充分混勻，12 000 r/min離心5 min;取上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈EP管，加入等體積P5溶液，-20 ℃放置5 min，12 000 r/min離心5 min;棄上清液，加入體積分?jǐn)?shù)70%冰凍乙醇溶液500 μL，混勻，12 000 r/min離心5 min，棄上清液（重復(fù)該步驟1 次）;室溫晾干后（約15 min即可），加入P6溶液50 μL溶解DNA（可二次洗脫），即得肉樣DNA溶液。

P1溶液：1 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L乙二胺四乙酸、0.9 g/100 mL NaCl;P2溶液：10 g/100 mL十二烷基硫酸鈉;P3溶液：蛋白酶K;P4溶液：飽和乙酸鈉;P5溶液：異丙醇;P6溶液：ddH2O。下同。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)

靶基因序列選?。汗贩N屬基因（序列ID：KU291093.1）、狐貍種屬基因（序列ID：LT560065.1）、貂種屬基因（序列ID：KU146454.1）;采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)并選取理想種屬特異性引物（表2），

由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。所有引物經(jīng)NCBI-Nucleotide BLAST預(yù)分析PCR產(chǎn)物片段特異性。

1.3.3 多重PCR反應(yīng)體系的建立

1.3.3.1 多重PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)體系（30 μL）：2×Taq PCR Master Mix 15 μL、Can-481F、R（濃度均為1.55 ?mol/L）、Vul-393F、R（2.0 ?mol/L）、Mar-289F、R（10.0 ?mol/L）、各物種DNA模板（5 ng/μL）0.5 μL，共計(jì)1.5 μL，無菌ddH2O補(bǔ)足。

反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸55 s，30 個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物檢測：1.5%瓊脂糖凝膠，85 V/cm電泳85 min。紫外凝膠成像分析儀觀察，狗肉、狐肉、貂肉應(yīng)分別在481、393、289 bp處有單一明亮條帶。

1.3.3.2 克隆與測序

紫外燈下，刀片切取特異性目的條帶（取自1.3.3.1節(jié)電泳凝膠），普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收、純化;pGM-T連接試劑盒連接產(chǎn)物DNA于pGM-T載體;轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，SOC培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)，LB固體培養(yǎng)基（添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG））藍(lán)白斑篩選陽性克隆;LB液體培養(yǎng)基增菌，質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒DNA;微量核酸蛋白測定儀測定質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度。

取1.5 μL質(zhì)粒DNA原液，分別配制PCR反應(yīng)體系。每個反應(yīng)體系含1.5 μL質(zhì)粒DNA原液、1.5 μL引物混合液（Can-481F、R（1.55 ?mol/L）、Vul-393F、R（2.0 ?mol/L）、Mar-289F、R（10.0 ?mol/L））、15 μL 2×Taq PCR Master Mix、12 μL無菌ddH2O。以最佳反應(yīng)參數(shù)擴(kuò)增，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像分析儀觀察結(jié)果。

質(zhì)粒DNA原液經(jīng)分裝密封，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，NCBI-Nucleotide BLAST分析比對。

1.3.4 犬型總科動物（狗、狐、貂）DNA檢測試劑盒組裝與評價

1.3.4.1 DNA檢測試劑盒組裝

DNA提取體系：加入P1、P2、P3溶液破壞細(xì)胞膜、核膜，去除蛋白質(zhì);加入P4、P5溶液沉淀核酸;最后加入P6溶液溶解DNA。

PCR反應(yīng)體系：1.5 μL引物混合液（Can-481F、R（1.55 ?mol/L）、Vul-393F、R（2.0 ?mol/L）、Mar-289F、R（10.0 ?mol/L））、15 μL 2×Taq PCR Master Mix、12 μL無菌ddH2O。

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為陽性對照，ddH2O作為陰性對照。

1.3.4.2 試劑盒特異性評價

按肉樣DNA提取方法分別提取標(biāo)準(zhǔn)樣品（狗肉、狐肉、貂肉、豬肉、牛肉、羊肉、馬肉、驢肉、雞肉、鴨肉）DNA，微量核酸蛋白測定儀測定DNA質(zhì)量濃度及純度，并稀釋至5 ng/μL。制備DNA混合液（含各物種DNA各1 μL），徹底混勻。使用1.3.3.1節(jié)反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像分析儀觀察結(jié)果。

1.3.4.3 試劑盒靈敏度評價

標(biāo)準(zhǔn)品DNA模板（狗/狐/貂）經(jīng)無菌ddH2O稀釋，制備梯度混懸液，質(zhì)量濃度102～10-5 ng/μL。引物混合液：含1.55 ?mol/L Can-481F、R，2.0 ?mol/L Vul-393F、R，10.0 ?mol/L Mar-289F、R。參照1.3.3.1節(jié)配制反應(yīng)體系，每個反應(yīng)體系含1.5 μL DNA混合液（102～

10-5 ng/μL）、1.5 μL引物混合液、15 μL 2×Taq PCR Master Mix、12 μL無菌ddH2O。使用1.3.3.1節(jié)反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像分析儀觀察結(jié)果。

1.3.5 模擬混合樣品檢測

考慮實(shí)際生活中各摻假情況出現(xiàn)的可能性，制備模擬混合肉樣，每種模擬混合肉樣制備2 份，與標(biāo)準(zhǔn)品肉樣共計(jì)30 份樣品。隨機(jī)抽樣10 份，編號分別為A1/A3（狗、狐、貂質(zhì)量比1∶6∶3）、A2（狗、貂質(zhì)量比9∶1）、A4（狗、狐質(zhì)量比9∶1）、A5（狗）、B1（狗、狐質(zhì)量比9∶1）、B2（狗、貂質(zhì)量比9∶1）、B3（狗）、B4（狗、狐、貂質(zhì)量比3∶6∶1）、B5（狗、狐質(zhì)量比1∶9）。提取肉樣DNA，微量核酸蛋白測定儀測定DNA質(zhì)量濃度，稀釋至

5 ng/μL。以標(biāo)準(zhǔn)品DNA模板（狗/狐/貂）為陽性對照，根據(jù)1.3.3.1節(jié)多重PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像分析儀觀察。

1.3.6 市售樣品檢測

選取農(nóng)貿(mào)市場、狗肉館及線上銷售3 種購買來源，獲取50 份市售樣品。檢測方法同1.3.5節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)并選取種屬特異性引物，所有引物經(jīng)NCBI-Nucleotide BLAST預(yù)分析PCR產(chǎn)物片段特異性。克隆后的序列結(jié)果經(jīng)NCBI-Nucleotide BLAST分析，與GenBank中已登記的序列進(jìn)行比對驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 狗、狐、貂DNA檢測試劑盒特異性評價

由圖1可知，在多種DNA模板（狗肉、狐肉、貂肉、豬肉、牛肉、羊肉、馬肉、驢肉、雞肉、鴨肉）存在情況下，泳道1按1.3.4.1節(jié)引物比例加入狗、狐、貂的引物混合液，泳道2、3、4分別加入狗、狐、貂的引物，電泳條帶出現(xiàn)情況與相應(yīng)檢測體系中目的條帶相符，無非特異性干擾，無交叉干擾，背景干凈，條帶清晰，狗、狐、貂的引物特異性較好。初步表明本研究所制備的試劑盒特異性良好，常見食用肉豬肉、牛肉、羊肉、馬肉、驢肉、雞肉、鴨肉的DNA成分于本檢測體系無非特異性擴(kuò)增，3 種特異性引物檢測肉質(zhì)成分于本檢測體系無交叉干擾。

泳道M. 100 bp DNA Ladder;泳道1. 狗、狐、貂混合物;泳道2. 狗;泳道3. 狐;泳道4. 貂;泳道N. 空白對照。

2.2 狗、狐、貂DNA檢測試劑盒靈敏度評價

泳道M. 100 bp DNA Ladder;泳道1～8. DNA模板質(zhì)量濃度102、101、100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 ng/?L;泳道N. 空白對照。

由圖2可知：標(biāo)準(zhǔn)品DNA模板質(zhì)量濃度處于102～

10-4 ng/μL時，可見3 條特異性條帶（狗：481 bp，狐：393 bp，貂：289 bp），條帶清晰無拖尾，背景干凈;標(biāo)準(zhǔn)品DNA模板質(zhì)量濃度降至10-5 ng/μL時，條帶消失;空白對照無非特異性條帶。表明本研究所制備的試劑盒靈敏度高，最低檢測限為10-4 ng/μL。

2.3 狗、狐、貂PCR產(chǎn)物克隆與測序

特異性目的條帶經(jīng)切膠回收，連接轉(zhuǎn)化并提取質(zhì)粒DNA后，進(jìn)行測序比對。由圖3可知，序列經(jīng)NCBI-Nucleotide BLAST分析，與GenBank中已登記的狗/狐/貂序列相似性為100%，證明本研究所選取靶基因序列可作為種屬特異性檢測序列，間接證明多重PCR檢測體系特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

泳道M. 100 bp DNA Ladder;泳道1～2. 狗;泳道3～4. 狐;泳道5～6. 貂;泳道N. 空白對照。

質(zhì)粒DNA原液經(jīng)PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。由圖4可知，泳道1～6皆見明亮特異性條帶，條帶大小與原切取條帶大小相符（泳道1～2：481 bp，泳道3～4：393 bp，泳道5～6：289 bp），背景干凈無雜帶，空白對照無非特異性條帶，為測序結(jié)果作進(jìn)一步佐證。

2.4 狗、狐、貂模擬混合樣品檢測

10 份隨機(jī)抽取的模擬混合樣品經(jīng)DNA提取、多重PCR檢測體系擴(kuò)增后，得到瓊脂糖凝膠電泳圖譜。

由圖5可知，條帶有無及明暗情況與各樣品原模擬混合方式大致相符。陽性對照組條帶清晰且亮度均一，陰性對照組無非特異性擴(kuò)增，表明該多重PCR檢測體系特異性良好，3 種特異性成分比例變化不影響檢測準(zhǔn)確性，可滿足摻假肉的日常檢測。

泳道M. 100 bp DNA Ladder;泳道1. 陽性對照;泳道N. 空白對照;圖A泳道2～6. 樣品A1～A5;圖B泳道2～6. 樣品B1～B5。

2.5 狗、狐、貂市售樣品檢測

對50 份市售樣品，包括豬肉、牛肉、羊肉、馬肉、驢肉、雞肉、鴨肉各3 份、狗肉29 份進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：21 份非狗肉樣品中均未檢測到狗/狐/貂源性成分;29 份狗肉樣品中，2 份出現(xiàn)貂特異性條帶，1 份出現(xiàn)狐特異性條帶，其余皆為狗肉。

3 討論

近年來多重PCR技術(shù)迅速發(fā)展，具有簡單、快速、靈敏度和準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)[25]，可以同時分析多個樣品，應(yīng)用前景非常廣闊[26-29]。本研究根據(jù)狗、狐、貂動物基因序列的位點(diǎn)差異設(shè)計(jì)狗、狐、貂特異性引物，進(jìn)行多重PCR檢測。結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的引物只有在相應(yīng)狗、狐、貂物種模板DNA存在的情況下才會發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生特異性目的條帶，而且3 種物種之間DNA模板均無交叉反應(yīng)，狗、狐、貂引物特異性好，而且其靈敏度可以達(dá)到10-4 ng/μL;經(jīng)克隆測序分析證明所選取靶基因序列可作為種屬特異性檢測序列，用于犬型總科動物（狗、狐、貂）DNA成分檢測。該方法的建立與應(yīng)用為打擊肉類產(chǎn)品市場違法違規(guī)行為提供了技術(shù)保障，對于政府部門的監(jiān)督管理工作具有極其重要的意義。

4 結(jié) 論

本研究建立的多重PCR檢測試劑盒可精準(zhǔn)鑒別肉制品中狗、狐、貂源性成分，最低檢測限可達(dá)10-4 ng/?L，特異性、靈敏度良好，具有較顯著的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價值。對50 份市售樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果皆與長春食品藥品檢測中心鑒定結(jié)果相符，進(jìn)一步證實(shí)本研究所建立多重PCR檢測體系準(zhǔn)確性良好。相較于熒光定量PCR檢測技術(shù)[30]，該試劑盒不受標(biāo)準(zhǔn)曲線及背景熒光的影響，無需額外設(shè)計(jì)探針及購買昂貴的檢測儀器，更經(jīng)濟(jì)便捷，節(jié)省實(shí)驗(yàn)材料，為操作者提供便利，保證檢測效率的同時維持檢測的低成本，可廣泛應(yīng)用于常見犬型總科動物（狗、狐、貂）DNA成分檢測。

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