貯藏方式和貯藏時(shí)間對(duì)苜蓿干草霉菌數(shù)量和種類(lèi)的影響

孫雷雷，趙桂琴*，柴繼寬，劉富淵, 聶秀美，王 軍

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅大業(yè)草產(chǎn)品研究所有限責(zé)任公司，甘肅 酒泉 735000)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是全球最重要的多年生豆科牧草之一，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其主要利用方式為初花期收獲調(diào)制干草[1-2]。苜蓿在其收獲時(shí)往往會(huì)攜帶大量真菌，這些真菌在晾曬和打捆過(guò)程中如果沒(méi)有得到有效控制，就會(huì)在貯藏期間生長(zhǎng)繁殖，霉菌的種類(lèi)也會(huì)因貯藏過(guò)程中微環(huán)境的變化而發(fā)生改變，由田間真菌過(guò)渡到儲(chǔ)藏真菌，致使干草發(fā)霉變質(zhì)。儲(chǔ)藏真菌多為曲霉屬和青霉屬的產(chǎn)毒真菌，會(huì)對(duì)草食家畜產(chǎn)生毒害[3-6]。因此，研究苜蓿干草貯藏過(guò)程中真菌種類(lèi)和數(shù)量的變化對(duì)苜蓿干草的安全貯藏具有重要意義。

大多數(shù)苜蓿干草都貯藏在儲(chǔ)草棚內(nèi)，但仍有部分干草由于儲(chǔ)草棚不足或沒(méi)有儲(chǔ)草棚而在露天貯藏，尤其是在冬春季干旱少雨的西北苜蓿產(chǎn)區(qū)，這種現(xiàn)象較為普遍。露天貯藏時(shí)，有的會(huì)在草垛頂部加一層苫布，有的沒(méi)有任何防護(hù)措施，干草受外界溫濕度影響較大[7]，給真菌的生長(zhǎng)繁殖創(chuàng)造了良好的環(huán)境。

國(guó)內(nèi)外對(duì)各種糧食作物的真菌區(qū)系作了很多研究[8-11]，但苜蓿干草貯藏過(guò)程中的真菌方面的研究較少[12]。高彩霞[13]研究表明，打捆后第10天，苜蓿干草的優(yōu)勢(shì)真菌有鐮刀菌屬、青霉屬、曲霉屬、鏈格孢霉屬、莖點(diǎn)霉屬和木霉屬共6個(gè)菌屬；榮磊[14]研究發(fā)現(xiàn)，未添加防霉劑的高水分苜蓿草捆貯藏過(guò)程中主要優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈格孢屬、木霉屬、曲霉屬和鐮刀菌屬，次優(yōu)勢(shì)菌屬為明枝霉屬、莖點(diǎn)霉屬、變胞屬和離孺孢屬。上述試驗(yàn)都是針對(duì)高水分苜蓿干草捆的霉菌進(jìn)行了鑒定，但只鑒定到屬。劉香萍[15]發(fā)現(xiàn)高水分苜蓿干草中有青霉屬8種，曲霉屬5種，鐮刀菌屬3種。這項(xiàng)研究是在打捆后30天取樣進(jìn)行的，后續(xù)貯藏過(guò)程中霉菌種類(lèi)會(huì)發(fā)生怎樣的變化還不清楚。而實(shí)際生產(chǎn)中苜蓿干草捆通常要貯藏3～6個(gè)月甚至一年左右，在此期間霉菌數(shù)量和種類(lèi)會(huì)隨著貯藏時(shí)間和條件的變化而發(fā)生變化，因此有必要對(duì)整個(gè)貯藏期間的霉菌變化動(dòng)態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，以了解和掌握其基本規(guī)律。

傳統(tǒng)的真菌鑒定方法主要有PDA平皿培養(yǎng)法和形態(tài)鑒定法。PDA平皿培養(yǎng)法既可以用于真菌的數(shù)量監(jiān)測(cè)(需添加氯霉素抑制細(xì)菌的生長(zhǎng))，也可用于對(duì)純化真菌的菌落和鏡檢形態(tài)的鑒定[16]。形態(tài)鑒定法是觀察純化的真菌菌落的顏色、紋路、生長(zhǎng)速度等特征，并挑取菌絲在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲結(jié)構(gòu)以及分生孢子的特征。將其與真菌檢索表中的真菌特征逐一比較，如果吻合，就可以認(rèn)為是同種[17-18]。然而真菌在形態(tài)、生理生化等方面的復(fù)雜性及其隨著環(huán)境變化而變化的特性，使得這些傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定具有一定的局限性[3]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，擴(kuò)增真菌的rDNA-ITS片段進(jìn)行真菌菌株種屬的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育研究，已經(jīng)變得越來(lái)越廣泛[19]。國(guó)內(nèi)有學(xué)者以形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合ITS基因序列的方法分別從儲(chǔ)藏稻谷中鑒定出一株菌核曲霉(A.sclerotiorum)和一株擴(kuò)展青霉(Penicilliumoxalicum)[20-21]；何瑞芳等[22]利用形態(tài)鑒定法結(jié)合分子鑒定將進(jìn)境的美國(guó)苜蓿干草中攜帶的真菌鑒定到37屬52種；王慧[23]也通過(guò)此法將苜蓿黃斑病的病原菌鑒定為苜蓿枝梗邊裂殼SporonemaphacidioidesDesmaz.(無(wú)性階段)和苜蓿小光殼Leptotrochilamedicaginis(Fckl.)H.Schiiepp(有性階段)。由此可見(jiàn)，利用形態(tài)鑒定法結(jié)合分子鑒定，可達(dá)到快速準(zhǔn)確的鑒定目的。

甘肅河西地區(qū)作為全國(guó)苜蓿商品草的主要產(chǎn)區(qū)，苜蓿干草在貯藏過(guò)程中霉菌是否會(huì)因貯藏條件和貯藏時(shí)間而發(fā)生變化，目前尚未見(jiàn)研究報(bào)道。因此本研究擬采用PDA平皿培養(yǎng)法、形態(tài)鑒定法結(jié)合rDNA-ITS序列分析法，對(duì)來(lái)自甘肅苜蓿主產(chǎn)區(qū)酒泉市肅州區(qū)不同貯藏方式和時(shí)間下的苜蓿干草捆進(jìn)行霉菌數(shù)量和種類(lèi)變化方面的研究，旨在為河西地區(qū)苜蓿干草生產(chǎn)和貯藏提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于酒泉市肅州區(qū)甘肅大業(yè)草產(chǎn)品研究所有限責(zé)任公司的場(chǎng)院內(nèi)，地理位置為東經(jīng)98°29′、北緯39°41′，海拔1 360 m，年平均降水量87.7 mm，年平均日照時(shí)數(shù)3 033.4 h，年平均氣溫7.3℃，7月份最高平均氣溫21.8℃，1月份最低平均氣溫—9.7℃。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用甘肅大業(yè)草產(chǎn)品研究所有限責(zé)任公司2018年在上壩基地收獲的第一茬紫花苜蓿。經(jīng)自然晾曬至含水量為15%后打成小方捆，草捆長(zhǎng)為1.05 m，寬為0.45 m，高為0.35 m，打捆密度為150 kg·m-3。分露天貯藏、苫布貯藏和儲(chǔ)草棚貯藏3種貯藏方式。在干燥的水泥地面碼垛，堆成尖頂方形垛，或露天放置(露天貯藏)，或在頂部加上苫布(苫布貯藏)，或直接在就近的儲(chǔ)草棚內(nèi)碼垛(儲(chǔ)草棚貯藏)。貯藏期從2018年6月3日到2019年5月28日，分別在貯藏的第0 d，30 d，60 d，90 d，150 d，210 d，270 d，360 d，用電動(dòng)取樣器在草垛的4個(gè)面分上、中、下3層取樣，每層取4個(gè)樣混合均勻，然后裝入帶有冰袋的保溫盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室后立刻放入-20℃超低溫冰箱中，盡快測(cè)定霉菌數(shù)量。

1.3 測(cè)定內(nèi)容與方法

1.3.1草樣菌懸液制備 稱(chēng)干草樣10 g于盛100 mL無(wú)菌水的三角瓶中，上旋轉(zhuǎn)式搖床(200 r·min-1)充分振蕩(10 min)，取菌懸液1 mL放入9 mL無(wú)菌水的試管中，配成10-1的菌懸液，再?gòu)?0-1濃度的菌懸液試管中吸1 mL加入另一支9 mL無(wú)菌水的試管中，配成10-2濃度的菌懸液。以此類(lèi)推，配成10-3濃度的菌懸液。

1.3.2霉菌數(shù)量檢測(cè) 采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定。取10-2，10-3兩個(gè)濃度的稀釋液各0.4 mL在事先倒好的虎紅瓊脂培養(yǎng)基上，用涂布棒將菌液在培養(yǎng)基上涂抹均勻，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，同時(shí)作空白對(duì)照，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后待長(zhǎng)出米粒大小白色菌落時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

計(jì)算公式為：N=au/v。

式中：N為1 g干草樣的菌數(shù)；a為培養(yǎng)皿中平均菌落數(shù)；u為稀釋倍數(shù)；v為每個(gè)培養(yǎng)皿中加菌懸液的體積(mL)。

1.3.3霉菌的分離和純化 將上述菌落再培養(yǎng)2 d，待菌落長(zhǎng)出顏色，能區(qū)分開(kāi)不同菌落時(shí)挑取菌絲至新鮮PDA培養(yǎng)基上分離、純化菌落，純化后的菌株于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4霉菌的形態(tài)學(xué)觀察 參照《真菌鑒定手冊(cè)》[24]和《真菌分類(lèi)學(xué)》[25]，把分離純化得到的真菌接種在PDA培養(yǎng)基上，25℃下培養(yǎng)7 d，觀察菌落的顏色、紋路、生長(zhǎng)速度等特征，并挑取分生孢子用無(wú)菌水制作水裝片，觀察孢子的形態(tài)特征，進(jìn)行真菌的初步鑒定。

1.3.5霉菌的分子生物學(xué)鑒定 將分離純化的霉菌在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d左右后，采用真菌基因組Omega試劑盒提取各干草霉菌DNA，并利用真菌ITS通用引物對(duì)ITS1和ITS4進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL：2×Taq PCR Master Mix溶液25 μL，10 μmol·L-1上下游引物各2 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 16 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后送樣進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank庫(kù)中的核酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并通過(guò)Mega 7.0軟件以鄰接法(Neighbor joining，NJ)進(jìn)行菌株的親緣關(guān)系分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007，SPSS 19.0專(zhuān)業(yè)版數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、方差分析及相關(guān)分析，用BLAST軟件將上傳序列與NCBI同源序列對(duì)比分析，下載與其相似度較高的菌株序列作為參考，采用Mega 7.0軟件鄰接法(Neighbor Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿干草貯藏過(guò)程中霉菌數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，苜蓿干草的霉菌數(shù)量總體呈先上升后逐漸下降再明顯上升的趨勢(shì)(圖1)。在貯藏過(guò)程中，環(huán)境溫度呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)，濕度變化與溫度類(lèi)似。貯藏6個(gè)月時(shí)溫度達(dá)到最低(參照貯藏期間肅州區(qū)的氣象數(shù)據(jù))。貯藏0 d時(shí)，3種貯藏方式下的霉菌數(shù)量無(wú)明顯差異。貯藏30 d時(shí)，露天貯藏的霉菌數(shù)量急劇上升，增加了2倍左右；苫布貯藏的也顯著增加，較一個(gè)月前增加了132.54%；儲(chǔ)草棚內(nèi)的苜蓿干草霉菌數(shù)量也有所增加(33.25%)。隨后各處理的霉菌數(shù)量逐漸開(kāi)始下降，到貯藏210 d時(shí)降至最低。這時(shí)露天貯藏的苜蓿干草霉菌數(shù)量仍然最高(7.41×103個(gè)·g-1，P<0.05)，苫布貯藏的次之，儲(chǔ)草棚內(nèi)的霉菌數(shù)量仍然最低(3.31×103個(gè)·g-1)。隨后苜蓿干草的霉菌數(shù)量又有所上升，到270 d時(shí)，露天貯藏、苫布貯藏和儲(chǔ)草棚貯藏3個(gè)處理的霉菌數(shù)量均較210 d有所增加，增幅分別為10.13%，2.22%和51.85%。當(dāng)貯藏時(shí)間延長(zhǎng)至360 d，苜蓿干草的霉菌數(shù)量達(dá)到一年中的最大值，分別為：露天貯藏1.74×104個(gè)·g-1，苫布貯藏1.18×104個(gè)·g-1，儲(chǔ)草棚貯藏7.29×103個(gè)·g-1；3個(gè)處理間的差距進(jìn)一步拉大，露天貯藏的苜蓿干草霉菌數(shù)量是儲(chǔ)草棚貯藏的2.39倍。另外，由圖1可知，在一年的貯藏過(guò)程中，儲(chǔ)草棚內(nèi)的苜蓿干草霉菌數(shù)量變化幅度最小，波動(dòng)曲線較為平緩(3.31×103～7.29×103個(gè)·g-1)；露天貯藏的變幅最大(4.57×103～1.74×104個(gè)·g-1)，而且其霉菌數(shù)量一直顯著高于其他兩個(gè)處理。

圖1 不同貯藏方式下苜蓿干草霉菌數(shù)量變化情況

2.2 苜蓿干草中真菌形態(tài)學(xué)觀察

分離純化的真菌在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，觀察和描述菌落形態(tài)和分生孢子形態(tài)特征。部分菌落和孢子形態(tài)如圖2。

球孢白僵菌(Beauveriabassiana，圖2 A-C)在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢，直徑約23 mm。菌落前期絨毛狀，后期粉末狀，中間凸起厚粉末，正面白色，背面橘黃色。分生孢子球形，直徑為1.5～2.5 μm，孢子聚集時(shí)呈球形的孢子簇。

枝狀枝孢菌(Cladosporiumcladosporioides，圖2 D-F)在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，直徑約21 mm。菌落稍微隆起，中央有裂紋，呈粉狀，邊緣呈白色，正面橄欖綠色，背面橄欖褐色。分生孢子單生或串生，呈近球形或卵形，大小為(2.8～7.6)μm×(2.0～3.5)μm。

細(xì)交鏈孢(Alternariaalternate，圖2 G-I)在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快，直徑約81 mm。菌落中央隆起，呈粗絨狀，正面棕褐色，背面灰褐色。分生孢子單生，呈倒梨形、倒棒狀，淡黃褐色，具橫隔1～4個(gè)，縱隔0～2個(gè)，部分含有短喙，大小為(8.1～17.2)μm×(2.4～6.5)μm。

赭曲霉(Aspergillusochraceus，圖2 J-L)在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，菌落直徑達(dá)68 mm，菌絲體白色，菌落淡黃色，菌落絲絨狀，有同心輪紋，無(wú)滲出液，菌落反面淡黃褐色。分生孢子梗粗糙有麻點(diǎn)，分生孢子單生，呈球形，直徑2.0～3.2 μm。

苜蓿莖點(diǎn)霉(Phomamedicaginis，圖2 M-O)在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，直徑約43 mm。菌落呈氈狀，中央略凸起，正面褐色，邊緣具白色絮狀，背面黑褐色。菌絲透明，有分隔，分生孢子單生或串生，大小6.0～11.7 μm×2.5～4.8 μm，常變?yōu)殡p胞。

變黑輪枝菌(Gibellulopsisnigrescens，圖2 P-R)在PDA培養(yǎng)基上初期菌落為白色，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，培養(yǎng)后期菌落表面產(chǎn)生淺白色粉塵，其上具有黑褐色大小不等的斑塊。分生孢子梗多為二次分枝，分生孢子橢圓形透明，單胞；可產(chǎn)生球形的黑色厚垣孢子，直徑為4.4～5.6 μm。

三隔鐮刀菌(Fusariumtricinctum，圖2 S-U)在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，直徑約65 mm，菌絲為白色，子座呈玫瑰紅色，培養(yǎng)基背面呈現(xiàn)白紅相間的同心圓；大型分生孢子呈鐮刀形，多3個(gè)隔膜，大小為29 μm×2.9 μm，少數(shù)為4～5個(gè)隔膜，大小為36 μm×3.5 μm。

圖2 菌落和分生孢子的形態(tài)特征

2.3 苜蓿干草中真菌分子生物學(xué)鑒定

對(duì)PDA培養(yǎng)基分離出的所有表觀形態(tài)特征略有差異的78株分離菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。基于ITS序列，采用鄰接法將所有分離菌種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)分離菌種的種屬進(jìn)一步確認(rèn)。

由圖3可知，河西地區(qū)貯藏的苜蓿干草共檢出真菌16屬41種。屬水平分別為鏈格孢屬(Alternariasp)、枝孢屬(Cladosporiumsp)、鐮刀菌屬(Fusariumsp)、輪枝孢屬(Gibellulopsissp)、毛霉屬(Mucorsp)、莖點(diǎn)霉屬(Phomasp)、根霉屬(Rhizopussp)、籃狀菌屬(Talaromycessp)、白僵菌屬(Beauveriasp)、漆斑菌屬(Myrotheciumsp)、青霉屬(Penicilliumsp)、曲霉屬(Aspergillussp)、織球殼屬(Plectosphaerellasp)、枝頂孢屬(Acremoniumsp)、帚枝霉屬(Sarocladiumsp)和Alfaria屬；其中曲霉屬真菌種類(lèi)最多，為10種，鐮刀菌屬和青霉屬次之，分別為5種和4種。

圖3 苜蓿干草貯藏過(guò)程中真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 不同貯藏方式下苜蓿干草真菌種類(lèi)的變化

露天貯藏的苜蓿干草在為期一年的貯藏過(guò)程中共檢出15屬35種真菌(表1)，苫布貯藏的苜蓿干草在貯藏期內(nèi)共檢出13屬33種真菌(表2)，儲(chǔ)草棚貯藏的苜蓿干草共檢出13屬33種真菌(表3)。3種貯藏方式下，每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)均能檢出的霉菌有細(xì)交鏈孢(Alternariaalternata)和枝狀枝孢菌(Cladosporiumcladosporioides)兩種，8個(gè)時(shí)間點(diǎn)中檢出5次以上的真菌有產(chǎn)黃青霉(Penicilliμmchrysogenum)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)。細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)和禾谷漆斑菌(Myrotheciumgramineum)只在貯藏的前期檢出，150 d后再未檢出。

表1 苜蓿干草露天貯藏過(guò)程中真菌種類(lèi)的變化

表2 苜蓿干草苫布貯藏過(guò)程中真菌的種類(lèi)變化

甜菜莖點(diǎn)霉(phomabetae)、疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)、凍土毛霉(Mucorhiemalis)、易脆毛霉(Mucorfragilis)、赤曲霉(Aspergillusruber)和緊密帚枝霉(Sarocladiumstrictum)僅在露天貯藏的苜蓿干草中檢出。雪曲霉(Aspergillusniveoglaucus)僅在苫布貯藏的處理中檢出。斯氏青霉(Penicilliμmsteckii)、Acremoniumfusidioides和交互枝頂孢(Acremoniumalternatum)僅在儲(chǔ)草棚內(nèi)的苜蓿干草中檢出。雜色曲霉(Aspergillusversicolor)在露天未檢出，在儲(chǔ)草棚和苫布貯藏條件下各檢出一次。露濕漆斑菌(Myrotheciumroridum)在苫布貯藏中未檢出，在露天和儲(chǔ)草棚貯藏的干草中各檢出1次。Alfariaterrestris在儲(chǔ)草棚貯藏中未檢出，在露天和苫布貯藏中各檢出一次。

由表1、表2和表3可知，苜蓿干草的帶菌種類(lèi)數(shù)都隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增加后降低再增加的趨勢(shì)，但不同貯藏方式下具體的變化各有特點(diǎn)。露天貯藏方式下，苜蓿干草的霉菌種類(lèi)在貯藏60 d時(shí)即達(dá)到峰值(22種)，90 d時(shí)為21種，隨后下降至17種，到360 d時(shí)增至19種。苫布貯藏方式下，苜蓿干草的霉菌種類(lèi)在貯藏90 d時(shí)達(dá)到最高(20種)，隨后急劇下降至13種，隨后在貯藏270 d時(shí)增至17種，直到貯藏360 d再未增加。儲(chǔ)草棚內(nèi)的苜蓿干草霉菌種類(lèi)在貯藏30 d即達(dá)到較高值(16種)，但隨后幾乎沒(méi)有變化(僅在60 d時(shí)減少1種)，直到儲(chǔ)藏360 d時(shí)增加了1種，和其他兩種貯藏方式相比波動(dòng)最小。

表3 苜蓿干草在儲(chǔ)草棚貯藏過(guò)程中真菌的種類(lèi)變化

3 討論

3.1 貯藏方式和貯藏時(shí)間對(duì)苜蓿干草霉菌數(shù)量的影響

貯藏方式和貯藏時(shí)間對(duì)苜蓿干草的霉菌數(shù)量有顯著影響。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，苜蓿干草的霉菌數(shù)量總體呈增加的趨勢(shì)。這是因?yàn)樵谫A藏初期，苜蓿干草攜帶的真菌多為田間真菌，且數(shù)量不多，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，真菌開(kāi)始快速繁殖，達(dá)到一個(gè)小高峰；之后由于環(huán)境的惡化(冬季低溫)，真菌的數(shù)量又開(kāi)始降低；隨著春季冰雪消融，氣溫上升，貯藏環(huán)境適宜真菌的生長(zhǎng)繁殖，因此真菌數(shù)量又快速上升。史瑩華等[26]也發(fā)現(xiàn)，貯藏時(shí)間越長(zhǎng)，苜蓿干草捆中霉菌數(shù)量越多。含水量較高(20%)的苜蓿干草貯藏半個(gè)月后霉菌數(shù)量最高可達(dá)9.17×104個(gè)·g-1[27]。苜蓿草顆粒中如果不添加防霉劑，7天后霉菌數(shù)量可達(dá)9.60×104個(gè)·g-1[28]。露天貯藏方式下的干草真菌數(shù)量較同期苫布和儲(chǔ)草棚貯藏的真菌數(shù)量顯著增多，儲(chǔ)草棚內(nèi)的苜蓿干草霉菌數(shù)量變幅最小。露天貯藏受外界環(huán)境的影響最大，因此在一年的貯藏期內(nèi)霉菌數(shù)量變化劇烈。李改英等[29]在進(jìn)行不同淋雨模式對(duì)苜蓿霉菌生長(zhǎng)規(guī)律影響的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，未淋雨的對(duì)照組苜蓿草霉菌數(shù)量變化不大，而間隔淋雨的苜蓿草(相當(dāng)于露天貯藏)在第3天霉菌就開(kāi)始大量生長(zhǎng)。

3.2 貯藏方式和貯藏時(shí)間對(duì)苜蓿干草霉菌種類(lèi)的影響

在真菌種類(lèi)的鑒定方面，目前通常采用的是形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法[19]。將分離純化的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上25℃黑暗培養(yǎng)3～5天，觀察菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度、顏色、大小等，結(jié)合菌絲的形態(tài)和分生孢子的有無(wú)及其特點(diǎn)進(jìn)行初步鑒定[17-18]，然后用真菌的通用型引物ITS[30]進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，精準(zhǔn)鑒定。本研究用形態(tài)特征結(jié)合分子鑒定發(fā)現(xiàn)，在為期一年的貯藏期內(nèi)，從苜蓿干草中共檢測(cè)出16屬41種真菌，其中曲霉屬真菌10種，鐮刀菌屬5種、青霉屬4種。在貯藏初期，3種貯藏方式下的苜蓿干草都檢出了鏈格孢屬、枝孢屬、鐮刀菌屬的真菌，這些都屬于田間真菌，對(duì)水活度要求相對(duì)較高。貯藏中后期，隨著苜蓿干草含水量進(jìn)一步降低，田間真菌的數(shù)量開(kāi)始下降，而對(duì)水活度要求相對(duì)寬泛的過(guò)渡真菌開(kāi)始增多。3種貯藏方式下的苜蓿干草中曲霉屬、青霉屬的真菌成為優(yōu)勢(shì)菌，檢出率都較高，這些都屬于儲(chǔ)藏真菌，對(duì)水活度要求相對(duì)較低[6]。

苜蓿干草的帶菌種類(lèi)數(shù)都隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增加后降低再增加的趨勢(shì)。儲(chǔ)草棚內(nèi)的苜蓿干草帶菌種類(lèi)變化最小，露天貯藏的苜蓿干草帶菌種類(lèi)最多、波動(dòng)最大，共檢出15屬35種，而苫布貯藏和草棚貯藏的都是13屬。鏈格孢屬的細(xì)交鏈孢和枝孢屬的枝狀枝孢菌在3種貯藏方式下的各貯藏時(shí)期都有檢出，體現(xiàn)了其優(yōu)勢(shì)屬的地位。曲霉屬在整個(gè)貯藏過(guò)程中一共檢出了10個(gè)種，也為優(yōu)勢(shì)屬。另外，有6種真菌僅在露天貯藏的苜蓿干草中檢出，而苫布貯藏和儲(chǔ)草棚貯藏下只有1種和3種，進(jìn)一步體現(xiàn)出露天貯藏的苜蓿干草不僅霉菌數(shù)量最多，獨(dú)有的種類(lèi)也最多。

檢出的苜蓿莖點(diǎn)霉和鏈格孢屬的真菌都屬于常見(jiàn)的植物病原真菌，而匍枝根霉、黑曲霉、青霉屬的幾種真菌都屬于常見(jiàn)的腐生性真菌。在貯藏前期，3種貯藏方式下的苜蓿干草中都檢出了變黑輪枝菌，前人曾從發(fā)白矮化的苜蓿植株上分離得到這種菌，該菌可引起苜蓿出現(xiàn)葉片發(fā)白、節(jié)間縮短、植株矮化等癥狀[31]。貯藏中后期，在露天貯藏方式下檢出了2種毛霉屬真菌：凍土毛霉和易脆毛霉。這兩種真菌在苫布和草棚貯藏下都未檢出，可能是因?yàn)樯徊己筒菖锝档土擞暄?duì)苜蓿干草水分含量變化的影響。劉香萍[32]在對(duì)不同含水量的苜蓿干草進(jìn)行真菌種類(lèi)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，同一取樣時(shí)期，高水分苜蓿草捆檢測(cè)出了毛霉，而低水分苜蓿草捆未檢出。在整個(gè)貯藏過(guò)程中，3種貯藏方式下都檢出了白僵菌屬的蟲(chóng)生真菌，且在露天貯藏的苜蓿干草中檢出率更高，可能是露天貯藏的苜蓿干草給昆蟲(chóng)提供了庇護(hù)所。此外，本研究還檢出了漆斑菌屬的3種真菌和織球殼屬的1種真菌，屬首次報(bào)道，因?yàn)橛醒芯空J(rèn)為其未在中國(guó)種植的苜蓿草上分布[22]。

4 結(jié)論

貯藏方式和貯藏時(shí)間對(duì)苜蓿干草的霉菌數(shù)量有顯著影響。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，苜蓿干草的霉菌數(shù)量總體呈增加趨勢(shì)，露天貯藏的霉菌數(shù)量最多，苫布貯藏的次之，儲(chǔ)草棚內(nèi)的苜蓿干草霉菌數(shù)量最低、變化最小。

貯藏方式和貯藏時(shí)間對(duì)苜蓿干草霉菌種類(lèi)也有顯著影響。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，苜蓿干草的霉菌種類(lèi)呈先增后降再增的趨勢(shì)，儲(chǔ)草棚貯藏的苜蓿干草霉菌種類(lèi)變化最小。共檢出16屬41種真菌，其中露天貯藏的苜蓿干草檢出15屬35種，苫布貯藏和儲(chǔ)草棚貯藏均檢出13屬33種。優(yōu)勢(shì)屬為鏈格孢屬、枝孢屬和曲霉屬。

在甘肅河西地區(qū)，苜蓿干草宜采用儲(chǔ)草棚貯藏，貯藏期不宜超過(guò)7個(gè)月。