龍血竭治療潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的研究

何嘉寧，黨昌發(fā)，馬瑞旻，古欣怡，劉紅波，呂蕊花，賀太平，史琳娜

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046)

0 引言

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性炎癥性腸道疾病，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉及黏液血樣便等，與結(jié)腸癌的發(fā)生密切相關(guān)[1]。西醫(yī)治療UC多使用5-氨基水楊酸鹽、硫嘌呤、腫瘤壞死因子α抑制劑、整合素受體拮抗劑和小分子靶向抑制劑等藥物，長期服用費用昂貴，易引發(fā)過敏反應(yīng)、肝腎損害、腫瘤等并發(fā)癥[2]。腸黏膜屏障受損失是UC發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，止血與促進潰瘍愈合是UC治療的關(guān)鍵[3]。龍血竭是中醫(yī)治療外傷出血、久不收口類疾病的傳統(tǒng)中藥之一，具有活血化瘀、消腫止痛、收斂止血，軟堅散結(jié)、生肌斂瘡等功效，臨床常與其他藥物聯(lián)用治療UC獲得良好療效[4]。本實驗以葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)建立小鼠急性UC模型，觀察龍血竭對UC小鼠治療效果，為促進其在臨床中應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物：Balb/c小鼠40只，體重20～22g、雌雄各半，由成都達碩實驗動物有限公司提供。

試劑與儀器：葡聚糖硫酸鈉(DSS)、羧甲基纖維素鈉(CMC)、二甲苯、無水乙醇、蘇木精-伊紅染液購自博泰化玻儀器公司，IL-6和IL-10免疫組化試劑盒購自上海BIOTECH公司。Leica RM 2235切片機(德國徠卡公司)，ZEISS顯微鏡(德國蔡司公司)，Biotek800TS酶標儀(美國博騰公司)。

藥物：龍血竭膠囊(云南云河藥業(yè)股份有限公司)，柳氮磺胺吡啶腸溶片(上海信誼天平藥業(yè)股份有限公司)。

2 實驗方法

2.1 UC小鼠模型的建立、分組及給藥

實驗前小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，標準飼料喂養(yǎng)，自由飲用純水。將40只小鼠隨機分為空白組、模型組、西藥組和中藥組，每組10只，雌雄各半?？瞻捉M小鼠自由飲用純水。模型組、西藥組和中藥組小鼠自由飲用3%DSS溶液7d。第8d開始，將藥物按照成人使用量換算成小鼠用量，西藥組給予0.45 mg/g柳氮磺胺吡啶腸溶片(5%羧甲基纖維素鈉作為溶劑)灌胃，中藥組給予0.54mg/g龍血竭膠囊(5%羧甲基纖維素鈉作為溶劑)灌胃，空白組和模型組給予5%羧甲基纖維素鈉溶劑灌胃，連續(xù)給藥14d。每天定時稱量小鼠體重，觀察糞便性狀并進行隱血測定。

2.2 疾病活動指數(shù)(DAI)評分

根據(jù)文獻[5]，DAI= (體重下降分數(shù)+糞便性狀分數(shù)+隱血分數(shù))/3。評分標準如表1所示。

表1 疾病活動指數(shù)評分標準

2.3 小鼠血清炎癥因子測定

給藥14 d后，小鼠眼球取血，離心后分離血清，-80℃保存。ELISA試劑盒檢測小鼠血清中炎癥因子IL-6和IL-10含量。

2.4 小鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察

給藥14d后，頸椎脫臼法處死小鼠，取結(jié)腸組織，10%福爾馬林固定，石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察小鼠結(jié)腸組織病理變化。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用(±s)表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 小鼠一般情況觀察

結(jié)果如圖1和圖2所示，空白組小鼠生長情況良好，體重一直呈上升趨勢，糞便正常、無血便，生存率為100%。模型組、西藥組和中藥組自由飲用DSS溶液后，第3d出現(xiàn)稀便，第5d有血便，體重呈下降趨勢。模型組小鼠第7d后腹瀉、血便、體重下降癥狀逐漸加重，第9d開始有小鼠死亡，停止飲用DSS后1w(第14d)，癥狀略有緩解，至21d生存率為50%。西藥組和中藥組小鼠灌藥后體重逐漸上升，腹瀉和血便情況逐漸改善，至21d生存率分別為90%和70%。

圖1 小鼠體重變化

圖2 小鼠生存曲線

3.2 小鼠DAI評分

空白組小鼠DAI一直為0分。其余組小鼠自由飲用DSS溶液期間，DAI分值逐漸上升。模型組停止飲用DSS后，癥狀不再加重，DAI評分維持在8分。西藥組和中藥組灌藥治療后DAI評分與模型組相比顯著降低，且中藥組DAI評分降低更顯著(如圖3所示)。

圖3 各組小鼠DAI評分曲線

3.3 小鼠血清炎癥因子檢測結(jié)果

ELISA檢測小鼠血清炎癥因子結(jié)果如圖4所示。模型組、中藥組、西藥組小鼠血清中IL-6水平均顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，且模型組最高，其次為西藥組。與空白組相比，中藥組和西藥組小鼠血清中IL-10水平顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，且中藥組增高最顯著。

圖4 小鼠血清IL-6和IL-10檢測結(jié)果

3.4 小鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

小鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果如圖5所示?？瞻捉M小鼠結(jié)腸組織無炎癥細胞浸潤，可見杯狀細胞，隱窩結(jié)構(gòu)正常。模型組小鼠結(jié)腸組織內(nèi)炎性細胞浸潤嚴重，大量杯狀細胞消失，可見黏膜損傷、隱窩分支、扭曲及萎縮。西藥組和中藥組小鼠結(jié)腸黏膜損傷及炎癥狀態(tài)顯著減輕，未見明顯隱窩異常變化，中藥組較西藥組黏膜炎性細胞少見，部分標本出現(xiàn)杯狀細胞重新長出現(xiàn)象。

圖5 小鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果(100×)

4 討論

目前，UC尚無治愈的藥物和方法，臨床治療主要以控制發(fā)作、改善癥狀、促進腸黏膜愈合和防止復(fù)發(fā)等。中醫(yī)認為UC屬“泄瀉”“便血”“腸澼”“大瘕泄”范疇，濕熱瘀毒內(nèi)蘊為其主要病機，治宜清熱燥濕，解毒化瘀，澀腸生肌[6]。龍血竭具有活血散瘀，定痛止血，斂瘡生肌的功效，現(xiàn)代藥理研究證實有抑制炎癥、活血止血、保護心血管、抗纖維化和抑菌等作用[7]。本實驗結(jié)果顯示，與模型組相比，中藥組小鼠死亡率顯著降低，腹瀉和便血癥明顯改善，提示龍血竭可改善UC小鼠的臨床病理癥狀。結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察顯示，中藥組小鼠結(jié)腸組織黏膜損傷和炎性細胞浸潤顯著減輕，提示龍血竭可促進結(jié)腸黏膜愈合、抑制炎癥反應(yīng)從而阻滯UC的發(fā)生和發(fā)展。柳氮磺胺吡啶是臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎常用的藥物之一，具有抗菌消炎和免疫抑制作用[8]。本實驗發(fā)現(xiàn)龍血竭在降低小鼠死亡率、緩解癥狀、抑制炎癥方面效果優(yōu)于柳氮磺胺吡啶，具有臨床推廣應(yīng)用的價值。大量臨床研究證實龍血竭與其他藥物聯(lián)用治療UC效果顯著，可顯著改善結(jié)腸病變部位炎癥和組織壞死，促進結(jié)腸黏膜愈合，但其作用機制尚不完全清楚[9]。崔曉娟等[3]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析認為龍血竭作用機制是通過調(diào)控ABL1、F2、JAK2等靶點表達，間接調(diào)控IL-6、PTGS2等蛋白表達，進而干預(yù)JAK2/STAT3、PI3K-Akt-m TOR通路，調(diào)節(jié)炎癥因子的水平，抑制炎癥反應(yīng)，最終緩解UC小鼠結(jié)腸黏膜損傷。未來將基于信號通路對龍血竭作用機制做進一步研究，以期為中藥治療UC提供更多的科學(xué)依據(jù)。