BoBs技術在有超聲軟指標的高齡孕婦產(chǎn)前診斷中的應用

陳希敏，汪雪雁，尹雁，葉夢玲，秦勝芳，席娜

(四川省婦幼保健院醫(yī)學遺傳與產(chǎn)前診斷科，四川 成都 610045)

0 引言

由于國家二胎政策的放開，高齡孕產(chǎn)婦的數(shù)目也隨之大大增加。高齡孕婦是指孕婦年齡或其孕產(chǎn)年齡≥35歲[1]。染色體疾病是遺傳性疾病的常見類型，是出生缺陷的常見病因。有文獻報道，在我國新生兒中，染色體疾病大約占6%左右，此外，高齡孕婦所懷胎兒的染色體異常率會有所增高，而且隨著孕婦的年齡的增長，其染色體異常率會明顯地增高[2-4]。胎兒超聲軟指標是指孕婦在接受超聲檢查時所發(fā)現(xiàn)的一大類非特異性的胎兒的結(jié)構(gòu)的微小變化，大多為一過性的，并且在正常胎兒中也可見，但是其在具有染色體異常的胎兒中的發(fā)生率會明顯增高，因此，其在評估胎兒是否存在染色體異常上具有重大價值[5]。隨著超聲技術的發(fā)展進步，胎兒超聲軟指標檢出率也逐漸增高，因此，越來越多的醫(yī)生將其納入產(chǎn)前診斷的指征。

目前，運用于臨床上產(chǎn)前診斷的方法種類較多，常見的有細胞遺傳學的染色體核型分析技術，分子遺傳學的熒光原位雜交技術(FISH)，熒光定量聚合酶鏈式反應(QF-PCR)，細菌人工染色體標記-微球鑒別/分離法(BoBs)，染色體微陣列分析(CMA)等[3，6-8]，然而傳統(tǒng)的細胞遺傳學的細胞染色體核型分析技術依舊是作為產(chǎn)前診斷的金標準[9]，但其存在分辨率有限，發(fā)放報告周期長，經(jīng)驗要求高，可能出現(xiàn)培養(yǎng)失敗等缺點。FISH需要設計特定的探針，通量低。QF-PCR無法檢測診斷染色體的嵌合體情況以及染色體的微缺失/微重復。而CMA的檢測費用較昂貴，并且對于臨床意義未知(VOUS)的拷貝數(shù)變異(CNV)的臨床解釋有一定困難，增加孕婦的心理負擔。近些年新出的BoBs技術，不需要進行細胞培養(yǎng)，檢測周期短，檢測通量較高，而且可以同時檢測常見的染色體的非整倍體異常以及九種常見的微缺失綜合征[8,10]。本研究運用BoBs檢測結(jié)合細胞染色體核型分析技術對225例羊水細胞標本進行產(chǎn)前診斷，探索分析BoBs技術對有超聲軟指標的高齡孕婦產(chǎn)前診斷的臨床應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2019年1月至2020年10月于我院醫(yī)學遺傳與產(chǎn)前診斷科就診的225例有超聲軟指標的高齡孕婦且拒絕染色體微陣列分析檢測的作為研究對象，孕周為18+2-32+1周，年齡為34-44歲，并且均為單胎妊娠。所有孕婦術前均簽署了產(chǎn)前診斷相關的知情同意書。

1.2 研究方法

羊膜腔穿刺常規(guī)腹部消毒鋪巾后，臨床醫(yī)生在超聲引導下，經(jīng)腹壁行羊膜腔穿刺術，抽取30mL羊水，分別置于4支無菌離心管內(nèi)，其中20mL羊水分兩線獨立操作進行羊水細胞培養(yǎng)用作染色體核型分析，另外5mL羊水用作產(chǎn)前BoBs檢測分析，最后5mL羊水經(jīng)離心后，將其細胞沉淀置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

染色體核型分析將2支15mL無菌離心管內(nèi)的羊水于1500rpm離心6min，然后由兩名實驗室人員分兩線分別將羊水細胞沉淀接種于2個細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后依次經(jīng)過換液、秋水仙素作用、胰酶消化處理細胞、滴片制備、G顯帶染色，每個羊水標本計數(shù)20個細胞分裂象，分析其中的3-5個細胞染色體核型，若分析到染色體異常或者存在多態(tài)性，則增加計數(shù)至50個細胞分裂象，并且要增加細胞染色體核型分析數(shù)量。按照人類細胞遺傳學國際命名標準2009(ISCN2009)進行結(jié)果描述、出具報告。

BoBs檢測取5mL羊水于2000rpm離心10min，棄上清液，留取細胞沉淀，按照DNA提取試劑盒(Qiagen，美國)說明書操作步驟提取羊水細胞基因組DNA，用Nanodrop(Thermo，美國)檢測所提取DNA的濃度和純度，然后按照BACs-on-BeadsTM Assay試劑盒(Perkin Elmer，芬蘭)說明書操作步驟進行BoBs檢測，依次包括DNA標記，純化，雜交，洗滌，報告分子結(jié)合，Luminex 200(Luminex，美國)讀取數(shù)據(jù)，最后使用BoBsoft軟件分析結(jié)果。BoBs技術檢測范圍及探針分布見表1。

表1 BoBs技術檢測范圍及其探針設計分布

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用(±s)表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 觀察指標

隨訪對本研究中所有研究對象運用門診聯(lián)合電話溝通的方法進行隨訪妊娠結(jié)局，以便掌握孕婦以及胎兒的具體情況。

2 結(jié)果

2.1 胎兒超聲軟指標異常情況

225例孕婦共檢查出10種胎兒超聲軟指標異常，并且均為單項超聲軟指標異常，具體見表2。

表2 胎兒超聲軟指標異常情況

2.2 染色體核型分析

225例羊水標本中，出現(xiàn)1例培養(yǎng)失敗(孕32+1周)，成功率為99.56%(224/225)。共檢測出染色體異常12例(5.36%，12/224)，其中染色體數(shù)目異常5例(41.67%，5/12)，染色體結(jié)構(gòu)異常5例(41.67%，5/12)，嵌合體2例(16.66%，2/12)。檢測到的染色體數(shù)目異常包括21-三體2例(40.00%，2/5)，性染色體數(shù)目異常3例(1例47，XXY，2例47，XYY)(60.00%，3/5)。檢測到的染色體結(jié)構(gòu)異常包括1例(20.00%，1/5)羅伯遜易位，核型為45，XN，rob(13；14)(q10；q10)，3例(60.00%，3/5)平衡易位，核型分別為46，XN，t(1；13)(q12；q14)、46，XN，t(5；8)(p13；p23)和46，XN，t(4；15) (q35；q12)，1例(20.00%，1/5)倒位，核型為46，XN，inv(20) (p13q13.1)。檢測到的2例染色體嵌合體核型分別為46，XN(45)/47，XN，+21(5)和45，X(7)/46，XY(43)。此外，還檢出染色體多態(tài)性2例(0.89%，2/224)，核型分別為46，XN，1qh+和46，XN，22ps+。不同超聲軟指標，胎兒染色體核型異常檢出率不同，其中以NT增厚為穿刺指征的胎兒染色體核型異常檢出率最高(5例)，然后依次為鼻骨缺失、側(cè)腦室增寬及單臍動脈(2例)，腎盂分離(1例)。見表3。

表3 不同超聲軟指標異常與染色體異常結(jié)果統(tǒng)計情況

2.3 BoBs檢測

225例羊水標本均成功完成檢測，成功率為100%。BoBs檢測技術共檢測出染色體異常6例(2.67%，6/225)，其中染色體數(shù)目異常5例(83.33%，5/6)，染色體結(jié)構(gòu)異常1例(16.67%，1/6)。染色體數(shù)目異常包括21-三體2例(40.00%，2/5)，性染色體數(shù)目異常3例(1例XXY，2例XYY) (60.00%，3/5)。染色體結(jié)構(gòu)異常為1例微缺失綜合征，即DiGeorge綜合征Ⅰ型(22q11.2微缺失)。見圖1。不同超聲軟指標，BoBs異常檢出率也不同，其中以NT增厚、鼻骨缺失異常檢出率最高(2例)，其次為三尖瓣輕度返流、單臍動脈(1例)。見表3。

圖1 BoBs檢測異常結(jié)果A,B,C,D分別為XXY，XYY，21-三體和DiGeorge綜合征Ⅰ型

2.4 BoBs檢測技術和細胞染色體核型分析技術的結(jié)果對比

在本研究中，BoBs檢測漏診了染色體平衡易位3例、羅伯遜易位1例、染色體倒位1例、染色體嵌合體2例及染色體多態(tài)性2例。染色體核型分析漏診了1例微缺失綜合征(DiGeorge綜合征Ⅰ型)。對比胎兒染色體異常檢出率，BoBs檢測(2.67%，6/225)要低于染色體核型分析(5.36%，12/224)，兩者差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=4.754，P＜0.0005)。見表4。

表4 兩種檢測方法異常結(jié)果對比及妊娠結(jié)局

2.5 隨訪

在孕婦領取檢測報告后，對所有孕婦采取電話和門診相結(jié)合的方法隨訪其妊娠結(jié)局，其中2例21-三體綜合征、1例克氏綜合征、2例染色體嵌合體以及1例染色體微缺失胎兒隨即終止妊娠，其他孕婦均繼續(xù)妊娠。見表4。

3 討論

通過中國出生缺陷防治報告(2012)報道表明，目前我國的出生缺陷總的發(fā)生率大概在5.6%左右，而且每年新增加的出生缺陷數(shù)目大約有九十萬例左右，并且有研究表明染色體異常可能是導致出生缺陷發(fā)生的較常見原因之一[11]。隨著社會發(fā)展，現(xiàn)代女性推遲生育，加之國家“全面二孩”政策的調(diào)整，高齡孕婦比例激增，高齡孕婦由于配子質(zhì)量下降，發(fā)生出生缺陷的風險也增大[12]。胎兒超聲軟指標是超聲檢查時常見的胎兒結(jié)構(gòu)細微改變，上世紀便開始用于臨床，且在染色體異常胎兒中出現(xiàn)率較高[13]。本研究顯示，不同超聲軟指標，不同產(chǎn)前診斷檢測方法，胎兒染色體異常檢出率存在差異。

本研究中共有225例孕婦進行產(chǎn)前診斷，其中染色體核型分析出現(xiàn)1例培養(yǎng)失敗，原因是由于孕婦孕周過大(孕32+1周)，導致羊水細胞無法貼壁生長，培養(yǎng)成功率為99.56%，共檢測出染色體異常12例，異常檢出率為5.36%。與BoBs檢測對比，漏檢1例微缺失綜合征，是由于染色體核型分析分辨率有限，難以檢出小于5-10 Mb的染色體異常[14]。BoBs檢測成功率為100%，共計檢測出染色體異常6例，異常檢出率為2.67%，與其他研究者的研究結(jié)果吻合[15]。與染色體核型分析對比，對于5對常見的染色體(13、18、21、X和Y)的非整倍體診斷，二者結(jié)果一致，但是未能檢出染色體平衡易位、羅伯遜易位、倒位及染色體多態(tài)性，是由于BoBs技術無法檢測染色體平衡性重排，超出其檢測范圍導致。對于染色體嵌合體的診斷，BoBs檢測漏檢2例。有研究報道，產(chǎn)前BoBs檢測可檢出嵌合比例低至20%-40%的樣本[16]。本研究中，由于染色體嵌合比例較低，導致漏檢，可見BoBs技術對嵌合體診斷能力有限。此外，本研究中，BoBs技術檢出1例微缺失綜合征，檢出率低于李怡梅等[14]研究結(jié)果，可能和樣本量少有一定關系。BoBs檢測技術結(jié)合細胞染色體核型分析技術，可以較好地提高染色體的異常檢出率，和國內(nèi)其他研究者的研究結(jié)果一致[17,18]。

本研究中，2例21-三體綜合征、1例克氏綜合征、2例染色體嵌合體以及1例染色體微缺失胎兒，經(jīng)遺傳咨詢后，隨即終止妊娠。而染色體平衡易位、羅伯遜易位、倒位及染色體多態(tài)性的胎兒，通過夫妻雙方染色體驗證分析，其均遺傳自臨床表型正常的父母，經(jīng)過臨床遺傳咨詢后，這些孕婦均選擇繼續(xù)妊娠。此外，2例超雄綜合征胎兒，經(jīng)遺傳咨詢，慎重考慮后，選擇繼續(xù)妊娠。其他未檢出染色體異常胎兒均繼續(xù)妊娠。

與產(chǎn)前診斷“金標準”染色體核型分析相比，BoBs技術具有快速診斷、通量高、無需細胞培養(yǎng)、結(jié)果易于判讀及可檢測染色體微缺失/微重復等優(yōu)點，但是也存在其局限性，如無法檢測到探針未覆蓋的區(qū)域、倍性變化、甲基化、點突變、平衡性重排、單親二倍體及某些染色體嵌合體等。二者具有一定的互補作用，BoBs檢測技術結(jié)合細胞染色體核型分析技術，能夠使得產(chǎn)前診斷的準確性得到提高，避免醫(yī)療糾紛，降低出生缺陷，具有較高的臨床應用價值，值得推廣。