肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)微顆粒促進(jìn)HepG2 細(xì)胞球狀體形成與肝相關(guān)功能分化的研究

胡佳辰 金巖 劉文佳

肝臟組織工程研究是肝臟再生醫(yī)學(xué)中的重要分支，旨在構(gòu)建出肝功能替代治療中的生物人工肝支持系統(tǒng)（Bioartificial liver support system，BALSS），或用于藥物肝毒性篩查的生物肝組織［1］。然而，足量、易于獲取的肝功能性細(xì)胞的來源問題仍未得到有效解決。HepG2 等永生化肝細(xì)胞系具有一定的肝細(xì)胞功能，具有較好的應(yīng)用潛力，但肝細(xì)胞功能水平較差，是限制其在BALSS 和毒性篩查應(yīng)用中的主要障礙［2－3］。

細(xì)胞的培養(yǎng)方式是影響細(xì)胞功能狀態(tài)的關(guān)鍵［4－5］，通過改變HepG2 細(xì)胞的普通2D 培養(yǎng)方式，其肝相關(guān)功能也可得到提升。由于細(xì)胞的3D 培養(yǎng)形式使細(xì)胞更接近于體內(nèi)的3D 生存模式，因而能提高體外培養(yǎng)細(xì)胞的功能基因表達(dá)，更有利于細(xì)胞的功能分化［6］。研究表明，3D 球狀體的培養(yǎng)形式相比于普通的2D 培養(yǎng)，能更好地促進(jìn)永生化肝細(xì)胞系和人原代肝細(xì)胞（Primary human hepatocytes，PHH）的肝功能表達(dá)［6－7］。另外，細(xì)胞外的基質(zhì)微環(huán)境也是影響細(xì)胞功能狀態(tài)的重要因素［8－9］。細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）是體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境的重要載體。ECM 中包含了膠原蛋白、彈性蛋白、纖維連接蛋白、層粘連蛋白以及蛋白多糖等纖維骨架成分，這些成分為多種細(xì)胞生長因子的貯存和細(xì)胞的黏附提供了條件，從而促進(jìn)細(xì)胞的存活和分化［10］。因此可以推測，以3D 形式構(gòu)建球狀體的同時(shí)加入ECM，能夠更好地促進(jìn)HepG2 細(xì)胞球狀體的形成和肝相關(guān)功能的分化。

肝臟脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)（Decellularized extracellular matrix，dECM）是通過脫細(xì)胞的方法獲取的組織特異性ECM［11］。通過對肝臟組織進(jìn)行洗脫劑和酶等的灌流和洗脫，肝臟組織中的細(xì)胞成分被去掉，留下了組織特異性的ECM 成分和部分生長因子［10－11］。研究表明，在體外培養(yǎng)HepG2 或PHH時(shí)加入dECM 制備的凝膠，能夠更好地維持細(xì)胞的存活與功能狀態(tài)［12］；另外，dECM 支架再細(xì)胞化后能支持肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的存活和功能，如白蛋白分泌、尿素合成和細(xì)胞色素P450 表達(dá)，其水平接近于正常肝臟［13］。由于dECM 具有種屬間低免疫原性的特點(diǎn)［14］，異種dECM 可以應(yīng)用，并成為dECM 的重要來源。此外，dECM 具有多種應(yīng)用形式，包括細(xì)胞支架與水凝膠等。微顆粒形式的dECM 能夠更好保留ECM 的天然特性，同時(shí)能夠應(yīng)用于HepG2 細(xì)胞的3D 球狀體構(gòu)建。本研究推測dECM 微顆粒能夠通過促進(jìn)HepG2 球狀體形成和提供微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)HepG2 細(xì)胞的肝功能分化。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量250 g，SPF 級，空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。本研究符合動物實(shí)驗(yàn)倫理原則。HepG2 細(xì)胞系（Procell CL－0103）由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。

肝素鈉（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司）；氫氧化鈉，Triton X－100（上海麥克林生化科技有限公司）；氯仿，異丙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco，美國）；胎牛血清（Sigma－Aldrich，美國）；Trizol，LIVE／DEAD 細(xì)胞活性毒性檢測試劑盒（Invitrogen，美國）；DEPC 水，引物（上海生工生物工程有限公司）；5×PrimeScript RT Master Mix，RNase Free H2O，2×TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa，日本）；超低吸附培養(yǎng)板（Corning，美國），靜脈留置針18 G（江西洪達(dá)醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司）；人白蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；尿素檢測試劑盒Urea Assay Kit（Abcam，美國）。

蠕動泵（LongerPump，英國）；真空冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；石蠟切片機(jī)（Leica，德國）；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific，美國）；倒置相差顯微鏡，倒置熒光顯微鏡（Olympus，日本）；離心機(jī)（Eppendorf，德國）；酶聯(lián)免疫檢測儀（Bio－Tek，美國）；基因擴(kuò)增儀（Biometra GmbH，德國）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Bio－Rad，德國）。

1.2 肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)的制備

將肝素鈉生理鹽水浸潤靜脈留置針管腔，并排空氣泡，備用。SD 大鼠麻醉后備皮。沿腹正中線及肋下緣剪開腹壁，形成T 型切口，暴露肝臟與腸管。暴露肝門區(qū)及門靜脈，置入留置針，經(jīng)留置針注入肝素鈉生理鹽水，同時(shí)剪斷下腔靜脈，沖洗肝臟。沖洗后，剪斷腔靜脈、肝動脈及膽管、肝周各韌帶，游離肝臟。將游離肝臟的留置針與蠕動泵管連接，以3.5 mL／min的速度依次灌流含肝素鈉的PBS 溶液1 h；雙蒸水，30 min 進(jìn)行溶脹；含0.02%EDTA 的PBS 溶液，30 min；含1%Triton 與0.05%NaOH 的水溶液，進(jìn)行脫細(xì)胞處理，持續(xù)12 h；雙蒸水，4 h；含慶大霉素的PBS，8 h。將制備好的脫細(xì)胞支架放入含有雙抗的PBS 溶液中，4 ℃保存。

1.3 脫細(xì)胞基質(zhì)微顆粒的制備

將脫細(xì)胞基質(zhì)放于液氮中冷凍2 min，隨后在液氮冷凍的條件下于研磨機(jī)中研磨成粉末。分裝于離心管中，于真空冷凍干燥機(jī)中凍干24 h。用PBS 重懸dECM 凍干粉末，2 000 r／min 離心5 min，沉淀，PBS 重懸為dECM 大顆粒。吸取上清，20 000×g離心15 min，棄上清，沉淀，PBS 重懸為dECM 小顆粒。再離心后，用0.3%過氧乙酸重懸沉淀，室溫放置10 min進(jìn)行消毒。隨后離心，使dECM 沉淀，PBS 重懸清洗，重復(fù)清洗5 遍。

1.4 正常肝臟與dECM 的組織染色與形態(tài)學(xué)觀察

將肝臟與dECM 浸入4%多聚甲醛中固定，過夜。取出組織塊，流水沖洗，脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟，HE、Masson 與免疫組織化學(xué)染色。掃描電鏡樣品制備時(shí)，將新鮮肝臟（對照）與dECM 浸入戊二醛電鏡固定液中固定過夜，然后放入真空冷凍干燥機(jī)中凍干24 h。掰斷或撕開截面，噴金，放入掃描電鏡觀察。

1.5 HepG2 細(xì)胞的培養(yǎng)與接種

含10%FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，每2～3 d 換液一次，細(xì)胞融合至80%時(shí)傳代。普通3D 培養(yǎng)時(shí)（對照組），將500μL 細(xì)胞懸液接種于24 孔平底超低吸附培養(yǎng)板或200μL 細(xì)胞懸液接種于96 孔U 型底超低吸附培養(yǎng)板。與dECM 混合進(jìn)行3D 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)（dECM 組），用培養(yǎng)基重懸dECM 沉淀，加入24 孔平底超低吸附培養(yǎng)板或96孔U 型底超低吸附培養(yǎng)板中，再加入含相同細(xì)胞數(shù)量的細(xì)胞懸液。接種后的細(xì)胞培養(yǎng)板，置于含5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，每2 d 換液一次。24孔平底超低吸附培養(yǎng)板換液時(shí)，吸盡孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入500μL 新鮮完全培養(yǎng)基；96 孔U 型底超低吸附培養(yǎng)板換液時(shí)，只吸除孔內(nèi)100μL 培養(yǎng)基，再加入100μL 新鮮完全培養(yǎng)基。

1.6 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)上清的人白蛋白和尿素氮檢測

回收24 孔平底超低吸附培養(yǎng)板第4、6、8 天換液時(shí)的培養(yǎng)上清，－80 ℃保存。檢測當(dāng)日于冰上解凍，振動混勻并離心。按照人白蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒和尿素檢測試劑盒的方法步驟，進(jìn)行檢測。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

3D 培養(yǎng)12 d 時(shí)，提取dECM 組及對照組96 孔U 型底超低吸附培養(yǎng)板中HepG2 細(xì)胞球狀體的總RNA。2D 培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞融合至90%時(shí)，提取總RNA。從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上，吸除培養(yǎng)液，加入PBS 清洗2 遍。吸盡PBS，每孔加入250μL Trizol，于冰上裂解5 min。將培養(yǎng)板孔中的Trizol 吹吸均勻后，移入無酶EP 管中。獲得RNA沉淀后，用75%乙醇洗滌。用20μL DEPC 處理水溶解RNA 沉淀，測量RNA 濃度。配制10μL 的反轉(zhuǎn)錄體系，加入RNA 500 ng，5×RT Mix 和相應(yīng)體積無酶水，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并獲得cDNA。配制10μL 定量PCR 體系，依次加入TB Green Premix Ex Taq Ⅱ5μL，上下游引物各0.4μL，無酶水3.2μL，cDNA 1μL。上下游引物序列詳見表1。上機(jī)進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)，獲得相應(yīng)數(shù)據(jù)后，以GAPDH 管家基因作為內(nèi)參，根據(jù)ΔΔCt 值作圖。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用Student’st檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脫細(xì)胞基質(zhì)的制備與表征

正常肝臟溶脹后，經(jīng)過12 h 脫細(xì)胞灌流，可見肝臟逐漸變成無色至白色之間的半透明樣果凍狀物質(zhì)（圖1A）。在脫細(xì)胞的過程中可見，有色的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞成分被逐漸洗去，而半透明的ECM 成分被保留下來。在HE 與Masson 組織學(xué)染色中可見，dECM 呈纖維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)；與正常肝臟相比，已無細(xì)胞狀與肝小葉樣的形態(tài)結(jié)構(gòu)，但可見管腔樣的形態(tài)結(jié)構(gòu)；dECM 的Masson 染色為藍(lán)色纖維樣形態(tài)，提示為膠原纖維；DAPI 熒光染色可見dECM 中無細(xì)胞核狀結(jié)構(gòu)；SEM 顯示dECM 為無細(xì)胞纖維狀結(jié)構(gòu)（圖1B）。免疫組織化學(xué)染色顯示，dECM 保留了膠原、型膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白幾種ECM 的主要成分（圖1C）。

圖1 脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的制備與表征Fig.1 Preparation and characterization of decellularized extracellular matrix

2.2 dECM 顆粒的制備與粒徑分布

經(jīng)過液氮冷凍研磨，dECM 呈細(xì)顆粒狀冰晶粉末，真空冷凍干燥后再用PBS 重懸，為白色懸濁液（圖2A）。懸液在2 000 r／min 的速度下離心獲得較大的dECM 顆粒，其粒徑分布測量顯示，體積加權(quán)平均直徑為98 μm；去掉大顆粒dECM，在較高速度離心下可獲得較小直徑的dECM 顆粒，其粒徑主要分布在數(shù)百納米到數(shù)微米之間（圖2B）。

圖2 脫細(xì)胞基質(zhì)微顆粒的制備和粒徑分布Fig.2 Preparation and particle size distribution of decellularized matrix microparticles

2.3 dECM 顆粒促進(jìn)HepG2 細(xì)胞形成球狀體

在U 型或平底超低吸附培養(yǎng)板中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，接種時(shí)加入dECM 顆粒，細(xì)胞更容易形成致密的細(xì)胞團(tuán)塊，即球狀體（圖3A、圖3B）。Live／Dead染色顯示，細(xì)胞團(tuán)中的細(xì)胞存活，其中無dECM 對照組中有個(gè)別紅染亮點(diǎn)（死細(xì)胞），表明dECM 顆粒能夠更好地促進(jìn)細(xì)胞存活（圖3C）。

圖3 脫細(xì)胞基質(zhì)顆粒促進(jìn)HepG2 球狀體形成Fig.3 Decelluarized matrix particles promoted the formation of HepG2 spheroids

2.4 dECM 顆粒促進(jìn)HepG2 球狀體肝相關(guān)功能分化

連續(xù)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，dECM 組的細(xì)胞培養(yǎng)上清中可檢測到更高濃度的白蛋白和尿素氮；對照組與dECM 組的培養(yǎng)上清中，白蛋白與尿素氮濃度均隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增加，而dECM 組增加的趨勢更為明顯（圖4A、圖4B）。PCR 結(jié)果顯示，以3D 形式培養(yǎng)的HepG2 球狀體，相對于2D 培養(yǎng)，有更高的肝功能相關(guān)基因表達(dá)；而加入dECM 的3D球狀體培養(yǎng)組，肝功能相關(guān)基因表達(dá)水平更高，其中包括CYP 類Ⅰ類代謝酶、UGT 類Ⅱ類代謝酶、OAT2Ⅲ類代謝酶；另外，3D 培養(yǎng)組中Ki67 基因表達(dá)水平均低于2D 組，說明細(xì)胞處于低增殖狀態(tài)（圖5）。

圖4 HepG2 球狀體分泌功能評估Fig.4 Evaluation of secretory function of HepG2 spheroid

圖5 HepG2 細(xì)胞球狀體肝功能相關(guān)基因的表達(dá)Fig.5 Expression of liver function related genes in HepG2 Spheroids

3 討論

HepG2 細(xì)胞系是被廣泛應(yīng)用于肝臟組織工程與肝功能相關(guān)研究領(lǐng)域的類肝細(xì)胞系，來源于一個(gè)15 歲的白人男性的肝癌組織，是人的肝癌細(xì)胞系，但具有一些肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞特有的功能。這些功能包括多種血漿蛋白的分泌，如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、維甲酸結(jié)合蛋白、β－脂蛋白、補(bǔ)體等，以及一定的物質(zhì)代謝和解毒的能力［15］。由于上述特性和易于獲取、可大量擴(kuò)增、處理簡單且壽命無限等特征，HepG2 細(xì)胞系成為生物人工肝支持系統(tǒng)（Bioartificial liver support system，BALSS）的常用細(xì)胞源，以及藥物毒性篩查常用的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞替代細(xì)胞系。雖然人原代肝細(xì)胞（Primary human hepatocytes，PHH）最接近體內(nèi)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)，是藥物與毒素的肝毒性檢測最具有體外參考價(jià)值的“金標(biāo)準(zhǔn)”［16］，但難于獲取，性狀在體外培養(yǎng)中難以維持且存在個(gè)體差異，因此無法廣泛應(yīng)用［17］。另外，由于PHH 不能擴(kuò)增和大量獲取，也限制了其成為BALSS 的細(xì)胞來源。因此，永生化的類肝細(xì)胞系成為在這些領(lǐng)域中替代PHH 的重要細(xì)胞來源。HepG2 細(xì)胞系是這類細(xì)胞系中的重要一員，相關(guān)的研究與應(yīng)用較多。

HepG2 細(xì)胞系與PHH 相比，肝功能和代謝相關(guān)的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)水平都較低，成為限制其應(yīng)用的最主要因素。其原因是，在傳統(tǒng)的2D 培養(yǎng)中，HepG2 細(xì)胞呈二維平面狀態(tài)生長，缺乏極性，表達(dá)低水平的細(xì)胞色素代謝酶、外源物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體和核受體，以及較低的蛋白分泌水平。而3D 形式的HepG2 細(xì)胞球狀體形式培養(yǎng)，能顯著提高HepG2 細(xì)胞的肝功能狀態(tài)和水平［6］。同時(shí)，3D 球狀體低增殖、高功能狀態(tài)的特性，為高通量的藥物肝損傷預(yù)測和提供BALSS 的細(xì)胞來源提供了便捷。另一原因是，體外細(xì)胞培養(yǎng)缺乏體內(nèi)維持細(xì)胞功能狀態(tài)的微環(huán)境和因子，而ECM 是這些因子和微環(huán)境的載體。天然ECM 中結(jié)合有多種酶、生長因子和其他生物活性分子，從而影響細(xì)胞功能［18］。Lee 等［12，19］的研究表明，用ECM 凝膠為HepG2 細(xì)胞提供生長環(huán)境時(shí)，能明顯提高其功能狀態(tài)，分泌更多的白蛋白和尿素氮，并促進(jìn)細(xì)胞的體外存活。同時(shí)，ECM 中也存在很多細(xì)胞黏附位點(diǎn)，能通過增加細(xì)胞黏附，從而促進(jìn)球狀體的形成。因此，在ECM 環(huán)境中培養(yǎng)的HepG2球狀體相比于二維培養(yǎng)的HepG2 細(xì)胞，理論上具有更好的肝細(xì)胞功能。

然而，利用單一的ECM 成分或個(gè)別成分的混合使用，很難完全模仿天然ECM 的特性。通過脫細(xì)胞方法獲得的dECM 能較完整保留組織特異性的ECM 成分，因此具有天然ECM 的屬性和功能，能夠?yàn)榧?xì)胞提供定植、存活和誘導(dǎo)功能分化等信號［20］。通過灌流脫細(xì)胞直接獲得的肝臟dECM 具有完整的器官形態(tài)結(jié)構(gòu)，但是并不便于直接應(yīng)用。為便于使用和制作細(xì)胞生物支架，以往研究中常將dECM 用酶消化，以形成凝膠。但這些消化的過程會破壞dECM 中的成分，而影響dECM 的生物活性。利用液氮冷凍研磨法將dECM 制備成微顆粒，能夠避免酶解消化過程，最大限度保留ECM 中的活性成分。同時(shí)，微顆粒形式的dECM 也便于后續(xù)的消毒處理、保存運(yùn)輸和化學(xué)修飾等；并且dECM 微顆粒也能直接應(yīng)用于細(xì)胞的三維培養(yǎng)，能夠促進(jìn)3D 球狀體的形成和提高細(xì)胞的功能狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)利用灌流脫細(xì)胞法獲得的dECM 保留了天然ECM 中的多種成分，并且可研磨成不同直徑的微顆粒。用不同離心速度分離微顆粒，可以獲得直徑在數(shù)百納米到數(shù)微米不等的dECM 微顆粒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將這些粒度較小的dECM 微顆粒應(yīng)用于HepG2 細(xì)胞的3D 培養(yǎng)，可以促進(jìn)HepG2 細(xì)胞形成更致密的球狀體；加入dECM 微顆粒的HepG2 球狀體組，細(xì)胞分泌白蛋白和尿素氮的水平增加；PCR結(jié)果也表明，加入dECM 微顆粒后，細(xì)胞的肝功能相關(guān)基因的表達(dá)水平也提升。因此，dECM 微顆粒能夠通過促進(jìn)HepG2 細(xì)胞球狀體的形成和提供細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境，進(jìn)一步提高HepG2 細(xì)胞的肝相關(guān)功能狀態(tài)。

綜上所述，dECM 以微顆粒的形式結(jié)合細(xì)胞的3D 培養(yǎng)，是提高HepG2 細(xì)胞肝相關(guān)功能狀態(tài)的一種有效方法。該方法可以使HepG2 細(xì)胞在藥物肝毒性篩查和生物人工肝裝置等肝臟組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用中具有更好的功能狀態(tài)，發(fā)揮更大的應(yīng)用潛力。同時(shí)，也為其他永生化肝細(xì)胞系在肝臟組織工程領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了借鑒。