不同脂肪處理純化方法對(duì)移植脂肪組織的影響

陳兵 李發(fā)成

自體脂肪移植，手術(shù)操作簡(jiǎn)單，創(chuàng)傷小，恢復(fù)快，效果好，并且組織來源充足，無排斥反應(yīng)，因而被廣泛應(yīng)用于修復(fù)各類軟組織缺損以及美容外科領(lǐng)域，尤其在乳房外科中的應(yīng)用愈發(fā)得到整形外科的重視和認(rèn)可［1］。然而，在臨床應(yīng)用中，特別是大體積脂肪移植時(shí)，移植脂肪存在較高的吸收率和壞死率，體積保留率僅為50%～70%［2－3］。因此，提高移植后的脂肪組織成活率一直是自體脂肪移植領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

為了促進(jìn)移植脂肪存活再生，提高脂肪移植效率，通過添加外源性促成脂、促血管化刺激來輔助脂肪移植，在一定程度上有效提高了脂肪移植存活率，已應(yīng)用的方法包括細(xì)胞輔助脂肪移植技術(shù)（CAL）［4－5］、添加富血小板血漿（PRP）［6－7］、脂肪源干細(xì)胞基質(zhì)膠（SVF－gel）［8－9］以及脂肪脫細(xì)胞提取液［10］等。自體脂肪移植術(shù)后的效果，還取決于術(shù)中的操作和處理，包括脂肪的抽吸、處理純化以及注射技術(shù)等。其中，脂肪的處理純化方法是影響脂肪移植成活率的主要因素之一，處理純化后的脂肪組織應(yīng)含盡量少的水、油脂顆粒、血液來源細(xì)胞以及細(xì)胞碎片，盡可能保持脂肪細(xì)胞的完整性，且富含脂肪干細(xì)胞。因此，優(yōu)化脂肪的處理純化技術(shù)，提高脂肪移植效率是臨床一直關(guān)注和致力于解決的問題。

目前，脂肪的處理純化方法主要有靜置沉淀法、清洗沉淀法、離心法與過濾濃縮法等。靜置沉淀與清洗沉淀法操作簡(jiǎn)單、對(duì)組織破壞小，但濃縮效率偏低；離心法是應(yīng)用最廣泛的脂肪濃縮處理方法，但爭(zhēng)議也較大。Kurita 等［11］認(rèn)為，離心法能較大程度地濃縮脂肪組織，提高單位體積移植物中脂肪細(xì)胞數(shù)目與脂肪干細(xì)胞的比例。雷華等［12］則認(rèn)為，無論是高速還是低速離心，脂肪顆粒的活性都會(huì)受損，建議慎用離心法處理純化脂肪顆粒。Conde－Green等［13］比較了靜置法、清洗法和離心法處理純化的脂肪組織中的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞膜完整性以及脂肪干細(xì)胞數(shù)量，認(rèn)為清洗法最大限度上保留了脂肪細(xì)胞活性以及內(nèi)皮細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞的數(shù)量。

為了對(duì)比不同的純化方法對(duì)移植脂肪的影響，本研究比較了靜置沉淀法、清洗沉淀法、離心法和棉墊吸附濃縮法4 種臨床最常用的脂肪處理純化方法，體外觀察脂肪組織的細(xì)胞完整性、脂肪細(xì)胞活性、脂肪組織內(nèi)水和油脂含量、SVF 細(xì)胞數(shù)量、脂肪干細(xì)胞含量等體外研究指標(biāo)，并構(gòu)建裸鼠脂肪移植模型進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，為優(yōu)化脂肪移植技術(shù)、提高脂肪移植后存活效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

低糖DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone，美國(guó)），胎牛血清（Gibco，美國(guó)），Ⅰ型膠原酶（Sigma，美國(guó)），甘油－3－磷酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒（Kamiya，美國(guó)），Perilipin A抗體（Abcam，美國(guó)），CD45、CD31、CD34、CD105 流式抗體（BD，美國(guó)）。

倒置相差顯微鏡（Olympus BX5，日本），Megaf Uge 離心機(jī)（Thermo Scientific，美國(guó)），AriaⅡ流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)），NanoDrop 2000c 微量分光光度計(jì)（Thermo Scientific，美國(guó)）。

1.2 脂肪組織的獲取

脂肪組織取自20 位接受脂肪抽吸手術(shù)的健康女性。所有獲取的脂肪組織隨機(jī)平均分為4 組，分別采用靜置沉淀法、清洗沉淀法、離心法和棉墊吸附濃縮法進(jìn)行純化處理，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核同意，所有患者均已簽署知情同意書。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALD／c 裸鼠，6 周齡（中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），由我院研究中心動(dòng)物室喂養(yǎng)管理。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置遵守科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)規(guī)定。

1.4 脂肪組織分組與處理純化

A 組，靜置沉淀組，脂肪放置在20 mL 的注射器中，注射器垂直靜置沉淀15 min。從上到下最終分為油脂層、脂肪組織層和液體層，去除上層油脂和底層液體層，保留中間脂肪組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖1Aa）。

B 組，清洗沉淀組，脂肪經(jīng)等體積生理鹽水清洗2 遍，放置在20 mL 的注射器中，靜置沉淀15 min，取中間層脂肪組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖1Ab）。

C 組，離心組，脂肪放置在20 mL 的注射器中離心（1 200×g，3 min，4 ℃）。同樣取中間層脂肪組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖1Ac）。

D 組，棉墊吸附濃縮組，抽吸的脂肪經(jīng)生理鹽水清洗后倒入無菌棉墊，吸附濃縮去除水分和游離油脂（圖1Ad）。

1.5 脂肪組織含水量和游離油脂含量測(cè)定

取各組處理純化后的脂肪組織10 mL，分別放入15 mL 離心管中離心（1 200×g，3 min，4 ℃）。離心后，該組織成分按不同密度從上到下依次分為：游離油脂層、脂肪組織層和水液體層，分別測(cè)量游離油脂層、脂肪組織層和水液體層的體積占總體積的比例（圖1B）。

圖1 4 種純化方法處理后脂肪組織的含水量及油脂含量Fig.1 Water content and oil content of lipoaspirate processed by 4 purification methods

1.6 SVF 計(jì)數(shù)與亞群統(tǒng)計(jì)

取每組處理純化后的脂肪組織10 mL 置于50 mL離心管中，加入等體積含0.1% Ⅰ型膠原酶的DMEM 低糖培養(yǎng)基混合，置于37 ℃振蕩箱中消化60 min 后，去除上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM 低糖培養(yǎng)基重懸底部沉淀物，吹打混勻后離心（1 200×g，5 min）。去上清后，底部沉淀物振蕩重懸于紅細(xì)胞裂解液中，室溫下放置5 min。沉淀物重懸于PBS 緩沖液，1 200×g離心5 min，該過程反復(fù)2 次。濾網(wǎng)過濾后，濃縮至1 mL 細(xì)胞懸液，移入1.5 mL的EP 管中，取細(xì)胞懸液10μL 進(jìn)行有核細(xì)胞計(jì)數(shù)。

上述各組細(xì)胞定量后，將細(xì)胞懸液濃縮成每100μL 含1×106個(gè)有核細(xì)胞，分別移入1.5 mL 的EP 管中。各組SVF 細(xì)胞分別依次加入CD31、CD34、CD45、CD105 抗體，陽(yáng)性、陰性對(duì)照組加入同型抗體，充分混合后避光冰浴30 min。用流式分析緩沖液清洗后，將上述細(xì)胞懸液濾網(wǎng)過濾入流式分析管，依次上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞分析。

1.7 脂肪細(xì)胞完整性和活性檢測(cè)

1.7.1 脂肪細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察

各組脂肪組織用4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，HE 和免疫組化染色。鏡下觀察并比較4 種不同純化方法處理的脂肪的組織學(xué)特點(diǎn)。HE染色用于觀察組織鏡下結(jié)構(gòu)，脂周蛋白（Perilipin，PLIN）免疫組化染色用于觀察脂肪細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性。

1.7.2 脂肪細(xì)胞代謝活性檢測(cè)

甘油－3－磷酸脫氫酶（G3PDH）活性可用于評(píng)估各組脂肪細(xì)胞活性，G3PDH 活性越高，移植物中脂肪細(xì)胞功能越好。參照使用說明書，應(yīng)用G3PDH檢測(cè)試劑盒定量檢測(cè)G3PDH 活性，并根據(jù)公式G3PDH 活性（U／mL）＝ΔOD×0.482×20 計(jì)算脂肪組織細(xì)胞內(nèi)G3PDH 活性值。

1.8 動(dòng)物試驗(yàn)

6 周齡BALD／c 裸鼠共60 只，分3 次進(jìn)行脂肪組織移植，每次20 只裸鼠，按靜置沉淀法、清洗沉淀法、離心法與棉墊濃縮法分為4 組，每次每組5 只裸鼠。

1.8.1 脂肪移植

每次脂肪組織取自于一位患者，脂肪的分組和處理純化方法如前所述。1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉裸鼠后，應(yīng)用1 mL 注射器將脂肪組織移植于裸鼠雙側(cè)背部，每側(cè)背部移植脂肪量為0.5 mL，每側(cè)移植面積為1 cm×2 cm，操作時(shí)注意多方向、多隧道、多點(diǎn)均勻注射。

1.8.2 大體觀及稱重

脂肪移植12 周后，頸椎脫臼法處死裸鼠，剪開皮膚取出移植脂肪組織，觀察移植物組織形態(tài)并稱重、記錄，最后用4%多聚甲醛固定。

1.8.3 組織學(xué)分析

各組脂肪組織常規(guī)脫水和石蠟包埋后切片，HE染色和PLIN 免疫組化染色觀察組織學(xué)特點(diǎn)。每組隨機(jī)抽取10 張切片，每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野進(jìn)行鏡下雙盲評(píng)估。每張切片根據(jù)有核脂肪細(xì)胞的完整性、囊腫或空泡的數(shù)量、纖維化及炎性反應(yīng)程度分級(jí)。0 ＝無，1 ＝極少，2 ＝極少至中等，3 ＝中等，4 ＝中等至廣泛，5 ＝廣泛。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism 8 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，選擇單因素方差分析對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 處理純化的脂肪組織含水量和細(xì)胞外油脂含量

各組處理純化后的脂肪組織含水量（圖1C）：A組25.4%±3.2%，B 組24.5%±1.5%，C 組6.2%±2.3%，D 組6.6%±2.3%。A 組與B 組大于C 組與D 組（P＜0.05）；A 組與B 組含水量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；C組與D 組含水量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

各組處理純化后的脂肪組織細(xì)胞外油脂含量（圖1D）：A 組8.1%±3.4%，B 組6.9%±3.1%，C 組4.9%±2.1%，D 組2.0%±0.8%。A 組最高，與C 組及D 組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；B 組大于C組及D 組（P＜0.05）；C 組細(xì)胞外油脂含量大于D組（P＜0.05）；D 組細(xì)胞外油脂含量最低，與其余各組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2.2 SVF 細(xì)胞數(shù)量與流式細(xì)胞分析結(jié)果

各組處理純化的脂肪組織中SVF 細(xì)胞數(shù)量：A組（1.78±0.78）×106／mL，B 組（2.07±0.91）×106／mL，C 組（2.96±1.44）×106／mL，D 組（2.87±0.89）×106／mL。A 組SVF 數(shù)量小于C 組 與D 組（P＜0.05），其余各組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2A）。

CD45＋細(xì)胞：A 組大于D 組（P＜0.05）；CD31＋CD45－細(xì)胞：B 組大于A 組（P＜0.05）。余無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。

表1 流式細(xì)胞檢測(cè)SVF 中各類細(xì)胞含量Table 1 Content of each type of cells in SVF detected by flow cytometry

2.3 G3PDH 活性

G3PDH 活性（圖2B）：A 組（0.093±0.039）U／mL，B 組（0.093±0.045）U／mL，C 組（0.144±0.023）U／mL，D 組（0.131±0.017）U／mL。C 組G3PDH 活性最高，大于A 組和B 組（P＜0.05），但與D 組的G3PDH 活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。D 組G3PDH 活性大于A 組和B 組（P＜0.05）。

圖2 4 種純化方法處理后脂肪SVF 細(xì)胞數(shù)量（A）與細(xì)胞活性（B）Fig.2 SVF cell number and G3PDH activity of lipoaspirate processed by 4 purification methods

2.4 處理純化的脂肪組織HE 染色結(jié)果

HE 染色顯示，經(jīng)4 種不同的方法處理純化后，各組脂肪組織均有少量脂肪細(xì)胞破裂，但大部分脂肪細(xì)胞的形態(tài)較為完整，各組脂肪組織細(xì)胞的完整性在鏡下無明顯差別（圖3）。

PLIN 免疫組織化學(xué)染色顯示，各組脂肪組織均有部分細(xì)胞周脂素蛋白不完整，提示有脂肪細(xì)胞損傷，但大部分脂肪細(xì)胞形態(tài)較為完整，各組鏡下無明顯差別（圖3）。

圖3 純化脂肪組織HE 染色和PLIN 免疫染色（標(biāo)尺：200 μm）Fig.3 HE staining and PLIN immunestaining of processed lipoaspirate（scale bar： 200 μm）

2.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

裸鼠死亡11 只，成活49 只，其中A 組成活10只，其余各組均成活13 只。

2.5.1 新生組織大體觀及稱重

各組新生脂肪組織形狀略不規(guī)則，外觀呈淡黃白色，表面有一層包膜包裹，觸之較柔軟，組織表面有新生細(xì)小血管形成。D 組新生脂肪組織的體積明顯大于其余3 組（圖4）。

圖4 新生組織大體形態(tài)觀察Fig.4 Gross observation of tissue samples

新生組織重量：A 組（0.081±0.041）g，B 組（0.093±0.060）g，C 組（0.085±0.053）g，D 組（0.149±0.068）g。D 組新生組織重量大于A、B、C 組（P＜0.05）。此3 組之間脂肪重量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.5.2 新生組織的組織學(xué)觀察結(jié)果

HE 染色顯示4 組新生組織周圍均有纖維組織包膜，外周可見結(jié)構(gòu)較為完整的脂肪細(xì)胞，脂肪細(xì)胞大小也較為均勻，排列整齊緊密，外周纖維組織增生及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)較明顯，而囊腫形成較少。中央部分則有組織壞死，進(jìn)而形成囊腫和空腔，移植物內(nèi)有血管形成。各組新生組織的有核脂肪細(xì)胞的完整性、囊腫或空泡形成、纖維化與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均無明顯差異（表2、圖5）。

表2 不同純化方式的新生脂肪組織細(xì)胞的完整性、囊腫或空泡、纖維化和炎性浸潤(rùn)分級(jí)Table 2 Grade of integrity，cysts or vacuoles，fibrosis，and inflammatory infiltration of new adipose tissue cells by different purification methods

PLIN 染色顯示4 組新生組織周圍均有PLIN＋新生脂肪細(xì)胞產(chǎn)生，與原有正常脂肪細(xì)胞相比，體積較小。A 組、B 組、C 組中，僅組織周圍區(qū)域發(fā)現(xiàn)少量散在PLIN＋新生脂肪細(xì)胞（圖5）。D 組中，組織周圍區(qū)域內(nèi)可見連片的PLIN＋新生脂肪細(xì)胞，并且還可見到PLIN＋新生脂肪細(xì)胞深入到組織中間（圖6）。

3 討論

自體脂肪組織移植無免疫排異反應(yīng)、組織來源充足、填充效果好，因而被廣泛應(yīng)用于軟組織重建。然而，脂肪組織移植后存在較高的吸收率，并伴隨脂肪液化壞死、感染、結(jié)節(jié)形成等風(fēng)險(xiǎn)，在很大程度上制約了脂肪移植在臨床中的推廣應(yīng)用。因此，提高脂肪移植后的存活率是臨床普遍關(guān)注的問題。

解決這一問題的方法主要分為兩類：第一類，優(yōu)化脂肪獲取、純化及移植技術(shù)；第二類，添加外源性刺激輔助脂肪移植。目前，外源性輔助刺激手段包括細(xì)胞輔助移植（CAL）、納米脂肪、SVF－gel、脂肪脫細(xì)胞提取液、PRP 等，這些手段通過富集ADSCs 或VEGF、TGF－β、bFGF、PDGF 等生物活性因子促進(jìn)組織修復(fù)、血管新生，在一定程度上明顯改善了脂肪壞死吸收，提高了脂肪移植后的存活率［14］。然而，面對(duì)復(fù)雜制備流程和倫理安全風(fēng)險(xiǎn)，這些技術(shù)的臨床廣泛應(yīng)用尚存阻礙。因此，目前臨床上使用的傳統(tǒng)脂肪移植改良方法大多圍繞術(shù)中的處理環(huán)節(jié)開展，通過優(yōu)化脂肪獲取、純化及移植的操作技巧來降低對(duì)脂肪組織的破壞，提高脂肪移植效率。其中，脂肪的純化處理是影響脂肪移植術(shù)后效果的關(guān)鍵因素，方法主要包含靜置沉淀法、清洗沉淀法、離心法和棉墊吸附濃縮法。這些方法各有優(yōu)劣，關(guān)于移植脂肪的最佳純化處理方法目前尚未達(dá)成一致意見。

本研究通過比較4 種不同方法純化處理后的脂肪的細(xì)胞完整性、脂肪活性、SVF 數(shù)量、ADSCs 含量和體內(nèi)移植效果，來系統(tǒng)性評(píng)估不同的脂肪純化處理對(duì)脂肪移植的影響。結(jié)果表明，離心組和棉墊吸附濃縮組的體外指標(biāo)總體優(yōu)于靜置沉淀組和清洗沉淀組。離心法和棉墊濃縮吸附法比靜置沉淀法和清洗沉淀法更能有效去除移植物中的水分、油脂，增加有效成分比例，有助于減輕移植后受區(qū)組織炎癥反應(yīng)，促進(jìn)脂肪存活與再生。離心組和棉墊吸附濃縮組的SVF 數(shù)量和活性脂肪細(xì)胞更多。流式細(xì)胞分析中代表脂肪來源干細(xì)胞的CD34＋CD45－，CD105＋CD45－細(xì)胞的百分比，靜置沉淀組雖然低于其他3組，但無顯著性差異，可能原因是本實(shí)驗(yàn)樣本量較少，同組中不同樣本間差異較大。但考慮到靜置沉淀組中SVF 細(xì)胞數(shù)量本來就少于其他3 組，該組脂肪來源干細(xì)胞是較少的。代表血液來源的CD45＋細(xì)胞在靜置沉淀組中最多，棉墊吸附濃縮組中最少，有顯著性差異，說明棉墊吸附濃縮組去除血液來源細(xì)胞最為徹底，對(duì)減少移植后受區(qū)炎癥反應(yīng)、提高脂肪成活率有一定幫助。HE 和PLIN 免疫染色觀察顯示，4 組脂肪細(xì)胞均有少量破裂，大部分都保持完整，各組之間的細(xì)胞完整性無明顯區(qū)別。從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，棉墊吸附濃縮組結(jié)果顯著優(yōu)于其余3組，值得注意的是，不同于體外指標(biāo)，離心組的新生脂肪組織的重量明顯低于棉墊吸附濃縮組。離心組游離油脂含量為4.9%±2.1%，而棉墊吸附濃縮組為2.0%±0.8%。游離油脂的含量越高，說明脂肪細(xì)胞的損傷破裂程度較高。

以上結(jié)果表明，與靜置沉淀法和清洗沉淀法相比，離心法和棉墊濃縮吸附法處理的脂肪組織雜質(zhì)更少、純度更高、脂肪細(xì)胞活性更好，其中又以棉墊吸附濃縮法處理更溫和，對(duì)脂肪破壞更小，體內(nèi)移植存活率更高。