Foxc2 基因?qū)C3T3?E1 細胞成骨能力影響的實驗研究

王敏嬌 司家文 沈洪洲 游清玲 沈國芳

Foxc2 作為Fox 家族C 亞家族中的一員，在真核生物中十分保守。Forkhead 蛋白在調(diào)控胚胎發(fā)育、代謝、免疫、應(yīng)激反應(yīng)以及分化調(diào)控等方面均發(fā)揮了重要的作用［1］。Foxc2 初期在小鼠胚胎頭部的神經(jīng)嵴、中胚層來源的間充質(zhì)細胞以及軀干部的非脊索中胚層中廣泛表達，而后在頜面部局限表達［2］。在關(guān)鍵成骨基因過表達或敲除的小鼠中可觀察到面部發(fā)育異常，同時Foxc2 的表達也有相應(yīng)的變化［3－4］。本研究擬選取小鼠前成骨細胞系MC3T3?E1，通過慢病毒及siRNA 轉(zhuǎn)染改變其Foxc2 表達，明確Foxc2 的功能，并通過基因芯片技術(shù)篩查差異表達基因，探索參與相關(guān)通路的Foxc2 下游靶基因。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

MC3T3?E1 細胞（亞克隆14，中國科學院細胞庫），α－MEM 培養(yǎng)基（Gibico，美國），血清（Gibico，美國），胰酶（Gibico，美國），成骨誘導(dǎo)液（Cyagen，美國），甲狀旁腺激素（Sigma，美國），辛伐他?。⊿igma，美國），慢病毒載體（上海和元生物），siRNA（上海拓然生物有限公司，中國），實時定量PCR 試劑盒（TaKaRa，日本），PCR 引物（上海生工生物科技有限公司），F(xiàn)oxc2 抗體（Abcam，美國），GAPDH／Runx2 抗體（CST，美國），堿性磷酸酶顯色試劑盒（南京碧云天生物技術(shù)有限公司）。

熒光定量PCR 儀（ABI，美國），Odyssey 雙色紅外激光成像儀（LI－COR，美國），表達譜芯片（Agilent，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 MC3T3?E1 細胞的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)

以成骨誘導(dǎo)液、甲狀旁腺激素（濃度10－8mmol／L）、辛伐他?。舛?0－8mmol／L）誘導(dǎo)培養(yǎng)MC3T3?E1細胞。收集細胞樣品，通過后續(xù)實驗確認Foxc2 表達水平的變化。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建Foxc2 穩(wěn)定過表達MC3T3?E1 細胞系

采用慢病毒plenti－Foxc2 及plenti－EGFP 轉(zhuǎn)染MC3T3?E1 細胞構(gòu)建MC3T3?E1Foxc2＋（實驗組）及MC3T3?E1EGFP（對照組）。以2×105個／cm2的密度將MC3T3?E1 細胞接種于6 孔板中，次日更換為含5 μg／mL Polybrene 的無血清培養(yǎng)基。加入慢病毒感染靶細胞，感染24 h 后換成含10%FBS 的無抗生素α－MEM 培養(yǎng)基。培養(yǎng)72 h 后通過嘌呤霉素篩選獲得Foxc2 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。

1.2.3 siRNA 干擾Foxc2 表達

采用siRNA 干擾技術(shù)構(gòu)建MC3T3?E1si－Foxc2（實驗組）及MC3T3?E1si－NC（對照組）。選用Lipo2000 為轉(zhuǎn)染介質(zhì)，待6 孔板內(nèi)的細胞達到80%左右，開始轉(zhuǎn)染。準備兩只EP 管，A 管加入250μL Opti－MEM 和10μL 20 μmol／L 的siRNA 儲存液，B 管加入250μL Opti－MEM（無血清）和5μL lipo2000，然后混勻AB兩管，室溫孵育20 min，形成siRNA／lipo2000 混合液，將以上混合液加入含有細胞的1 500μL 培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中，來回輕柔搖晃細胞培養(yǎng)板。細胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱溫育48 h，進行轉(zhuǎn)染后的其他檢測步驟。

1.2.4 CCK－8 試劑盒檢測

將處于對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化，制成細胞懸液，接種至96 孔板，每孔控制細胞數(shù)1 000 個左右，每組設(shè)4 個復(fù)孔。37 ℃、5%CO2條件下孵育培養(yǎng)7 d。每孔加入10μL 的CCK－8 溶液，輕輕敲擊培養(yǎng)板使其混勻，37 ℃下孵育2 h，分別測量450 nm處每孔的光密度（OD）值。根據(jù)OD 值繪制增殖曲線。

1.2.5 流式細胞儀檢測

周期：消化并收集兩組細胞沉淀，預(yù)冷的70%乙醇固定，4 ℃過夜；次日再次收集細胞沉淀，PBS漂洗，以除去乙醇；調(diào)整細胞密度至1×109個／L，每個EP 管內(nèi)加入300μL PI／RNase 混勻，避光孵育15 min 后，上流式細胞儀FACStar 進行檢測。

凋亡：細胞培養(yǎng)達到85%融合時，將上清培養(yǎng)液收集到離心管內(nèi)，PBS 漂洗，收集細胞沉淀于上一步的離心管內(nèi)；將細胞重懸于1×buffer 中，分別加入5μL Annexin Ⅴ－PE 和5μL 7－AAD 染劑，避光室溫孵育15 min。移入流式管，1 h 內(nèi)流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 基因mRNA 以及蛋白表達檢測

實時定量PCR：收集細胞，無菌預(yù)冷PBS 清洗2次，Trizol 提取細胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行實時熒光定量反應(yīng)。反應(yīng)體系：上下游引物各0.5μL，cDNA 模板1μL，ROX 0.5μL，SYBR 10μL，加入DEPC 水7.6μL 補足，共計20μL。每組樣本設(shè)3 個復(fù)孔。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)已檢測的Ct值即循環(huán)閾，采用ΔΔCt 法計算基因相對表達量變化（表1）。

表1 實時定量PCR 引物序列Table 1 Primer oligonucleotide sequences used for real－time PCR

Western blot：RIPA 裂解液充分裂解細胞并提取總蛋白，BAC 蛋白試劑盒測定蛋白濃度，取20 μg 進行SDS－PAGE，再轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜。然后加入熒光二抗室溫避光孵育1 h，放入Odyssey 雙色紅外激光成像儀，掃描顯色。

1.2.7 ALP 染色

采用成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)細胞，方法同1.2.1。于第7 天收集細胞，4%多聚甲醛固定，PBS 漂洗，堿性磷酸酶孵育液孵育3～6 h，PBS 漂洗，待風干后觀察染色情況。

1.2.8 茜素紅染色

采用成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)21 d，4%多聚甲醛固定，PBS 漂洗，每孔加入新鮮過濾的茜素紅孵育液500μL染色。掃描儀及光學顯微鏡觀察茜素紅染色情況。

1.2.9 高通量表達譜芯片及下游靶基因?qū)崟r定量PCR 初步驗證

對MC3T3?E1Foxc2＋及MC3T3?E1EGFP細胞進行細胞基因芯片檢測，主要步驟包括樣品采集及總RNA提取、總RNA 的純化和質(zhì)量控制、cDNA 的合成、熒光標記cRNA 的合成純化和濃度測定、cRNA 樣品片段化和芯片雜交、芯片洗滌、芯片掃描、實驗數(shù)據(jù)的處理分析。根據(jù)芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果選定潛在下游靶基因，并通過實時定量PCR 進行驗證，操作同1.2.6。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0 進行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Foxc2 在MC3T3?E1 細胞成骨誘導(dǎo)后出現(xiàn)上調(diào)

在成骨誘導(dǎo)液、PTH、辛伐他汀的誘導(dǎo)后收集細胞樣品進行檢測，F(xiàn)oxc2 基因的表達水平在誘導(dǎo)初期即出現(xiàn)上調(diào)，而后緩慢回落至基線水平（圖1）。

圖1 實時定量PCR（A、C、E）和Western 印跡法（B、D、F）檢測成骨刺激下的Foxc2 表達變化Fig.1 Real－time PCR analysis（A，C，E） and Western blot analysis（B，D，F(xiàn)） of Foxc2 expression after osteogenic stimulation

2.2 Foxc2 在MC3T3?E1 細胞株實現(xiàn)持續(xù)高表達

通過慢病毒轉(zhuǎn)染，嘌呤霉素篩選培養(yǎng)MC3T3?E1Foxc2＋細胞株及MC3T3?E1EGFP細胞株，共聚焦顯微鏡檢測到FITC 綠色熒光。繼續(xù)培養(yǎng)，收集細胞樣品進行后續(xù)實驗。實時定量PCR 檢測結(jié)果顯示，MC3T3?E1Foxc2＋組Foxc2 mRNA 表達水平上調(diào)超過80 倍（P＜0.05）；Western blot 檢測結(jié)果顯示，MC3T3－E1Foxc2＋組出現(xiàn)過表達目的條帶。上述結(jié)果提示，慢病毒成功轉(zhuǎn)染MC3T3?E1 細胞并有效表達（圖2）。

2.3 Foxc2 過表達抑制細胞增殖

如圖3 所示，兩組細胞增殖活性初期無明顯差異；第4 天時，MC3T3?E1Foxc2＋細胞增殖活性降低，其在450 nm 處的OD 值小于MC3T3?E1EGFP細胞，而后差異逐漸增大，D4～D7 的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。流式細胞儀分析顯示兩組細胞凋亡無明顯差異。通過各周期細胞比例分析，MC3T3?E1Foxc2＋組的G1 期細胞比例增加，S 期和G2／M 期的細胞比例降低，其中G1 期細胞比例變化差異顯著（P＜0.05）。

圖3 慢病毒轉(zhuǎn)染后兩組MC3T3?E1 細胞增殖情況Fig.3 Proliferation of MC3T3?E1 cells after lentivirus transfection in the two groups

2.4 Foxc2 過表達促進MC3T3?E1 細胞成骨向分化

成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)7 d，實驗組的Runx2 的mRNA 和蛋白表達水平均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。誘導(dǎo)至第7 天時進行ALP 染 色，兩組細胞均有著色，符合MC3 T3?E1 細胞的特性，對比發(fā)現(xiàn)過表達Foxc2 的實驗組染色較深且著色細胞較多。第21 天時，茜素紅染色實驗，兩組均成功觀察到鈣結(jié)節(jié)（圖4）。

圖4 慢病毒轉(zhuǎn)染后兩組MC3T3?E1 細胞成骨分化觀察Fig.4 Osteogenesis of MC3T3?E1 cells after lentivirus transfection in the two groups

2.5 siRNA 干擾Foxc2 表達，反向驗證基因功能

提取siRNA 干擾MC3T3?E1 的細胞樣品，實驗組的Foxc2 的mRNA 及蛋白表達均減低，提示Foxc2－siRNA 成功轉(zhuǎn)染。Foxc2 的表達水平降低后，可以觀察到細胞的增殖能力較對照組有所提高，Runx2 的蛋白表達水平均有所下降，且ALP 染色變淺（圖5）。

圖5 Foxc2－siRNA 對MC3T3?E1 細胞的作用Fig.5 Effect of Foxc2－siRNA on MC3T3?E1 cells

2.6 基因芯片初步篩選下游靶基因并初步驗證

MC3T3?E1Foxc2＋細胞與MC3T3?E1EGFP組差異表達的基因有1 234 條，其中上調(diào)基因950 條，下調(diào)基因284 條。將差異表達的基因帶入KEGG 數(shù)據(jù)庫進行通路分析，顯示有25%的差異基因參與了細胞因子間的受體相互作用。選取MMP9、MMP13、EREG基因作為研究目標，并通過實時定量PCR 成功驗證芯片結(jié)果（圖6、7）。

圖6 GO 分析和KEGG 通路分析Fig.6 GO analysis and KEGG pathway analysis

圖7 實時定量PCR 驗證芯片結(jié)果Fig.7 Real－time PCR verification of gene chip results

3 討論

Foxc2 蛋白在人和小鼠兩種種屬間呈高度保守狀態(tài)，參與了機體的眾多生理過程。如果使用非特異基因敲除方法獲得Foxc2 基因敲除小鼠，大多數(shù)的Foxc2－／－小鼠胚胎會在出生前死亡，少數(shù)可以出生，但存在明顯發(fā)育缺陷，如主動脈弓離斷、顱頜面骨缺損等，在口腔頜面部主要表現(xiàn)為正中腭裂、軟腭缺失、上頜骨和蝶骨大翼發(fā)育不全及位置轉(zhuǎn)移等［2，5］。淋巴水腫－重睫綜合征（Lymphedema－distichiasis syndrome，LDS）是一種常染色體顯性遺傳病，人Foxc2 基因突變是導(dǎo)致LDS 的重要原因，LDS 常同時伴發(fā)椎骨畸形、硬膜外囊腫、上瞼下垂、腭裂等癥狀，提示Foxc2 基因與人顱頜面發(fā)育密切相關(guān)［6－7］。Foxc2 同樣影響人體脂代謝與骨改建，Yamada 等［8］于2006 年針對日本老年人群的研究指出，絕經(jīng)后女性的橈骨遠端以及整個機體的骨密度水平與Foxc2 的基因多態(tài)性明顯相關(guān)。動物實驗的結(jié)果同樣驗證了Foxc2 的功能：在小鼠肥胖－骨形成異常模型中可以發(fā)現(xiàn)Foxc2 表達水平在病變小鼠的白色脂肪組織內(nèi)出現(xiàn)下調(diào)，同時病變小鼠的骨形成出現(xiàn)障礙［9］。上述研究均提示Foxc2 參與了顱頜面軟硬組織發(fā)育過程及機體骨形成過程。

近些年關(guān)于Foxc2 功能的多項體外研究顯示，在多種成骨誘導(dǎo)因子培養(yǎng)下，多種具有分化潛能的前體細胞內(nèi)的Foxc2 表達水平顯著升高［10－14］。本課題組前期研究表明，成骨誘導(dǎo)后的羊水干細胞中可檢測到Foxc2 的高表達，初步證實了Foxc2 基因的過表達可抑制C3H10T1／2 細胞增殖；上調(diào)成骨相關(guān)基因Runx2 的表達，可促進細胞成骨向分化并抑制脂向分化［15］。但是，關(guān)于Foxc2 在成骨分化過程中的作用仍需繼續(xù)研究。

Kim 等［16］指出，F(xiàn)oxc2 維持β－catenin 的活性，刺激TCF／LEF 轉(zhuǎn)錄活性，激活經(jīng)典的Wnt－βcatenin 通路，同時cAMP－PKA 途徑也參與其中。Gozo 等［17］提出，持續(xù)高表達的Foxc2 將促進前成肌細胞C2C12 成骨向分化的趨勢，其主要機制在于Foxc2 直接作用于Wnt4 啟動子區(qū)域，可激活Wnt4和BMP4 信號通路，從而抑制細胞成肌分化并轉(zhuǎn)為骨向分化。Hsu 等［18］通過CRISPR 技術(shù)激活BMSC的內(nèi)源性Wnt10b 及Foxc2 的共表達，可促進其骨向分化。Park 等［19］提出，F(xiàn)oxc2 的表達水平在骨代謝因子（甲狀旁腺激素／BMP2）的刺激下出現(xiàn)上調(diào)，并且存在劑量表達相關(guān)效應(yīng)。過表達Foxc2 可以刺激整合素β1 的表達，整合素β1 直接結(jié)合到Forkhead結(jié)構(gòu)域的啟動子上，從而調(diào)節(jié)細胞分化。

本研究中，首先采用多種成骨誘導(dǎo)因子作用于MC3T3?E1 細胞［20］，觀測到Foxc2 的表達水平在細胞成骨分化過程中出現(xiàn)上調(diào)，而后逐步回落。成骨刺激作用較強的因子，如PTH，更易使Foxc2 在刺激的早期即出現(xiàn)上調(diào)。后續(xù)體外研究，通過設(shè)計慢病毒及siRNA 改變Foxc2 在MC3T3?E1 細胞中的表達水平，從而檢測Foxc2 對細胞增殖活性、凋亡、周期以及分化能力的影響。穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中，F(xiàn)oxc2 抑制MC3T3?E1 細胞的增殖活性，增加了G1 期細胞比例。G1 期細胞主要是增加質(zhì)量且為后續(xù)的DNA 復(fù)制做好準備，F(xiàn)oxc 過表達使得細胞阻滯在G1 期，無法進行后續(xù)S 期及G2 期的DNA 復(fù)制加倍，導(dǎo)致細胞增殖活性降低。在分化能力的觀察中，首先成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2 的表達水平在MC3T3?E1Foxc2＋組出現(xiàn)明顯上調(diào)，第7 天進行堿性磷酸酶染色，MC3T3?E1Foxc2＋組ALP 染色較深，光學顯微鏡下著色細胞較多。第21 天，茜素紅染色實驗中，兩組均成功觀察到鈣結(jié)節(jié)，此時兩組無明顯差異。siRNA 干擾實驗結(jié)果同樣驗證了Foxc2 對MC3T3?E1 細胞體外骨向分化的影響。第一部分實驗中，我們觀測到Foxc2 的上調(diào)都出現(xiàn)在骨向誘導(dǎo)的早期，而后表達下調(diào)，逐漸回落甚至低于基線水平，提示Foxc2 在細胞成骨分化過程中仍受到其他負性因子的調(diào)控，故在培養(yǎng)第21 天，即成骨后期的茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)實驗中，兩組細胞無明顯差異。收集成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)3天的MC3T3?E1Foxc2＋細胞及MC3T3?E1EGFP細胞樣品，通過基因芯片進一步分析篩選下游靶基因，結(jié)果兩組差異表達的基因共計1 234 條，其中上調(diào)950 條基因，下調(diào)基因284 條。將差異表達的基因?qū)霐?shù)據(jù)庫進行GO 分析和KEGG 通路分析，25%的差異基因參與了細胞因子間的受體相互作用，17%的差異基因參與了趨化因子信號通路，同樣有17%的差異基因參與了細胞黏附分子通路（CAMs）。查閱文獻，結(jié)合芯片結(jié)果，初步選取數(shù)個差異基因，如MMP家族、EREG 等。MMP 家族已經(jīng)被證實在骨骼的發(fā)育中起著重要作用［21］，主要參與軟骨細胞的增殖分化、成骨細胞及破骨細胞的募集、骨形成與改建等進程，MMP 功能的轉(zhuǎn)變同樣會影響骨質(zhì)的形成。研究表明，EREG 可以與ERER 受體結(jié)合形成二聚體，通過激活A(yù)KT－ mTOR 通路及MAPK 通路促進MC3T3?E1 細胞骨向分化［22］。關(guān)于MMP9、MMP13及EREG 基因的實時定量PCR 結(jié)果也初步驗證了基因芯片結(jié)果，為后續(xù)的研究提供了方向。

綜上所述，本研究探討了Foxc2 基因?qū)C3T3－E1 細胞體外骨向分化的影響，初步證明Foxc2 基因負向調(diào)控MC3T3?E1 細胞增殖活性，同時正向促進Runx2 表達并促進細胞體外骨向分化。本課題利用基因芯片進行篩選，查閱文獻并結(jié)合數(shù)據(jù)分析，通過實時定量PCR 初步驗證了數(shù)個差異基因，如Mmp9、Ereg 等，后續(xù)研究將在此基礎(chǔ)上繼續(xù)展開，明確其下游機制。